專利名稱：一種超分辨熒光壽命成像方法及成像系統(tǒng)的制作方法
1/5頁(yè)一種超分辨熒光壽命成像方法及成像系統(tǒng)技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于光學(xué)、生物學(xué)、化學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種超分辨熒光壽命成像方法及成 像系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
熒光顯微技術(shù)具有無損、非接觸、高特異性、高靈敏、高活體友好以及能夠提供功 能信息等突出優(yōu)點(diǎn)，一直是生命科學(xué)，尤其是細(xì)胞生物學(xué)研究的重要工具。近年來，隨著生 命科學(xué)的發(fā)展，對(duì)熒光顯微技術(shù)也提出了越來越高的要求，激光技術(shù)、熒光探針標(biāo)記技術(shù)、 新型熒光探測(cè)技術(shù)和成像手段的不斷發(fā)展，極大地促進(jìn)了熒光顯微技術(shù)的發(fā)展，成為推動(dòng) 生命科學(xué)發(fā)展的重要?jiǎng)恿?。此外，熒光顯微技術(shù)也在成像的對(duì)比機(jī)制方面獲得了很大的進(jìn) 展。
目前，生命科學(xué)的研究已進(jìn)入分子層次，為了更好地理解生命活動(dòng)和疾病發(fā)展的 分子機(jī)理，需要在分子水平上研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)位置與功能的關(guān)系以及蛋白質(zhì)分子之間相 互作用等，這對(duì)熒光顯微技術(shù)提出了更高的要求。突破衍射極限限制，發(fā)展具有納米空間分 辨的遠(yuǎn)場(chǎng)熒光顯微技術(shù)已成為國(guó)際顯微成像領(lǐng)域的前沿?zé)狳c(diǎn)之一。超分辨(SR)成像技術(shù) 的發(fā)展，也為熒光壽命成像(FLIM)的新發(fā)展提供了巨大的機(jī)遇。研究和發(fā)展超分辨熒光壽 命成像(SR-FLIM)技術(shù)，可以顯著提高FLIM熒光壽命的測(cè)量精度以及定位精度，利用基于 SR-FLIM的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，可以在分子尺度研究蛋白質(zhì)分子之間的相互作用， 獲得分子之間相互作用的效率及其精確定位。
然而，受光學(xué)衍射極限的限制，熒光顯微技術(shù)的空間分辨率只能達(dá)到200納米左 右，難以滿足生命科學(xué)研究的需要。而對(duì)于熒光壽命成像來說，其空間分辨率受衍射極限的 影響尤為嚴(yán)重。傳統(tǒng)的衍射受限FLIM圖像中各個(gè)像素的熒光壽命值，并不能反映其所對(duì)應(yīng) 的分子的熒光壽命，無法做到分子尺度的熒光壽命成像。
超分辨熒光壽命成像是一個(gè)新興的研究領(lǐng)域，尋求具有高度原創(chuàng)性的技術(shù)原理與 方案，并率先解決超分辨熒光壽命成像在生命科學(xué)應(yīng)用中存在的難題，具有重大的科學(xué)意 義與應(yīng)用價(jià)值。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種超分辨熒光壽命成像方法，旨在突破光學(xué)衍射極限限制，實(shí)現(xiàn) 超分辨熒光壽命成像。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種超分辨熒光壽命成像方法，所述方法包括下述步驟
對(duì)標(biāo)記于樣品中的光開關(guān)染料分子進(jìn)行稀疏激活；
激發(fā)樣品中被激活的光開關(guān)染料分子，收集被激發(fā)的光開關(guān)染料分子所發(fā)射的光 子并記錄光開關(guān)染料分子的熒光圖像，對(duì)熒光圖像中的光開關(guān)染料分子進(jìn)行質(zhì)心定位；
對(duì)在質(zhì)心定位處接收到的光子進(jìn)行計(jì)數(shù)，確定被激發(fā)的光開關(guān)染料分子的熒光壽 命；
結(jié)合得到的光開關(guān)染料分子的質(zhì)心定位結(jié)果和熒光壽命，構(gòu)建超分辨熒光壽命圖像。
本發(fā)明還提供了一種用于實(shí)現(xiàn)如上所述的超分辨熒光壽命成像方法的成像系統(tǒng)， 包括
