專利名稱：使用熒光化抗體的熒光分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用與抗體結(jié)合后從非熒光性轉(zhuǎn)為熒光性的色素的熒光分析方法。
背景技術(shù)：
對于學(xué)術(shù)研究或疾病的診斷、治療而言，分析生物體內(nèi)的生物體成份或各種化學(xué)物質(zhì)(醫(yī)藥品、環(huán)境污染物等)是非常重要的。但是，用于分析這些物質(zhì)的通常的現(xiàn)有方法需要復(fù)雜的、很花時間的用于采取體液、摘除組織或除去夾雜物的前處理，所以人們一直期望開發(fā)出可簡便分析生物體內(nèi)物質(zhì)等的高靈敏度分析方法。
因此，作為使這類分析成為可能的方法之一，人們開發(fā)了使用熒光色素標(biāo)識抗體的免疫測定法(immunoassay及immuno-metric-assay)。即，利用該免疫測定法，根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的特異的分子識別功能，使高選擇性的分析成為可能，且即使不除去雜質(zhì)，也可通過熒光分析選擇性測量測定對象物。而熒光色素標(biāo)識抗體通常使用預(yù)先以熒光色素標(biāo)識過的抗體，根據(jù)抗原結(jié)合部位識別某一特定物(抗原)。另外，在日本特開平4-211363號公報中，揭示了具有兩個抗原結(jié)合部位，其一由組織(tissue)纖維蛋白溶酶原激活劑惹起、而另一個由熒光物質(zhì)等標(biāo)記引起的二重特異性雜交(hybrid)單克隆抗體。另外，在日本特開平9-5324號公報中，揭示了相對于將非熒光色素附加于免疫性物質(zhì)形成的抗原的抗體。另外，在日本特開平11-183477號公報中，還揭示了一種在胰島素的存在下測定基于胰島素及孔雀綠(MG)的結(jié)合物質(zhì)(MG標(biāo)識胰島素)與將該結(jié)合物質(zhì)作為抗原的抗MG-Ins抗體的抗原抗體反應(yīng)的熒光強度變化的熒光免疫測定方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)抗原抗體反應(yīng)是不可逆的，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是技術(shù)常識(例如《熒光免疫分析》宮孔潔等，講談社Scientificp.57-58(1985)；K.Ichihara et al.，Clinica Chimica Acta Vol.98，p.87～100(1979)；等)，在現(xiàn)有的免疫測定法中，難以實時連續(xù)分析生物體內(nèi)物質(zhì)等的量的變化。
另外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)在日本特開平11-183477號公報所述的MG標(biāo)識胰島素與抗MG-Ins抗體的抗原抗體反應(yīng)時，在識別胰島素的部位(胰島素識別部位)，引起胰島素和MG標(biāo)識胰島素的競爭反應(yīng)，最終幾乎所有的MG標(biāo)識胰島素占據(jù)胰島素識別部位而達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，即，胰島素和MG標(biāo)識胰島素的競爭反應(yīng)是不可逆反應(yīng)；以及因此使用利用該抗原抗體反應(yīng)的免疫測定法難以實時連續(xù)分析生物體內(nèi)物質(zhì)等的量的變化。
本發(fā)明就是鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)所具有的問題而完成的發(fā)明，其目的是提供利用抗原抗體反應(yīng)可簡便、高靈敏度并能實時連續(xù)進(jìn)行分析(包括圖像)生物體內(nèi)物質(zhì)等的熒光分析方法。
本發(fā)明人為達(dá)成上述目的而深入研究后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)意想不到的是，在非熒光性色素單體及免疫性物質(zhì)單體的存在下，使用本發(fā)明的發(fā)明人已申請的日本特開平9-5324號公報所述的抗體——即相對于將免疫物質(zhì)附加在非熒光性色素而形成的抗原的抗體——的抗原抗體反應(yīng)是可逆的，另外還發(fā)現(xiàn)通過利用可逆的抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行熒光分析，達(dá)成了上述目的，從而實現(xiàn)了本發(fā)明。
即，本發(fā)明涉及一種熒光分析方法，其特征在于，包括得到抗體色素溶液與含有測定對象物質(zhì)的被檢測體溶液的混合溶液的混合工序，上述抗體色素溶液含有各自具有預(yù)定濃度的抗體和色素，上述抗體的抗原結(jié)合部位的一部分識別色素，其余的一部分識別測定對象物質(zhì)，上述色素被上述抗體識別，且與上述抗體結(jié)合時由非熒光性轉(zhuǎn)為熒光性；用勵起光照射上述混合溶液，測定由上述混合溶液發(fā)出的熒光的強度，得到測定值的測定工序；以及基于預(yù)先求得的熒光強度和測定對象物質(zhì)濃度的關(guān)系，由上述測定值求得上述測定對象物質(zhì)的濃度的計算工序。
在本發(fā)明的熒光分析方法中，在上述抗體色素溶液和上述被測體溶液的混合溶液中，上述色素和上述測定對象物質(zhì)通過抗原抗體反應(yīng)分別與上述抗體結(jié)合，與抗體結(jié)合的色素由非熒光性轉(zhuǎn)為熒光性。此時，由于色素與抗體的結(jié)合受到共存的測定對象物質(zhì)的量的影響，所以由與抗體結(jié)合的色素發(fā)出的熒光的強度隨著共存的測定對象物質(zhì)的量而被阻礙或被增強。因此，在一定的溶液中，色素和抗體的量與熒光強度和測定對象物質(zhì)濃度相關(guān)，根據(jù)該關(guān)系(檢量線)，由熒光強度的實際測定值求得測定對象物質(zhì)的濃度。因此，在本發(fā)明的熒光分析方法中，可通過抗原抗體反應(yīng)的特異的分子識別機能進(jìn)行選擇性高的高靈敏度分析，且即使不除去夾雜物，利用不易受夾雜物影響的熒光分析也可有選擇地簡便測量測定對象物質(zhì)。于是，本發(fā)明的抗原抗體反應(yīng)，即識別上述抗體中的上述色素的部分和上述色素的結(jié)合反應(yīng)，以及識別上述抗體中的上述測定對象物質(zhì)的部分和上述測定對象物質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)，與抗原抗體反應(yīng)是不可逆的這一現(xiàn)有技術(shù)常識相反，是可逆的，上述抗體中的上述色素和識別上述測定對象物質(zhì)的部分被上述色素、上述測定對象物質(zhì)等占據(jù)，而未達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，所以，利用與測定對象物質(zhì)量的變動相應(yīng)地改變熒光強度，而能實時連續(xù)地進(jìn)行分析(包括圖像)。
因此，在本發(fā)明的熒光分析方法中，在上述計算工序后，還可包括另將被測體溶液添加到上述混合溶液中混合，實行上述測定工序和上述計算工序，反復(fù)求得測定對象物質(zhì)的濃度的連續(xù)分析工序。由于包括該連續(xù)分析工序，所以可實時連續(xù)分析測定對象物質(zhì)的濃度。
另外，上述計算工序優(yōu)選包括根據(jù)隨著上述被測體溶液的添加的體積變化修正上述測定值，得到熒光強度修正值的工序；根據(jù)預(yù)先求得的熒光強度修正值和混合溶液中的測定對象物質(zhì)濃度的關(guān)系，由上述熒光強度修正值求得上述混合溶液中的測定對象物質(zhì)的濃度的工序；由上述混合溶液中的測定對象物質(zhì)濃度求得上述被測體溶液中的測定對象物質(zhì)的濃度的工序。通過包括上述工序，即使在忽略伴隨著被測體溶液的添加的混合溶液中的色素和抗體的濃度變化的情況下，也可修正為沒有這樣的濃度變化的狀態(tài)，充分防止了分析精度的降低。
而且，本發(fā)明的熒光分析方法還可以包括得到抗體色素溶液和含有預(yù)定濃度的測定對象物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的混合溶液的混合工序，上述抗體色素溶液含有各自具有預(yù)定濃度的抗體和色素，上述抗體的抗原結(jié)合部位的一部分識別色素，其余的一部分識別測定對象物質(zhì)，上述色素被上述抗體識別，且與上述抗體結(jié)合時由非熒光性轉(zhuǎn)為熒光性；用勵起光照射上述混合溶液，測定由上述混合溶液發(fā)出的熒光的強度，得到測定值的測定工序；將標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到上述混合溶液中混合，然后實行上述測定工序，反復(fù)求得熒光強度的測定值的連續(xù)測定工序；以及根據(jù)上述測定工序和上述連續(xù)測定工序中所得到的測定值和上述測定對象物質(zhì)的添加量求得熒光強度和測定對象物質(zhì)濃度的關(guān)系，制作檢量線的工序。通過包括這樣的工序，可高效率地得到熒光強度和測定對象物質(zhì)濃度的關(guān)系，即檢量線。
另外，上述檢量線制作工序優(yōu)選包括根據(jù)隨著添加上述標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積變化修正上述測定值，得到熒光強度修正值的工序；算出上述混合溶液中的測定對象物質(zhì)的濃度的工序；求得上述熒光強度修正值和上述混合溶液中的測定對象物質(zhì)濃度的關(guān)系的工序。通過包括上述工序，即使在忽略伴隨著被測體溶液的添加的混合溶液中的色素和抗體的濃度變化的情況下，也可修正為沒有這樣的濃度變化的狀態(tài)，充分防止了檢量線的精度的降低。
另外，本發(fā)明的上述色素優(yōu)選為具有三苯甲烷結(jié)構(gòu)的色素或具有二苯甲烷結(jié)構(gòu)的色素，更優(yōu)選為孔雀綠或金胺O(槐黃)。
另外，本發(fā)明的上述抗體優(yōu)選為(i)以上述色素和上述測定對象物質(zhì)的結(jié)合物質(zhì)為抗原形成的抗體，或(ii)將利用抗體識別且在與上述抗體結(jié)合時由非熒光性轉(zhuǎn)為熒光性所必要的結(jié)構(gòu)與上述色素共通的色素與上述測定對象物質(zhì)的結(jié)合物質(zhì)用作抗原而形成的抗體，這樣的抗體和色素的組合更優(yōu)選為(i)上述抗體為將孔雀綠和上述測定對象物質(zhì)的結(jié)合物質(zhì)作為抗原而形成的抗體，上述色素是孔雀綠的組合，或(ii)上述抗體是將孔雀綠和上述測定對象物質(zhì)的結(jié)合物質(zhì)作為抗原而形成的抗體，上述色素是金胺O。
另外，利用本發(fā)明的熒光分析方法的上述測定對象物質(zhì)優(yōu)選為選自應(yīng)成為免疫測定對象的蛋白質(zhì)、荷爾蒙、維生素、菌體、環(huán)境污染物質(zhì)、醫(yī)藥品。


圖1為作為抗原的MG-測定對象物質(zhì)復(fù)合體的示意圖。
圖2為抗原識別部位識別MG和測定對象物質(zhì)兩者的狀態(tài)示意圖。
圖3為MG和抗體的抗原抗體反應(yīng)的示意圖。
圖4為測定對象物質(zhì)和抗體的抗原抗體反應(yīng)的示意圖。
圖5為抗體、MG和測定對象物質(zhì)三者的抗原抗體反應(yīng)示意圖。
圖6A及圖6B分別為測定對象物質(zhì)對抗體-MG間的抗原抗體反應(yīng)的影響的示意圖。
圖7為MG-抗體半衰期長于測定對象物質(zhì)-抗體的示意圖。
圖8為本發(fā)明的檢量線的制作方法的優(yōu)選實施方式的流程圖。
圖9為本發(fā)明的熒光分析方法的優(yōu)選實施方式的流程圖。
圖10為抗MG-Ins血清的抗體值的曲線圖。
圖11為抗MG-Ins Fab和MG反應(yīng)后的MG熒光光譜圖。
圖12為MG濃度和MG熒光強度的關(guān)系曲線圖。
圖13為胰島素濃度和MG熒光強度的關(guān)系(檢量線)曲線圖。
圖14為抗MG-Ins IgG和AO反應(yīng)后的AO熒光光譜圖。
圖15為胰島素濃度和AO熒光強度的關(guān)系(檢量線)曲線圖。
圖16為反復(fù)添加胰島素和抗胰島素IgG后的AO熒光強度變化曲線圖。
具體實施例方式
下面，參照附圖詳細(xì)說明本發(fā)明的熒光分析方法的優(yōu)選實施方式。另外，在附圖中，對相同或相當(dāng)?shù)牟糠謽?biāo)柱相同符號。
色素本發(fā)明所用的色素?zé)o特別限制，只要是在水等通常溶劑中為非熒光性，當(dāng)與后述抗體結(jié)合時轉(zhuǎn)為熒光性的物質(zhì)即可。另外，本發(fā)明中的非熒光性是指實質(zhì)上為非熒光性，在通常的測定條件下顯示不出熒光光譜或僅顯示出極弱的熒光，優(yōu)選為實質(zhì)上利用市售裝置等不能進(jìn)行熒光分析(熒光分光分析)的色素(西川泰治等《熒光磷光分析法》、共立出版社，30頁，1984年)。該實質(zhì)上顯示不出熒光性的色素優(yōu)選為熒光量子收率在特定條件下小于1％的色素，更優(yōu)選為熒光量子收率在特定條件下為0.01％以下的色素。
另外，在本發(fā)明中，“當(dāng)色素與抗體結(jié)合時由非熒光性轉(zhuǎn)為熒光性”是指當(dāng)實質(zhì)上非熒光性的色素與抗體結(jié)合時變成熒光性(熒光性增高)，通過得到用通常熒光分析所得靈敏度之上的分析靈敏度，使熒光分析成為可能，優(yōu)選為從色素的熒光量子收率在通常的測定條件下為極小的狀態(tài)(例如0.01％以下)，利用本發(fā)明的處理而與抗體結(jié)合(相互作用)，變化到熒光量子收率大的狀態(tài)(例如1％以上)。
在本發(fā)明中，色素從非熒光性轉(zhuǎn)為熒光性時的熒光強度的增加優(yōu)選為熒光量子收率至少增加10倍以上，更優(yōu)選為至少增加100倍以上，特別優(yōu)選為至少增加1000倍以上。
另外，本發(fā)明中可用的色素不一定必須在可見光區(qū)域有吸收(在350nm以上有極大吸收)，也可以是紫外區(qū)域有吸收(在350nm以下具有極大吸收)或吸收帶延及可見光區(qū)域的色素。
可用在本發(fā)明中的色素的分子結(jié)構(gòu)無特別限制，可使用含有各種發(fā)色團(chromophore)的色素，優(yōu)選使用pH值在中性附近含有穩(wěn)定的發(fā)色團的色素。
這樣的色素優(yōu)選為例如分子結(jié)構(gòu)中具有三苯甲烷骨架的色素(例如參照講談社Scientific社，大河原信編《色素手冊》)，這樣的三苯甲烷系色素特別優(yōu)選為具有下述化學(xué)結(jié)構(gòu)的孔雀綠(MG)。
另外，這樣的色素還優(yōu)選為例如分子結(jié)構(gòu)中具有二苯甲烷骨架的色素(例如參照講談社Scientific社，大河原信編《色素手冊》)，這樣的二苯甲烷系色素特別優(yōu)選為具有下述化學(xué)結(jié)構(gòu)的金胺O(AO)。

當(dāng)使用這樣的孔雀綠或金胺O時，可得到約1000倍以上的熒光量子收率的增加。另外，除這些色素外，還可優(yōu)選利用CCVJ(9-(二氰乙烯基)久洛尼定)系色素、ANS(苯胺基萘)系色素、TNS(對甲苯胺基萘)系色素、DNP(2，4-二硝基苯)系色素。
另外，孔雀綠在水溶液中基本上無熒光，當(dāng)與抗MG抗體結(jié)合后變成熒光性。本發(fā)明人推測，這是因為孔雀綠的分子內(nèi)運動因抗體而受到抑制，結(jié)果孔雀綠在吸收勵起光后與在水溶液中時相比，在分子內(nèi)運動的熱過程(＝非輻射過程)中回到基態(tài)的概率相對減少，在輻射過程中失去活性的概率(＝發(fā)出熒光)相對增加。這一推論適于具有同樣化學(xué)結(jié)構(gòu)或同樣失活過程的所有色素(二苯甲烷系色素、三苯甲烷系色素)。此外，還可從其它方面了解到機理不同但也是利用抗體顯著增強熒光強度的色素(Tomomichi Iwaki et al.，Biochemistry 1993，Vol.32，p.7589-7592；蛋白核酸酶另冊《熒光測定原理及其在生物體系中的應(yīng)用》小野寺昌彥(金岡佑一等編集)共立出版，1974年，p.189-197)。
測定對象物質(zhì)可適用于本發(fā)明的熒光分析方法的測定對象物質(zhì)無特別限制，只要是與上述色素結(jié)合的物質(zhì)(復(fù)合體)能起到抗原的功能的物質(zhì)即可。另外，本發(fā)明的測定對象物質(zhì)本身不一定必須是免疫性物質(zhì)。即，通常，相對于免疫耐受性-低抗原性物質(zhì)得不到抗體，但在本發(fā)明中，因為使用人工化合物的色素與測定對象物質(zhì)結(jié)合的復(fù)合體作為抗原而得到抗體，所以，即使測定對象物質(zhì)本身是免疫耐受性-低抗原性物質(zhì)，與色素的復(fù)合體成為免疫性的可能性很高，可通過后述方法得到抗體。
因此，在本發(fā)明的熒光分析方法中，除無機離子或有機離子之外的廣泛物質(zhì)可適用為測定對象物質(zhì)，其中優(yōu)選為選自應(yīng)成為免疫測定對象的蛋白質(zhì)(胰島素等)、激素、維生素、菌體、環(huán)境污染物質(zhì)及醫(yī)藥品的物質(zhì)作為測定對象物質(zhì)。
另外，只要測定對象物質(zhì)本身在成為抗原時具有足夠大的分子量(通常約為5000以上)，則所有這樣的測定對象物質(zhì)均可調(diào)制后述抗體。即，即使測定對象物質(zhì)對免疫的動物而言是免疫耐受性物質(zhì)(是該動物品種的生物體內(nèi)成份的情況等)，也可調(diào)制后述抗體。這是因為本發(fā)明的抗原不是測定對象物質(zhì)本身，而且是交聯(lián)人工制品色素的人工制品。