第一激光器，用于實(shí)現(xiàn)對(duì)標(biāo)記于樣品中的光開關(guān)染料分子的稀疏激活；
第二激光器，用于激發(fā)樣品中被激活的光開關(guān)染料分子；
合束鏡，用于將所述第一激光器所發(fā)出的光和所述第二激光器所發(fā)出的光合成為 一束光；所述第一激光器所發(fā)出的光由所述合束鏡的第一反射面呈一定入射角射入，并在 第一反射面反射；所述第二激光器所發(fā)出的光由所述合束鏡的第二反射面射入，經(jīng)所述合 束鏡透射后由所述合束鏡的第一反射面射出；
依次設(shè)于所述第一激光器和所述合束鏡之間的第一透鏡、第一濾光片、反射鏡；
依次設(shè)于所述第二激光器和所述合束鏡之間的第二透鏡、第二濾光片、掃描振 鏡；
第一物鏡、第二物鏡；
依次設(shè)于所述合束鏡的第一反射面與所述第一物鏡的之間的第一管鏡、雙色鏡；
時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)器，用于對(duì)接收到的光子進(jìn)行計(jì)數(shù)；
依次設(shè)于所述雙色鏡與所述時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)器之間的第一發(fā)射濾光片、第二 管鏡、光電倍增管；
電子倍增型CCD攝相機(jī)，用于記錄光開關(guān)染料分子的熒光圖像；
設(shè)于所述第二物鏡與所述電子倍增型CCD攝相機(jī)之間的第二發(fā)射濾光片、第三管 鏡；
主機(jī)，同時(shí)連接所述時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)器和所述電子倍增型CCD攝相機(jī)，用于 結(jié)合所述電子倍增型CCD攝相機(jī)記錄的光開關(guān)染料分子的熒光圖像，對(duì)熒光圖像中的光開 關(guān)染料分子進(jìn)行質(zhì)心定位，并根據(jù)所述時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)器在質(zhì)心定位處對(duì)接收到的光 子進(jìn)行計(jì)數(shù)的結(jié)果，構(gòu)建超分辨熒光壽命圖像；同時(shí)還連接所述第一激光器和所述第二激 光器，用于控制所述第一激光器和所述第二激光器的工作；
以及
延遲器，連接于所述主機(jī)和所述電子倍增型C⑶攝相機(jī)之間，用于實(shí)現(xiàn)所述第二 激光器和所述電子倍增型CCD攝相機(jī)的同步。
本發(fā)明將基于單分子定位的超分辨熒光顯微技術(shù)和基于時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)的 熒光壽命成像結(jié)合，實(shí)現(xiàn)超分辨熒光壽命成像，突破了光學(xué)衍射極限限制，極具科學(xué)意義與 應(yīng)用價(jià)值。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的超分辨熒光壽命成像方法的實(shí)現(xiàn)流程圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的超分辨熒光壽命成像系統(tǒng)的光學(xué)結(jié)構(gòu)圖。
具體實(shí)施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。
本發(fā)明實(shí)施例的基本思路是將基于單分子定位的超分辨熒光顯微STORM技術(shù) 和基于時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)(TCSPC)的熒光壽命成像結(jié)合，實(shí)現(xiàn)超分辨熒光壽命成像 (SR-FLIM)。
以下結(jié)合本發(fā)明的具體實(shí)施例予以詳細(xì)描述。
圖1示出了本發(fā)明實(shí)施例提供的超分辨熒光壽命成像方法的實(shí)現(xiàn)流程，詳述如 下
在步驟S 101中，對(duì)標(biāo)記于樣品中的光開關(guān)染料分子進(jìn)行稀疏激活。
其中，光開關(guān)染料分子和樣品中所要觀察的分子需能夠特異性結(jié)合，可以選用紅 色花青染料分子，如Cy5和Alexa 647，通過免疫熒光染色的方式將紅色花青染料分子標(biāo) 記于樣品中。也可以選用利用順式-反式異構(gòu)體的構(gòu)像變化造成可逆開關(guān)的熒光蛋白，如 Dronpa系列，通過轉(zhuǎn)染的方式將熒光蛋白標(biāo)記于樣品中。