另外，即使測定對象物質(zhì)本身在成為抗原時不具備足夠的分子量，也可調(diào)制再通過共價鍵與相對于色素和測定對象物質(zhì)的復(fù)合體具備抗原性的擔(dān)體交聯(lián)的物質(zhì)，將該物質(zhì)用作抗原。在該情況下，也得到了抗原識別部位形成識別色素和測定對象物質(zhì)兩者的形態(tài)的下述抗體。
抗體本發(fā)明所用的抗體是其抗原結(jié)合部位的一部分識別色素且余下的部分識別測定對象物質(zhì)的抗體。即，本發(fā)明的抗體的一個抗原結(jié)合部位在空間上被分解為多個部分，其中的一部分識別色素，而余下的部分識別測定對象物質(zhì)。這樣的一個抗原結(jié)合部位具有多個不同機能的技術(shù)是現(xiàn)有技術(shù)中不存在的、而由本發(fā)明人初次發(fā)現(xiàn)的技術(shù)。
這樣的本發(fā)明的抗體優(yōu)選為以本發(fā)明的熒光分析方法中所用的色素和測定對象物質(zhì)的結(jié)合物質(zhì)為抗原而形成，例如在分析所用的色素是孔雀綠時，上述抗體優(yōu)選為將孔雀綠和測定對象物質(zhì)的結(jié)合物質(zhì)作為抗原而形成的抗體。
另外，分析中所用的色素不一定必須與用于得到抗體的色素相同，也可使用利用抗體識別且與抗體結(jié)合時由非熒光性轉(zhuǎn)為熒光性所必需的結(jié)構(gòu)兩者共通的色素。這樣的結(jié)構(gòu)共通的色素的組合可舉出孔雀綠和金胺O的組合。因此，例如當(dāng)分析中所用的色素是金胺O時，上述抗體可為孔雀綠和測定對象物質(zhì)的結(jié)合物質(zhì)作為抗原而形成的抗體。
色素和測定對象物質(zhì)的復(fù)合體(抗原)的制作本發(fā)明的上述色素和測定對象物質(zhì)的復(fù)合體(抗原)的制作方法無特別限制，例如可在規(guī)定時間攪拌混合上述測定對象物質(zhì)和色素，使用凝膠過濾色譜法分離色素和測定對象物質(zhì)的復(fù)合體的抗原組分。
而且，在需要時，可通過使用例如利用免疫反應(yīng)的精制手段精制所得到的抗原(川島紘一郎(譯)《免疫測定入門》，南山堂，第70頁，1987年)。另外，所得抗原的濃度可用例如Lowry法定量。
抗血清的制作本發(fā)明的上述抗體可以用下述免疫工序制作。
即，本發(fā)明的上述抗體可通過將上述復(fù)合體(抗原)投藥給免疫動物，然后從免疫動物身上采取血液，由該血液分離抗血清而制作。對服用上述復(fù)合體(抗原)的免疫動物無特別限制，可使用兔子、天竺鼠等。另外，可使用的免疫佐劑也無特別限制，例如可優(yōu)選使用通常的弗羅因德氏不完全佐劑、鋁佐劑等。且對可用的免疫注射法也無特別限制，例如，對于天竺鼠，可優(yōu)選使用皮下注射、腹腔內(nèi)注射等。另外，抗血清的產(chǎn)生確認(rèn)和采取如有需要可通過實施追加免疫，進(jìn)行試驗采取，研究抗體價來進(jìn)行。
對分離采取的抗血清的方法無特別限制，可用通常的方法，例如使采取的血液凝固后，利用離心分離來分離血清。對所得抗血清的上述復(fù)合體(抗原)有特異性的抗體活性可優(yōu)選用酶免疫反應(yīng)等測定(圖解《熒光抗體法——原理、技術(shù)及應(yīng)用》川生明著，p.135～138、SoftScience社(1983))。
IgG組分的制作在本發(fā)明中，可使用上述抗血清中的抗體，也可使用精制抗血清而得的IgG組分作為抗體。對由這樣的抗血清精制IgG組分的方法無特別限制，可優(yōu)選使用鹽析法、凝膠過濾法、離子交換色譜法等，特別是可優(yōu)選使用蛋白質(zhì)A法。還可利用離心法進(jìn)一步濃縮所得IgG組分，這樣可將IgG組分調(diào)至規(guī)定濃度。
抗原結(jié)合性片段(Fab)的制作在本發(fā)明中，更優(yōu)選將由上述IgG組分調(diào)制的抗原結(jié)合性片段(Fab)用作抗體。當(dāng)使用抗原結(jié)合性片段(Fab)時，有更可靠地防止生成與測定對象物質(zhì)與免疫復(fù)合體的沉淀的趨勢。對由這樣的IgG組分調(diào)制抗原結(jié)合性片段(Fab)的方法無特別限制，例如可使用消化酶(消化酶木瓜酶等)消化IgG組分，得到抗原結(jié)合性片段(Fab)。另外，優(yōu)選通過蛋白質(zhì)A法等免疫沉降法等精制所得抗原結(jié)合性片段(Fab)，也可進(jìn)一步通過離心法濃縮。這樣可將抗原結(jié)合性片段(Fab)調(diào)至預(yù)定濃度。
本發(fā)明的熒光分析方法的原理在本發(fā)明的熒光分析方法中，當(dāng)在溶液中混合上述抗體、色素和測定對象物質(zhì)時，通過色素和測定對象物質(zhì)分別與抗原抗體的反應(yīng)而與抗體結(jié)合，與抗體結(jié)合的色素由非熒光性轉(zhuǎn)為熒光性。此時，色素與抗體的結(jié)合受共存的測定對象物質(zhì)的量的影響，與抗體結(jié)合的色素發(fā)出的熒光強度根據(jù)共存的測定對象物質(zhì)的量而被阻礙或被增強。且與現(xiàn)有技術(shù)的抗原抗體反應(yīng)是不可逆的常識相反，本發(fā)明的抗原抗體反應(yīng)是可逆的，根據(jù)測定對象物質(zhì)的量的變動而改變熒光強度。本發(fā)明人推測，該本發(fā)明的熒光分析方法的原理如下所述。并以代表本發(fā)明所用的色素的使用孔雀綠(以下表示為MG)的情況為例進(jìn)行說明。
由于MG單獨用作抗原時分子量過小，所以在得到抗MG抗體時，將MG與分子量更大的物質(zhì)(擔(dān)體)以共價鍵交聯(lián)的化合物作為抗原投藥給動物。此時，當(dāng)選擇擔(dān)體作為測定對象物質(zhì)時，抗原通過MG和測定對象物質(zhì)的共價鍵而成為復(fù)合體(如圖1所示的MG-測定對象物質(zhì)復(fù)合體)。這樣所得的抗體(IgG等)中含有圖2所示的其抗原識別部位識別MG和測定對象物質(zhì)兩者的形態(tài)的物質(zhì)。
當(dāng)在溶液中混合該抗體和MG時，引起抗原抗體反應(yīng)，如圖3所示，MG與抗體的抗原結(jié)合部位(非共價鍵)結(jié)合。該鍵的離解速度常數(shù)為kd-MG。另一方面，與在溶液中混合測定對象物質(zhì)和該抗體時同樣，如圖4所示，測定對象物質(zhì)在抗體的抗原結(jié)合部位(非共價鍵)結(jié)合。該離解速度常數(shù)為kd-anal。但由于MG和測定對象物質(zhì)都僅是抗原(即MG-測定對象物質(zhì)復(fù)合體)的一部分，所以發(fā)明人推測MG單獨和抗體的結(jié)合(以下稱為“MG-抗體結(jié)合”)、測定對象物質(zhì)單獨和抗體的結(jié)合(“以下稱為“測定對象物質(zhì)-抗體結(jié)合”)都比最初的抗原MG-測定對象物質(zhì)復(fù)合體和抗體的結(jié)合弱。即，當(dāng)MG-測定對象物質(zhì)復(fù)合體和抗體的結(jié)合的離解速度常數(shù)為kd-Ag時，離解速度常數(shù)小的一方難以離解，即，因為結(jié)合強，所以各離解速度常數(shù)的關(guān)系為kd-Ag＜kd-MGkd-Ag＜kd-anal接著，在混合該抗體、MG及測定對象物質(zhì)三者后，如圖5所示，MG和測定對象物質(zhì)都與抗體的抗原結(jié)合部位結(jié)合。而當(dāng)MG和測定對象物質(zhì)二者容納于抗原結(jié)合部位時，因為與MG-測定對象物質(zhì)復(fù)合體結(jié)合于抗體的圖2所示狀態(tài)接近，所以發(fā)明人推測最為穩(wěn)定。但此時，測定對象物質(zhì)有可能對MG-抗體結(jié)合造成影響，MG也有可能對測定對象物質(zhì)-抗體結(jié)合造成影響。所以發(fā)明人推測其反應(yīng)速度論由MG和測定對象物質(zhì)各自在抗原結(jié)合部位內(nèi)所占位置(哪個更靠內(nèi))和各自的離解速度常數(shù)決定。例如，當(dāng)MG結(jié)合于比測定對象物質(zhì)更靠近內(nèi)部的位置時，在測定對象物質(zhì)先與抗體結(jié)合時，如圖6A所示，MG的結(jié)合受到阻礙，另一方面，如果MG先結(jié)合，如圖6B所示，通過此后的測定對象物質(zhì)的結(jié)合，MG的結(jié)合與MG單獨的情況相比，穩(wěn)定化進(jìn)一步增強。這種增強與MG-抗體結(jié)合的kd-MG表觀上的減小一致。即，當(dāng)該表觀離解速度常數(shù)為kd-MG′時，kd-MG′＜kd-MG。于是，當(dāng)kd-MG、kd-anal程度相同，就推測該阻礙和增強發(fā)生很大差別。
但當(dāng)兩者不同時，阻礙和增強有一方占優(yōu)勢。通?？乖贵w復(fù)合體的半衰期t1/2用t1/2＝0.693/kd求得。即，kd小的一方半衰期長。因此，在kd-MG＜kd-anal時，如圖7所示，MG-抗體結(jié)合的半衰期變得更長。則即使發(fā)生圖6A所示的阻礙，測定對象物質(zhì)也在較短時間內(nèi)從抗體離解，然后MG結(jié)合，以更長的半衰期繼續(xù)形成MG-抗體結(jié)合。于是，測定對象物質(zhì)可與該位置結(jié)合，引起其結(jié)果增強(成為kd-MG′＜kd-MG)。而當(dāng)kd-anal＜kd-MG(MG的一方離解快)時，即使MG結(jié)合，在測定對象物質(zhì)結(jié)合并受到增強以前也會從抗體上離解，所以難以引起增強而由阻礙支配。
本發(fā)明人推測實際上kd-MG和kd-anal的大小關(guān)系隨所得抗體而各不相同，單克隆抗體時為各抗體克隆，多克隆抗體時為所含的各單克隆抗體的總體發(fā)生阻礙、增強的任一方面。
本發(fā)明利用的就是該現(xiàn)象。即，當(dāng)注目于MG-抗體結(jié)合時，在MG和抗體保持在一定量的情況下，阻礙或增強的程度依賴于共存的測定對象物質(zhì)的量，這表現(xiàn)在MG的熒光強度的變化上。因此，通過測定MG的熒光強度變化，可檢測、定量測定對象物質(zhì)。
于是，本發(fā)明的上述抗原抗體反應(yīng)與現(xiàn)有技術(shù)的抗原抗體反應(yīng)是不可逆的常識相反，是可逆的。因此，根據(jù)測定對象物質(zhì)的量的變動而變動MG的熒光強度，通過測定其熒光強度變化，可實時連續(xù)分析測定對象物質(zhì)。
檢量線的制作本發(fā)明的熒光分析方法優(yōu)選為在實際試料測定以前，預(yù)先求得表示熒光強度和測定對象物質(zhì)的關(guān)系的檢量線。根據(jù)圖8所示的流程圖詳細(xì)說明本發(fā)明的檢量線的制作方法的優(yōu)選實施方式。
在圖8所示的流程圖中，首先，調(diào)制分別以規(guī)定濃度(抗體濃度YμM、色素濃度ZμM)含有抗原結(jié)合部位的一部分識別色素且余下的一部分識別測定對象物質(zhì)的上述抗體和與抗體結(jié)合時由非熒光性轉(zhuǎn)為熒光性的上述色素的抗體色素溶液Aml(S101)。另外，所用溶劑無特別限制，優(yōu)選為pH為中性附近，優(yōu)選為pH6.5～7.5的緩沖液，這樣的溶劑可舉出例如磷酸緩沖生理鹽水。
然后將該抗體色素溶液加入熒光測定用容器，設(shè)置(set)在根據(jù)使用的色素等分別設(shè)定勵起光波長及熒光波長為規(guī)定值的熒光分光光度計中。這時，設(shè)定次數(shù)n的初值為n＝1(S102)。另外，優(yōu)選保持吸收池座(cell holder)的溫度為一定溫度，保持溫度優(yōu)選為在25～37℃范圍內(nèi)的溫度。另外，優(yōu)選以規(guī)定時間攪拌容器中的溶液。
再將含有規(guī)定濃度(XμM)測定對象物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液Bnml添加到容器中的溶液中，攪拌所得混合溶液規(guī)定時間，進(jìn)行色素及測定對象物質(zhì)和抗體的抗原抗體反應(yīng)(S103，混合工序)。另外，標(biāo)準(zhǔn)溶液中所用的溶劑無特別限制，與抗體色素溶液中所用的溶劑一樣，優(yōu)選為pH為中性附近的緩沖液(例如磷酸緩沖生理鹽水)。
接著，用具有規(guī)定勵起光波長的勵起光照射容器中的混合溶液，測定由該混合溶液發(fā)出的具有規(guī)定熒光波長的熒光的強度，取得測定值In(S104，測定工序)。另外，對勵起光的照射及熒光強度的具體測定方法無特別限制，熒光強度測定值In優(yōu)選為取得規(guī)定測定時間中的熒光強度的平均值或積分值。另外，還可將未添加測定對象物質(zhì)的狀態(tài)下的熒光強度作為空白值，將實際熒光強度測定值減去空白值的值作為熒光強度的測定值In(且此時，相對于實際測定值，在實施根據(jù)隨著添加標(biāo)準(zhǔn)溶液等的體積變化的修正后，減去空白值)。
然后根據(jù)隨著添加上述標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積變化修正如上所述得到的熒光強度測定值In，算出與抗體濃度為YμM且色素濃度為ZμM的溶液中的熒光強度相當(dāng)?shù)臒晒鈴姸刃拚礗n′(S105)。另外，修正熒光強度的體積變化時的計算式為下式(1)In′=In×{(A+Σn-1nBn)/A}---(1)]]>當(dāng)次數(shù)n＝1時，為I1′＝I1×{(A+B1)/A} (1)′
另外，算出測定熒光強度后的混合溶液中的測定對象物質(zhì)的濃度Xn′μM(S106)。另外，計算混合溶液中的測定對象物質(zhì)濃度時的計算式為下式(2)Xn′=X×{Σn-1nBn/(A+Σn-1nBn)}---(2)]]>當(dāng)次數(shù)n＝1時，為X1′＝X×{B1/(A+B1)}(2)′這樣得到次數(shù)n＝1時的熒光強度修正值In′及測定對象物質(zhì)濃度Xn′后，次數(shù)n加1(S108)，再進(jìn)行上述標(biāo)準(zhǔn)溶液Bnml的添加混合(S103)、熒光強度測定值In的取得(S104)、熒光強度修正值In′的計算(S105)及測定對象物質(zhì)濃度Xn′的計算(S106)，得到次數(shù)n＝2時的熒光強度修正值In′及測定對象物質(zhì)Xn′。另外，次數(shù)n＝2時，上述式(1)變?yōu)镮2′＝I2×{(A+B1+B2)/A} (1)″當(dāng)次數(shù)n＝2時，為X2′＝X×{(B1+B2)/(A+B1+B2)}(2)″反復(fù)進(jìn)行S108→S103→S104→S105→S106→S107(連續(xù)測定工序)，至這樣得到的熒光強度修正值In′即使添加標(biāo)準(zhǔn)溶液也無變化為止，即(In′-In-1′)的值為設(shè)定值(例如零)以下(S107)為止，分別得到次數(shù)n從1～n時的熒光強度修正值In′及測定對象物質(zhì)濃度Xn′。
然后根據(jù)這樣得到的次數(shù)n從1～n時的熒光強度修正值In′及測定對象物質(zhì)濃度Xn′，制作表示熒光強度修正值In′及測定對象物質(zhì)濃度Xn′的關(guān)系的檢量線(S109，檢量線制作工序)。另外，對將這些數(shù)值繪成檢量線的具體方式無特別限制，適當(dāng)利用最小二乘法等公知方法可得到精度更高的檢量線。
實際試料的測定根據(jù)圖9所示的流程圖詳細(xì)說明本發(fā)明的熒光分析方法的優(yōu)選實施方式。
在圖9所示的流程圖中，首先，與制作檢量線時一樣，調(diào)制分別以規(guī)定濃度(抗體濃度YμM、色素濃度ZμM)含有抗原結(jié)合部位的一部分識別色素且余下的一部分識別測定對象物質(zhì)的上述抗體和與抗體結(jié)合時由非熒光性轉(zhuǎn)為熒光性的上述色素的抗體色素溶液Aml(S201)。另外，所用溶劑無特別限制，與制作檢量線時所用的溶劑一樣，優(yōu)選為pH為中性附近的緩沖液，例如磷酸緩沖生理鹽水。另外，抗體色素溶液中的抗體濃度及色素濃度與制作檢量線時一樣，分別為YμM、ZμM。
然后將該抗體色素溶液加入熒光測定用容器，與制作檢量線時一樣，設(shè)置在分別將勵起光波長及熒光波長設(shè)定為規(guī)定值的熒光分光光度計中。這時，設(shè)定次數(shù)n的初值為n＝1(S202)。另外，優(yōu)選保持吸收池座的溫度與制作檢量線時同樣的溫度，保持溫度優(yōu)選為在25～37℃范圍內(nèi)的溫度。另外，優(yōu)選以規(guī)定時間攪拌容器中的溶液。
再將被測體溶液Bnml添加到容器中的溶液中，攪拌所得混合溶液規(guī)定時間，進(jìn)行色素及測定對象物質(zhì)和抗體的抗原抗體反應(yīng)(S203，混合工序)。另外，被測體溶液也可直接使用作為測定對象的體液等，也可為用溶劑稀釋到規(guī)定倍的溶液。該稀釋中所用溶劑無特別限制，與抗體色素溶液中所用的溶劑一樣，優(yōu)選為pH為中性附近的緩沖液，例如磷酸緩沖生理鹽水。
接著，用具有規(guī)定勵起光波長的勵起光照射容器中的混合溶液，測定由該混合溶液發(fā)出的具有規(guī)定熒光波長的熒光的強度，取得測定值In(S204，測定工序)。另外，對勵起光的照射及熒光強度的具體測定方法無特別限制，與制作檢量線時一樣，熒光強度測定值In優(yōu)選為取得規(guī)定測定時間中的熒光強度的平均值或積分值。
然后根據(jù)隨著添加上述標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積變化修正如上所述得到的熒光強度測定值In，算出與抗體濃度為YμM且色素濃度為ZμM的溶液中的熒光強度相當(dāng)?shù)臒晒鈴姸刃拚礗n′(S205)。另外，修正熒光強度的體積變化時的計算式為下式(3)In′=In×{(A+Σn=1nBn)/A}---(3)]]>當(dāng)次數(shù)n＝1時，為I1′＝I1×{(A+B1)/A} (3)′然后根據(jù)表示預(yù)先求得的熒光強度修正值In′和測定對象物質(zhì)濃度Xn′的關(guān)系的檢量線，由熒光強度修正值In′求出混合溶液中的測定對象物質(zhì)的濃度Xn′μM(S206)。