本發(fā)明實(shí)施例中，具體可通過全場(chǎng)面照明的方法激活光開關(guān)染料分子。
在步驟S102中，激發(fā)樣品中被激活的光開關(guān)染料分子，收集被激發(fā)的光開關(guān)染料 分子所發(fā)射的光子并記錄光開關(guān)染料分子的熒光圖像，對(duì)熒光圖像中的光開關(guān)染料分子進(jìn) 行質(zhì)心定位。
可采用皮秒脈沖光掃描激發(fā)被激活的熒光分子，由于本發(fā)明實(shí)施例是將基于單分 子定位的超分辨熒光顯微STORM技術(shù)和基于時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)(TCSPC)的熒光壽命成像 結(jié)合，因此對(duì)被激發(fā)的光開關(guān)染料分子所發(fā)射的光子需要收集兩份一份用于記錄光開關(guān) 染料分子的熒光圖像，對(duì)樣品中的單個(gè)發(fā)光分子進(jìn)行質(zhì)心定位，實(shí)現(xiàn)橫向達(dá)到納米級(jí)的定 位精度；另一份則用于實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)分子所發(fā)光子的準(zhǔn)確分類，通過采用負(fù)指數(shù)函數(shù)擬合，從 而可以得到各個(gè)發(fā)光分子的準(zhǔn)確的熒光壽命，擬合公式為I (t) = Iciexp (-t/τ)，其中，t為 時(shí)間，τ為熒光壽命，I0為初始時(shí)刻(t = 0時(shí))的熒光強(qiáng)度，I (t)為t時(shí)刻的熒光強(qiáng)度。
質(zhì)心定位的目的是實(shí)現(xiàn)橫向達(dá)到納米級(jí)的定位精度。雖然對(duì)于顯微系統(tǒng)來說，一 個(gè)點(diǎn)光源的像為由系統(tǒng)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)決定的艾里斑，但是點(diǎn)光源的空間位置可以通過其熒光 圖像的質(zhì)心求出，定位精度(標(biāo)準(zhǔn)差)和系統(tǒng)探測(cè)到的來自該點(diǎn)源的光子數(shù)的平方根成反 比，與系統(tǒng)本身點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差成正比，因此可以獲得高達(dá)納米的定位精度。而橫向的 質(zhì)心定位就直接用高斯函數(shù)擬合就可以實(shí)現(xiàn)，軸向單分子定位顯微結(jié)合某些軸向分辨輔助 手段，例如改造點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，使得不同軸向位置上的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)(PSF)攜帶有ζ軸的坐標(biāo) 信息，例如利用柱面鏡像散，螺旋形的PSF，也能將軸向分辨率提高到50納米甚至更高的水 平。
在步驟S103中，對(duì)在質(zhì)心定位處接收到的光子進(jìn)行計(jì)數(shù)，確定被激發(fā)的光開關(guān)染 料分子的熒光壽命。
根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算熒光壽命的原理如上文步驟S102中所述，此處不再贅述。
在步驟S104中，結(jié)合得到的光開關(guān)染料分子的質(zhì)心定位結(jié)果和熒光壽命，構(gòu)建超 分辨熒光壽命圖像。
將壽命和定位信息結(jié)合即可重構(gòu)出超分辨的熒光壽命圖像，例如圖像中的各個(gè)點(diǎn) 代表了各個(gè)分子的位置，該點(diǎn)所對(duì)應(yīng)像素的顏色，可以表示該分子的熒光壽命。
圖2示出了本發(fā)明實(shí)施例提供的超分辨熒光壽命成像系統(tǒng)的光學(xué)結(jié)構(gòu)圖，為了便 于描述，僅示出了與本實(shí)施例相關(guān)的部分。圖2中的英文標(biāo)記定義如下=Laserl 第一激光 器；Laserf 第二激光器(發(fā)射皮秒脈沖激發(fā)光)；Ll 第一透鏡；L2 第二透鏡；Fl 第一濾 光片；F2 第二濾光片fcan Device 掃描振鏡；M 反射鏡；DM 雙色鏡；BS 合束鏡；TLl 第一管鏡；TL2 第二管鏡；TL3 第三管鏡；01 第一物鏡；02 第二物鏡；S 樣品；TCSPC 時(shí) 間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)器；Delay 延遲器；PMT 光電倍增管；EMCCD 電子倍增型CCD攝相機(jī)；EF 1 第一發(fā)射濾光片；EF2 第二發(fā)射濾光片。