于是，可由這樣求得的混合溶液中的測定對象物質(zhì)的濃度Xn′算出上述被測體溶液Bnml中的測定對象物質(zhì)的濃度XnμM(S207)。另外，計算被測體溶液中的測定對象物質(zhì)濃度時的計算式為下式(4)Xn={Xn′×A+Σn=1nBn)-Σn=1n-1XnBn}/Bn---(4)]]>當(dāng)次數(shù)n＝1時，為X1＝{X1′×(A+B1)}/B1(4)′另外，在本實施方式中，上述熒光強度修正值In′的計算(S205)、混合溶液中的測定對象物質(zhì)濃度Xn′的計算(S206)及被測體溶液中的測定對象物質(zhì)的濃度Xn的計算(S207)相當(dāng)于本發(fā)明的計算工序。
這樣就可測定被測體溶液中的測定對象物質(zhì)濃度Xn，由于如上所述，本發(fā)明的抗原抗體反應(yīng)是可逆的，所以使如下所述地連續(xù)測定其它被測體溶液成為可能。即，當(dāng)需要測定其它被測體溶液時(S208)，次數(shù)n加1(S209)，再進(jìn)行上述標(biāo)準(zhǔn)溶液Bnml的添加混合(S203)、熒光強度測定值In的取得(S204)、熒光強度修正值In′的計算(S205)、混合溶液中的測定對象物質(zhì)濃度Xn′的計算(S206)及被測體溶液中的測定對象物質(zhì)的濃度Xn的計算(S207)，就可測定第二次(次數(shù)n＝2)的被測體溶液中的測定對象物質(zhì)濃度Xn。另外，次數(shù)n＝2時，上述式(3)變?yōu)镮2′＝I2×{(A+B1+B2)/A} (3)″上述式(4)變成X2＝{X2′×(A+B1+B2)-(X1×B1)}/B2(4)″然后反復(fù)進(jìn)行上述S209→S203→S204→S205→S206→S207→S208(連續(xù)分析工序)，至無需測定其它被測體溶液(S208)為止，就可連續(xù)測定多個(次數(shù)n為1～n)被測體溶液中的測定對象物質(zhì)濃度Xn。另外，這樣的測定對象物質(zhì)濃度的連續(xù)測定可反復(fù)進(jìn)行，直至抗體相對于測定對象物質(zhì)飽和等即使添加被測體溶液熒光強度也不再變化的程度。
由于在上述本實施方式的熒光分析方法中利用抗原抗體反應(yīng)，所以可通過特異的分子識別機能進(jìn)行高選擇性的高靈敏度分析，且通過熒光分析，即使不除去夾雜物也可有選擇地簡便測量測定對象物質(zhì)。而且，因為本發(fā)明的抗原抗體反應(yīng)與現(xiàn)有技術(shù)的抗原抗體反應(yīng)是不可逆的常識相反，是可逆的，所以利用對應(yīng)于測定對象物質(zhì)的量的變動改變熒光強度(增強或阻礙)，就可進(jìn)行實時連續(xù)分析。
實施例下面，根據(jù)實施例更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于這些實施例，在不脫離本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思的范圍內(nèi)，可進(jìn)行各種變更。
實施例1使用抗MG-Ins抗體的Fab和MG的胰島素的定量(1-1)試藥及實驗動物實施例所用的主要試藥及實驗動物如下?？兹妇G(MG，AldrichChemical Company，Inc.制)、孔雀綠異硫氰酸酯(MGITC，MolecularProbes Inc.制)、金胺O(AO，Aldrich Chemical Company，Inc.制)、二甲亞砜(DMSO，和光純藥工業(yè)(株)制)、胰島素(豬，和光純藥工業(yè)(株)制)、SDS(Sodium Dodecyl Sulfate，和光純藥工業(yè)(株)制)、抗豬胰島素抗體(免疫動物Guinea Pig，Sigma制)、天竺鼠(Crj；Hartley，雄性，三周，SPF，體重225～240g，日本Chars-River(株)制)、麻醉劑(NEMBUTAL Sodium Solution，50mg/ml，Dynabot(株)制)、RAS(Ribi Adjuvant System MPL+TDM+CWS Emulsion，R-730(RIBI Immuno Chem Research，Inc.制)、0.1M磷酸緩沖液(PB，pH7.0)、抗原涂敷用緩沖液(50mM碳酸鈉緩沖液，pH8.4(+)NaN3)、清洗用緩沖液(磷酸緩沖生理鹽水，pH7.2(+)0.05％Tween20)、阻擋用緩沖液(磷酸緩沖生理鹽水，pH7.2，0.5％Gelatin)，96孔微量滴定板(ELISATESTPLATEF-FORM 2X8 F-STRIPS BINDUNG，greiner制)、過氧化物酶標(biāo)識山羊抗天竺鼠IgG抗體(Peroxidase標(biāo)識Goat抗Guinea PigIgG抗體，ORGANON TEKNIKA CORPORATION Cappel ResearchProduct制)、試料前處理用筒(離心濃縮用MINICENT-30或ULTRACENT-30、東曹(株)制、分組分子量30000道爾頓)、顯色試藥套件(ABTS Peroxidase Substrate System，Kirkegaard & PerryLaboratories Inc.制)、固定化番木瓜蛋白酶(Sigma制)。
(1-2)使用儀器實施例所用的主要機器如下。讀卡機(BIO-RAD MODEL 3550MICROPLATE READER)、離心機(HITACHI SCR18B，日立制作所制)、離心機轉(zhuǎn)子(RPR-18-3，日立制作所制)、離心機(Labnet FORCE7，Labnet International Inc.制)、離心機(KOKUSAN MODEL H-103RS，國產(chǎn)離心機(株)制)、渦流攪拌機(AUTOMATIC MIXER S-100，TAITEC(株)制)、熒光分光光度計(Fluorolog，instruments S.A.Inc.制)、循環(huán)機(BU150P，YAMATO科學(xué)(株)制)，小轉(zhuǎn)子(孔內(nèi)盛榮堂制)、熒光測定用容器(孔內(nèi)盛榮堂制)、高速液體色譜儀(LaChrom系統(tǒng)接口D-7000，UV檢測器D-7400，泵D-7100，脫氣器D-7610、日立制作所制)。
(1-3)共通實驗法(蛋白質(zhì)試料的離心濃縮及蛋白定量的方法)含有蛋白質(zhì)的試料使用試料前處理用筒(ULTRACENT-30或MINISENT-30)和離心機(HITACHI SCR18B或Labnet Force7)，在3000xg下離心濃縮。溶劑取代也在離心濃縮時同時進(jìn)行。
另外，試料的蛋白質(zhì)濃度使用市售的試藥套件(BCA Protein AssayReagent Kit，PIERCE制)及標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(馬IgG標(biāo)準(zhǔn)液，濃度2mg/ml，ImmunoPure Horse IgG Standard，PIERCE制)，并用BCA法定量。即，將蛋白質(zhì)試料(根據(jù)需要用PB稀釋的物質(zhì))、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液稀釋系列(25～1500μg/ml)及PB(檢量級用空白試料)各25μl加入容量1.5ml的埃彭道夫管，向其中添加試藥套件的反應(yīng)液(根據(jù)BCA Protein Assay Reagent Kit Manual(Pierce制)調(diào)制必要量)500μl并攪拌，在37℃下加溫30～60分鐘。然后從各埃彭道夫管將300μl分注到96孔微量滴定板，用讀卡機測定595nm的吸光度。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液稀釋系列濃度-吸光度的關(guān)系制成的檢量線求得蛋白質(zhì)試料的蛋白濃度。
(1-4)抗原(MG-Ins復(fù)合體)的調(diào)制如下所述進(jìn)行抗原的孔雀綠(MG)和胰島素(Ins)的共有結(jié)合物(MG-Ins復(fù)合體)的調(diào)制和精制。即，將胰島素4.7mg及孔雀綠異硫氰酸酯(MGITC)0.6mg(溶于20μl的二甲亞砜)溶于2ml的0.1M碳酸鈉緩沖液(pH9.8)，用鋁輪給容器遮光，在4℃下攪拌一夜。在該反應(yīng)中，孔雀綠異硫氰酸酯與胰島素的氨基結(jié)合，得到MG-Ins復(fù)合體。然后，為除去未反應(yīng)成份，將所得反應(yīng)液供至經(jīng)0.1M磷酸鈉緩沖液(PB，pH7.0)平衡過的凝膠過濾柱(Econo-Pac 10DG，BIO-RAD制)，用4ml的PB使未反應(yīng)成份從柱中溶出，得到MG-Ins組分(約1.2mg/ml)。
(1-5)利用免疫調(diào)制抗血清將MG-Ins組分330μl和生理鹽水1.7ml添加到RAS的小藥瓶中，用渦流攪拌機劇烈攪拌，調(diào)制抗原和佐劑的乳液。
再用麻醉劑(NEMBUTAL)麻醉(投藥量15ml/kg)4只天竺鼠，將上述乳液在每只的頸部投藥0.5ml(皮下注射(0.1ml×4個位置)，在腹腔投藥0.1ml。在該初次免疫后，以一周的間隔，將等量的抗原和佐劑投藥三次，進(jìn)行追加免疫。
在最后的追加免疫一周后，將用醚麻醉的天竺鼠開腹，由腎大靜脈采全血。再將所得血液采集到10ml試管中，在孵卵器中加溫到37℃，使之形成血餅。然后用離心機(KOKUSAN MODEL H-103RS)進(jìn)行離心分離(3000rpm、4℃、10min)分離血餅，得到抗血清。
(1-6)抗體價的測定利用酶免疫測定法測定抗血清的抗體價。即，首先將抗原涂敷用緩沖液6.3ml添加到MG-Ins組分700μl中，分注到96孔微量滴定板的各孔中0.1ml，在4℃下靜置一夜，使抗原(MG-Ins復(fù)合體)吸附涂敷在板的各孔內(nèi)面。然后除去板內(nèi)的抗原溶液，將0.1ml的清洗用緩沖液添加至各孔，以清洗孔內(nèi)。進(jìn)行三次該清洗操作后，為防止非特異吸附，將阻擋用緩沖液0.1ml添加到各孔中，在4℃下靜置一夜。然后除去阻擋用緩沖液，再進(jìn)行三次利用清洗用緩沖液的清洗。
再用PB稀釋抗血清，調(diào)制稀釋系列(稀釋倍數(shù)500～32000倍)。再調(diào)制用PB稀釋5倍未投放抗原的天竺鼠的血清，作為對照。相對于該對照物的抗體價，該抗血清稀釋系列所顯示的抗體價實質(zhì)上相當(dāng)于100～6400倍稀釋的抗體價。將該抗血清稀釋系列及對照血清稀釋液各0.1ml添加到上述板的各孔中，在4℃下靜置一夜，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。
從這樣進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的上述板中除去抗血清稀釋系列和對照血清稀釋液，進(jìn)行三次利用清洗用緩沖液0.1ml的清洗操作。然后在各孔中分別添加0.1ml過氧化物酶標(biāo)識山羊抗天竺鼠IgG抗體的1000倍稀釋液(用PB稀釋)，在4℃下靜置一夜。然后，進(jìn)行三次利用清洗用緩沖液0.1ml的清洗操作，將顯示過氧化物酶的酶活性的顯色試劑(2，2′-連氮-二[3-乙基-苯基噻唑啉]磺酸酯，ABTS)的反應(yīng)液(根據(jù)試藥套件ABTS Peroxidase Substrate System的指南調(diào)制)0.1ml分注到各孔中，在37℃下加溫30分鐘進(jìn)行酶反應(yīng)。然后將SDS的1％水溶液0.1ml添加到各孔中，使酶反應(yīng)停止，用讀卡機測定各孔的吸光度(405nm)。所得結(jié)果如圖10所示。
由圖10所示結(jié)果可知各天竺鼠的抗血清分別稀釋到800倍或1600倍，顯示出強于對照血清的抗體活性，得到MG-Ins復(fù)合體特異的抗血清。將這樣的四只天竺鼠的抗血清的混合物(以下稱為“抗MG-Ins血清”)用于下述實驗。
(1-7)抗MG-Ins IgG組分的調(diào)制將固定了與IgG特異結(jié)合的蛋白質(zhì)Protein A的樹脂{rProtein ASepharose Fast Flow(Pharmacia Biotech AB制)}0.7ml填充于塑料制柱(內(nèi)徑約7mm、長約8mm)中(以下稱為“蛋白質(zhì)A柱”)，用3ml的PB清洗。
然后用1ml的PB稀釋抗MG-Ins血清1ml，通過安裝在5ml可任意使用的注射器上的筒型過濾器(0.45μ、W-25-5、東曹(株)制)除去微粒。將其添加到蛋白質(zhì)A柱中，使IgG與蛋白質(zhì)A結(jié)合，然后使10ml的PB流過柱，清洗除去沒有與蛋白質(zhì)A結(jié)合的成份。再使4ml的0.1M檸檬酸緩沖液(pH4.0)流過蛋白質(zhì)A柱，使IgG從蛋白質(zhì)A離解，得到抗MG-Ins IgG組分。再使10ml的PB流過蛋白質(zhì)A柱，再生該柱。在離心濃縮所得抗MG-Ins IgG組分時溶劑取代PB。根據(jù)需要，反復(fù)上述操作，調(diào)制后述實驗所需量的抗MG-Ins IgG組分。
(1-8)來自抗MG-Ins IgG組分的抗原結(jié)合性片段(Fab)的調(diào)制、分離精制用消化酶番木瓜蛋白酶消化IgG，調(diào)制Fab。即，首先，將固定化的番木瓜蛋白酶8.7mg加入容量2.2ml的埃彭道夫管中，添加200μl的PB，攪拌后進(jìn)行離心分離，除去上清液，清洗固定化番木瓜蛋白酶。反復(fù)進(jìn)行兩次該清洗后，使固定化番木瓜蛋白酶懸濁在1ml的20mM磷酸緩沖液(pH7.0，(+)10mM EDTA(+)20mM半胱氨酸)中。再添加500μl的20mM磷酸緩沖液和500μl的抗MG-Ins IgG組分(IgG濃度約4.5mg/ml)的混合液，使半胱氨酸的最終濃度為10mM，加溫到37℃，振蕩數(shù)小時，進(jìn)行酶反應(yīng)。然后進(jìn)行酶反應(yīng)液的輕度離心分離，采集上清，將所得上清添加到蛋白質(zhì)A柱中，使未消化的IgG與蛋白質(zhì)A結(jié)合。然后再使10ml的PB流過蛋白質(zhì)A柱，進(jìn)行采取，再離心濃縮，得到含有抗MG-Ins抗體的Fab(以下稱為“抗MG-Ins Fab”)的組分(5.20mg/ml，34.7μM as IgG＝69.3μM as Fab)。
(1-9)與抗MG-Ins Fab結(jié)合的孔雀綠的熒光光譜的測定如下所示，測定利用抗原抗體反應(yīng)使MG與抗MG-Ins Fab結(jié)合時的MG的熒光光譜。即，將兩成份混合，使抗MG-Ins Fab濃度為0.955μM、MG濃度為0.907μM(溶劑為磷酸緩沖生理鹽水(pH7.2，PBS))，在25℃下攪拌5分鐘，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。然后使用熒光分光光度計在勵起光波長620nm、熒光波長630～750nm、勵起光側(cè)和熒光側(cè)的帶通寬均為5nm的條件下，測定由上述混合溶液發(fā)出的熒光光譜。所得熒光光譜的未處理數(shù)據(jù)減去相同條件下測定的磷酸緩沖生理鹽水的本底以及增加利用裝置函數(shù)的修正值的熒光光譜如圖11所示。確認(rèn)水溶液中基本上無熒光的孔雀綠與抗MG-Ins Fab結(jié)合轉(zhuǎn)為熒光性。
另外，使抗MG-Ins Fab濃度為1μM、MG濃度在0～0.9μM的范圍內(nèi)變化，同上所述地測定熒光光譜。所得結(jié)果如圖12所示。另外，縱軸是MG發(fā)出的熒光的強度值(每秒平均值，CPScount per second)。
根據(jù)圖12所示的結(jié)果，抗體和色素的相對量的優(yōu)選值，即色素相對于抗體不飽和且得到較強色素?zé)晒獾闹?，在以下定量中，相對于抗MG-Ins Fab濃度1μM采用MG濃度0.4μM。另外，每次與每次的調(diào)整多克隆抗體時的該相對值有可能不同，另外，即使來自相同的多克隆抗體，也有可能因調(diào)整的Fab的精制純度，表觀上呈現(xiàn)不同。
(1-10)使用抗MG-Ins Fab和孔雀綠的胰島素的定量[1-10-1]檢量線的制作如下所示，制作相對于一定量(1μM)的抗MG-Ins Fab和一定量(0.4μM)的MG的表示胰島素濃度和熒光強度的關(guān)系檢量線。另外，所用胰島素形成含鋅的多分子締合體，所以事前溶于含有最終濃度為0.1％的SDS的PB中，使該締合體離解。然后，將所得胰島素溶液供至用PBS平衡過的凝膠過濾柱(Fast Desaliting column HR 10/10，Pharmacia制)，在下述定量中，使用從該胰島素溶液中除去SDS的產(chǎn)物。
(1)將熒光分光光度計設(shè)定為勵起光波長620nm、熒光波長650nm，保持吸收池座的溫度在一定溫度(25℃)。
(2)調(diào)制含有1μM(Y＝1μM)的抗MG-Ins Fab和0.4μM(Z＝0.4μM)的MG的2ml(A＝2ml)抗體色素溶液(溶劑為磷酸緩沖生理鹽水)(pH7.2、PBS)(S101)。
(3)將所得抗體色素溶液加入熒光測定用標(biāo)準(zhǔn)容器內(nèi)，將該容器設(shè)置在熒光分光光度計中，用小轉(zhuǎn)子攪拌容器中的溶液30秒。并將次數(shù)設(shè)為初值(n＝1)(S102)。
(4)將26.5μM(X＝26.5μM)的胰島素標(biāo)準(zhǔn)溶液(溶劑為PBS)10μl(B1＝0.01ml)添加到容器中的溶液中，用小轉(zhuǎn)子攪拌5分鐘，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)(S103)。
(5)用勵起光照射容器中的溶液，測定從該溶液中發(fā)出的MG的熒光強度30秒，求得熒光強度每秒平均值(熒光強度測定值I1)(S104)。另外，將胰島素濃度為0μM時的熒光強度作為空白值，實際測定值減去空白值為測定值。
(6)用下述計算式修正(根據(jù)隨著添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積變化的修正)所得熒光強度測定值(I1)，求得體積變化修正值(熒光強度修正值I1′)(S105)。
I1′＝I1×{(A+B1)/A}(1)′(7)由胰島素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(X)，使用下述計算式求得測定熒光強度的混合溶液的胰島素濃度(胰島素濃度修正值X1′)(S106)。
X1′＝X×{B1/(A+B1)}(2)′(8)次數(shù)n加1(S108)，再重復(fù)上述(4)～(7)(S103→S104→S105→S106)，求得次數(shù)n＝2時的熒光強度修正值I2′及胰島素濃度修正值(X2′)。另外，次數(shù)n＝2時，使用下述計算式。
I2′＝I2×{(A+B1+B2)/A} (1)″X2′＝X×{(B1+B2)/(A+B1+B2)}(2)″(9)重復(fù)上述(8)(S108→S103→S104→S105→S106→S107)，至所得熒光強度修正值In′即使添加標(biāo)準(zhǔn)溶液也不變化、即(In′-In-1′)值至零以下(S107)的程度，分別求得次數(shù)n為1～n時的熒光強度修正值(In′)及胰島素濃度修正值(Xn′)。另外，使用下述計算式。
In′=In×{(A+Σn=1nBn)/A}---(1)]]>
Xn′=X×{Σn=1nBn/(A+Σn=1nBn)}---(2)]]>將次數(shù)n為1～n時相對于(10)所得的胰島素濃度修正值(Xn′)的熒光強度修正值(In′)繪成圖，制成胰島素濃度為0～1.8μM范圍的檢量線(S109)。所得檢量線如圖13所示。
由圖13所示結(jié)果可確認(rèn)使用抗MG-Ins Fab和孔雀綠時，隨著胰島素濃度的增加，孔雀綠的熒光強度也增加，即，可確認(rèn)引起熒光增強。且由于在胰島素濃度修正值(Xn′)和熒光強度修正值(In′)之間，在0～1.7μM的范圍內(nèi)有正線性相關(guān)關(guān)系，所以可通過測定孔雀綠的熒光強度對該范圍的胰島素濃度定量，且即使胰島素濃度在約為0.13μM的這樣的低濃度下也可進(jìn)行定量，檢測靈敏度(約0.1μM)高。
實際試料的測定使用上述所得檢量線，如下所述地對實際試料中的胰島素濃度定量。實際試料的被測體溶液是體液、其濃縮液或用PBS等稀釋的溶液。
(11)將熒光分光光度計設(shè)定為勵起光波長620nm、熒光波長650nm，保持吸收池座的溫度在一定溫度(25℃)。
(12)調(diào)制含有1μM(Y＝1μM)的抗MG-Ins Fab和0.4μM(Z＝0.4μM)的MG的2ml(A＝2ml)抗體色素溶液(溶劑為磷酸緩沖生理鹽水)(pH7.2、PBS)(S201)。
(13)將所得抗體色素溶液加入熒光測定用標(biāo)準(zhǔn)容器內(nèi)，用熒光分光光度計調(diào)整該容器，用小轉(zhuǎn)子攪拌容器中的溶液30秒。另外，次數(shù)設(shè)定為初值(n＝1)(S202)。
(14)將被測體溶液20μl(B1＝2.020ml)添加到容器中的溶液中，用小轉(zhuǎn)子攪拌5分鐘，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)(S203)。
(15)用勵起光照射容器中的溶液，測定從該溶液中產(chǎn)生的MG的熒光強度30秒，求得熒光強度每秒鐘的平均值(熒光強度測定值I1)(S204)。另外，將被測體溶液未添加時的熒光強度作為空白，實際的測定值減去空白的值用作測定值。
(16)用下述計算式修正(按照伴隨著添加被測體溶液的體積變化的修正)所得熒光強度測定值(I1)，求得體積變化修正值(熒光強度修正值I1′)(S205)。
I1′＝I1×{(A+B1)/A}(3)′
(17)根據(jù)表示預(yù)先求得的熒光強度修正值(In′)和胰島素濃度修正值(Xn′)的關(guān)系的檢量線，由上述熒光強度修正值(I1′)求得混合溶液中的胰島素濃度(X1′)(S206)。
(18)由所得混合溶液中的胰島素濃度(X1′)，使用下述計算式求得被測體溶液中的胰島素濃度(X1)(S207)。
X1＝{X1′×(A+B1)}/B1(4)′結(jié)果確認(rèn)這樣求得的被測體溶液中的胰島素濃度(X1)為0.26μM，與用其它方法(BCA法)求得的被測體溶液中的胰島素濃度一致。
(19)然后，在需要測定其它被測體溶液時(S208)，次數(shù)n加1(S209)，再次重復(fù)上述(14)～(18)(S203→S204→S205→S206→S207)，可求得其它被測體溶液中的胰島素濃度(X2)。另外，當(dāng)次數(shù)n＝2時，使用下述計算式。
I2′＝I2×{(A+B1+B2)/A} (3)″X2＝{X2′×(A+B1+B2)-(X1×B1)}/B2(4)″(20)重復(fù)上述(S209→S203→S204→S205→S206→S207→S208)，至無需測定其它被測體溶液(S208)，由此可連續(xù)測定多個(次數(shù)n為1～n)被測體溶液中的胰島素濃度(Xn)。另外，這樣的連續(xù)測定可反復(fù)多次，直至抗體相對于胰島素飽和等即使添加被測體溶液熒光強度也不發(fā)生變化的程度。另外，采用下述計算式。
In′=In×{(A+Σn=1nBn)/A}---(3)]]>Xn={Xn′×(A+Σn=1nBn)-Σn=1n-1XnBn}/Bn---(4)]]>實施例2使用抗MG-Ins抗體的Fab和AO的胰島素的定量在水溶液中實質(zhì)上呈無熒光的金胺O(AO)的化學(xué)結(jié)構(gòu)的一部分與孔雀綠(MG)的化學(xué)結(jié)構(gòu)是共通的。因此本發(fā)明人推測AO也與抗MG-Ins IgG和抗MG-Ins Fab進(jìn)行交叉反應(yīng)轉(zhuǎn)為熒光性。另外本發(fā)明人推測因為AO的尺寸小于MG分子，所以與抗體的結(jié)合弱，kd大，因此，AO的kd有可能大于胰島素的kd，此時，與實施例1相反，因胰島素的存在而引起熒光阻礙，在胰島素濃度和熒光強度之間的反比例關(guān)系可以成立。因此，根據(jù)這樣的胰島素濃度和熒光強度間的反比例關(guān)系，可定量胰島素，代替MG使用AO進(jìn)行下述試驗。
(2-1)與抗MG-Ins IgG結(jié)合的金胺O的熒光光譜的測定如下所示，測定以抗原抗體反應(yīng)使AO與抗MG-Ins IgG結(jié)合時的AO的熒光光譜。即，將兩成份混合，使抗MG-Ins IgG濃度為1μM、AO濃度為1μM的混合(溶劑為磷酸緩沖生理鹽水(pH7.2、PBS))，在25℃下攪拌5分鐘，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。然后使用熒光分光光度計，在勵起光波長400nm、熒光波長450～650nm、勵起光側(cè)和熒光側(cè)的帶通寬均為5nm的條件下，測定由上述混合溶液發(fā)出的熒光光譜。所得熒光光譜的未處理數(shù)據(jù)減去相同條件下測定的磷酸緩沖生理鹽水的本底，加上利用裝置函數(shù)的修正值的熒光光譜如圖14所示。結(jié)果確認(rèn)在水溶液中實質(zhì)上無熒光的金胺O也與抗MG-Ins IgG結(jié)合轉(zhuǎn)為熒光性。
(2-2)使用抗MG-Ins Fab和金胺O的胰島素的定量[2-2-1]檢量線的制作除使抗MG-Ins Fab濃度為2μM，使用0.4μM的金胺O代替0.4μM的孔雀綠，勵起光波長400nm、熒光波長520nm外，與上述[1-10-1]一樣，制作胰島素濃度在0～7.7μM范圍的檢量線。所得檢量線如圖15所示。
由圖15所示結(jié)果確認(rèn)當(dāng)使用抗MG-Ins Fab和金胺O時，隨著胰島素濃度增加，金胺O的熒光強度減少，即，引起熒光阻礙。而且由于在胰島素濃度修正值(Xn′)和熒光強度修正值(In′)之間，在0～4.23μM的范圍內(nèi)存在負(fù)線性相關(guān)關(guān)系，所以可通過測定金胺O的熒光強度對該范圍的胰島素濃度定量，且即使胰島素濃度在約為0.13μM的這樣的低濃度下也可進(jìn)行定量，檢測靈敏度(約0.1μM)高。另外，本發(fā)明人推測胰島素濃度高于4.23μM的高濃度區(qū)域內(nèi)AO熒光強度達(dá)到一定值的理由是因為作為抗MG-Ins Fab的基礎(chǔ)的抗MG-Ins IgG是多克隆抗體，含有與AO結(jié)合非常強的IgG。
實際試料的測定除使用上述所得檢量線，使抗MG-Ins Fab濃度為2μM，使用0.4μM的金胺O代替0.4μM的孔雀綠，勵起光波長400nm、熒光波長520nm之外，與上述[1-10-2]一樣求得被測體溶液中的胰島素濃度(X1)。結(jié)果確認(rèn)這樣求得的被測體溶液中的胰島素濃度(X1)為0.26μM，與通過其它方法(BCA法)求得的被測體溶液中的胰島素濃度一致。
另外，除上述改變之外，與上述[1-10-2]一樣，重復(fù)上述S209→S203→S204→S205→S206→S207→S208至無需測定其它被測體溶液，由此可連續(xù)測定多個(次數(shù)n為1～n)被測體溶液中的胰島素濃度(Xn)。另外，這樣的連續(xù)測定可反復(fù)多次，直至抗體相對于胰島素飽和等即使添加被測體溶液熒光強度也不發(fā)生變化的程度。
(2-3)抗原抗體反應(yīng)可逆性的驗證試驗應(yīng)當(dāng)確認(rèn)反復(fù)將胰島素和抗豬胰島素IgG(以下稱為“抗胰島素IgG”)添加到含有抗MG-Ins Fab和金胺O的溶液中，在同一試料內(nèi)改變游離胰島素的濃度時，本發(fā)明的方法的測定值也隨之發(fā)生變化，即，本發(fā)明的抗原抗體反應(yīng)是可逆的，且能進(jìn)行實時分析。在與上述[2-2-1]同樣的測定條件下測定熒光強度，所得結(jié)果如圖16所示。
首先，調(diào)制含有2μM的抗MG-Ins Fab和0.4μM的金胺O的2ml的PBS溶液，加入熒光測定用容器內(nèi)，測定AO熒光強度，此時的熒光強度為相對值1。
再將胰島素添加到該容器中的溶液內(nèi)，使?jié)舛葹?.26μM，攪拌5分鐘后測定熒光強度，AO熒光強度的相對值減少到0.97。
再向該溶液中添加一定量(0.135μM)的抗胰島素IgG，同樣進(jìn)行攪拌后測定熒光強度，AO熒光強度的相對值回復(fù)到大約為1。這是因為抗胰島素IgG和胰島素結(jié)合，使溶液中變得不存在游離胰島素，所以熒光強度恢復(fù)到原值。
然后向該溶液內(nèi)再添加胰島素，使?jié)舛茸兂?.39μM，同樣攪拌后測定熒光強度，AO熒光強度的相對值再次減少，但將抗胰島素IgG分兩次添加到該溶液中后(第一次0.128μM、第二次0.127μM)，AO熒光強度的相對值得到恢復(fù)。然后再次將胰島素添加到該溶液內(nèi)，使?jié)舛茸兂?.37μM，同樣攪拌后測定熒光強度，AO熒光強度的相對值減少。
由圖16所示結(jié)果可確認(rèn)本發(fā)明的抗原抗體反應(yīng)是可逆的，本發(fā)明的方法的測定值(熒光強度)隨著測定對象物量的改變可逆地變動(增加-減少)，且由于本發(fā)明的方法的測定值(熒光強度)相對于測定對象物的量有相關(guān)關(guān)系，所以通過測定熒光強度的變動，可實時測量測定對象物。
產(chǎn)業(yè)可利用性利用本發(fā)明就可提供利用抗原抗體反應(yīng)簡便、高靈敏度且實時地連續(xù)分析(包括圖像)生物內(nèi)物質(zhì)等的熒光分析方法。
權(quán)利要求
1.一種熒光分析方法，其特征在于，包括得到抗體色素溶液和含有測定對象物質(zhì)的被檢測體溶液的混合溶液的混合工序，所述抗體色素溶液含有各自具有預(yù)定濃度的抗體和色素，所述抗體的抗原結(jié)合部位的一部分識別色素，其余的一部分識別測定對象物質(zhì)，所述色素被所述抗體識別，且與所述抗體結(jié)合時由非熒光性轉(zhuǎn)為熒光性；用勵起光照射所述混合溶液，測定由所述混合溶液發(fā)出的熒光的強度，得到測定值的測定工序；和基于預(yù)先求得的熒光強度與測定對象物質(zhì)濃度的關(guān)系，由所述測定值求得所述測定對象物質(zhì)的濃度的計算工序。
2.如權(quán)利要求1所述的熒光分析方法，其特征在于，還包括在所述計算工序后，將被測體溶液再次添加到所述混合溶液中混合，實行所述測定工序及所述計算工序，反復(fù)求得測定對象物質(zhì)的濃度的連續(xù)分析工序。
3.如權(quán)利要求1或2所述的熒光分析方法，其特征在于，所述計算工序包括根據(jù)隨著所述被測體溶液的添加的體積變化修正所述測定值，得到熒光強度修正值的工序；根據(jù)預(yù)先求得的熒光強度修正值和混合溶液中的測定對象物質(zhì)濃度的關(guān)系，由所述熒光強度修正值求得所述混合溶液中的測定對象物質(zhì)的濃度的工序；和由所述混合溶液中的測定對象物質(zhì)濃度求得所述被測體溶液中的測定對象物質(zhì)的濃度的工序。
4.如權(quán)利要求1～3任一項所述的熒光分析方法，其特征在于，還包括得到抗體色素溶液和含有預(yù)定濃度的測定對象物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的混合溶液的混合工序，所述抗體色素溶液含有各自具有預(yù)定濃度的抗體和色素，所述抗體的抗原結(jié)合部位的一部分識別色素，其余的一部分識別測定對象物質(zhì)，所述色素被所述抗體識別，且與所述抗體結(jié)合時由非熒光性轉(zhuǎn)為熒光性；用勵起光照射所述混合溶液，測定由所述混合溶液發(fā)出的熒光的強度，得到測定值的測定工序；將標(biāo)準(zhǔn)溶液再次添加到所述混合溶液中混合，然后實行所述測定工序，反復(fù)求得熒光強度的測定值的連續(xù)測定工序；和根據(jù)所述測定工序和所述連續(xù)測定工序中所得的測定值和所述測定對象物質(zhì)的添加量求得熒光強度和測定對象物質(zhì)濃度的關(guān)系，制作檢量線的工序。
5.如權(quán)利要求4所述的熒光分析方法，其特征在于，所述檢量線制作工序包括根據(jù)隨著添加所述標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積變化修正所述測定值，得到熒光強度修正值的工序；算出所述混合混合溶液中的測定對象物質(zhì)的濃度的工序；和求得所述熒光強度修正值和所述混合溶液中的測定對象物質(zhì)濃度的關(guān)系的工序。
6.如權(quán)利要求1～5任一項所述的熒光分析方法，其特征在于，所述色素選自具有三苯甲烷結(jié)構(gòu)的色素或具有二苯甲烷結(jié)構(gòu)的色素。
7.如權(quán)利要求1～5任一項所述的熒光分析方法，其特征在于，所述色素是孔雀綠或金胺O。
8.如權(quán)利要求1～7任一項所述的熒光分析方法，其特征在于，所述抗體是將所述色素和所述測定對象物質(zhì)的結(jié)合物質(zhì)作為抗原形成的抗體，或是將利用抗體識別的、且在和所述抗體結(jié)合時由非熒光性轉(zhuǎn)為熒光性所必要的結(jié)構(gòu)與所述色素共通的色素與所述測定對象物質(zhì)的結(jié)合物質(zhì)作為抗原，而形成的抗體。
9.如權(quán)利要求1～8任一項所述的熒光分析方法，其特征在于，所述抗體是將孔雀綠和所述測定對象物質(zhì)的結(jié)合物質(zhì)作為抗原而形成的抗體，所述色素是孔雀綠。
10.如權(quán)利要求1～8任一項所述的熒光分析方法，其特征在于，所述抗體是將孔雀綠和所述測定對象物質(zhì)的結(jié)合物質(zhì)作為抗原而形成的抗體，所述色素是金胺O。
11.如權(quán)利要求1～8任一項所述的熒光分析方法，其特征在于，所述抗體是由精制抗血清而得到的IgG組分調(diào)制的抗原結(jié)合性片段。
12.如權(quán)利要求1～11任一項所述的熒光分析方法，其特征在于，所述測定對象物質(zhì)為選自應(yīng)作為免疫測定對象的蛋白質(zhì)、荷爾蒙、維生素、菌體、環(huán)境污染物質(zhì)、醫(yī)藥品的任一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用抗原抗體反應(yīng)可簡便、高靈敏度且實時連續(xù)地分析(包括圖像)生物體內(nèi)物質(zhì)等的熒光分析方法。本發(fā)明的熒光分析方法包括得到抗體色素溶液和含有測定對象物質(zhì)的被檢測體溶液的混合溶液的混合工序，上述抗體色素溶液含有各自具有預(yù)定濃度的抗體和色素，上述抗體的抗原結(jié)合部位的一部分識別色素，其余的一部分識別測定對象物質(zhì)，上述色素被上述抗體識別，且與上述抗體結(jié)合時由非熒光性轉(zhuǎn)為熒光性；用勵起光照射上述混合溶液，測定由上述混合溶液發(fā)出的熒光的強度，得到測定值的測定工序；和基于預(yù)先求得的熒光強度和測定對象物質(zhì)濃度的關(guān)系，由上述測定值求得上述測定對象物質(zhì)的濃度的計算工序。
文檔編號G01N33/58GK1682112SQ03822359
公開日2005年10月12日 申請日期2003年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月19日
發(fā)明者治部雅貴 申請人:浜松光子學(xué)株式會社