上述第一激光器Laserl用于實(shí)現(xiàn)對(duì)標(biāo)記于樣品中的光開關(guān)染料分子的稀疏激 活，第二激光器Laserf則用于激發(fā)樣品中被激活的光開關(guān)染料分子。合束鏡BS用于將第 一激光器Laserl所發(fā)出的光和第二激光器Laserf所發(fā)出的光合成為一束光，其中第一激 光器Laserl所發(fā)出的光由合束鏡BS的第一反射面(圖2中合束鏡BS的右側(cè)面)呈一定 入射角射入，并在第一反射面反射，第二激光器Laserf所發(fā)出的光由合束鏡BS的第二反射 面(圖2中合束鏡BS的左側(cè)面)射入，經(jīng)合束鏡BS透射后由合束鏡BS的第一反射面射 出。第一透鏡Li、第一濾光片F(xiàn)l、反射鏡M依次設(shè)于第一激光器Laserl和合束鏡BS之間， 第二透鏡L2、第二濾光片F(xiàn)2、掃描振鏡kan Device依次設(shè)于第二激光器Laser2和合束鏡 BS之間。第一管鏡TL1、雙色鏡DM依次設(shè)于合束鏡BS的第一反射面與第一物鏡01之間。 時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)器TCSPC用于對(duì)接收到的光子進(jìn)行計(jì)數(shù)。第一發(fā)射濾光片EF1、第二 管鏡TL2、光電倍增管PMT依次設(shè)于雙色鏡DM與時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)器TCSPC之間。電子 倍增型CCD攝相機(jī)EMCCD用于記錄光開關(guān)染料分子的熒光圖像。第二發(fā)射濾光片EF2、第 三管鏡TL3設(shè)于第二物鏡02與電子倍增型CXD攝相機(jī)EMCXD之間。主機(jī)同時(shí)連接時(shí)間相 關(guān)單光子計(jì)數(shù)器TCSPC和電子倍增型CCD攝相機(jī)EMCCD，用于結(jié)合電子倍增型CCD攝相機(jī) EMCCD記錄的光開關(guān)染料分子的熒光圖像，對(duì)熒光圖像中的光開關(guān)染料分子進(jìn)行質(zhì)心定位， 并根據(jù)時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)器TCSPC在質(zhì)心定位處對(duì)接收到的光子進(jìn)行計(jì)數(shù)的結(jié)果，構(gòu)建 超分辨熒光壽命圖像；主機(jī)同時(shí)還連接第一激光器Laserl和第二激光器Laserf，控制第一 激光器Laserl和第二激光器Laserf的工作。延遲器Delay連接于主機(jī)和電子倍增型CXD 攝相機(jī)EMCCD之間，用于實(shí)現(xiàn)所述第二激光器和所述電子倍增型CCD攝相機(jī)的同步。
參照?qǐng)D2，Laserl可選用輸出波長(zhǎng)為640納米的CW半導(dǎo)體激光器，作為開關(guān)分子 的激活光源。在光路中，采用面照明的方法，利用物鏡01將激活光會(huì)聚到樣品S上。通過 控制激活光的功率和激活時(shí)間等，實(shí)現(xiàn)開關(guān)分子的稀疏激活。Laserf是輸出波長(zhǎng)為640納 米的皮秒脈沖半導(dǎo)體激光器，作為被激活的開關(guān)分子的激發(fā)光源。在光路中，皮秒脈沖激發(fā) 光聚焦到樣品S上，通過振鏡kan Device沿樣品做快速掃描，用于激發(fā)被激活的開關(guān)分 子。樣品S所發(fā)出的光用相對(duì)的兩個(gè)物鏡01和02收集，分別送入PMT和EMCCD。前者將 接收到的光子信號(hào)送入TCSPC，用于光子的計(jì)數(shù)；后者得到稀疏激活分子的熒光圖像并將 圖像傳輸至主機(jī)，主機(jī)通過質(zhì)心定位算法，可以獲得發(fā)光分子的準(zhǔn)確位置。通過主機(jī)控制激 活光路和激發(fā)光路的切換，以及TCSPC檢測(cè)和EMCCD成像的同步，具體每一個(gè)循環(huán)過程為 Laserl發(fā)出激光以對(duì)光開關(guān)染料分子進(jìn)行稀疏激活一Laserf激發(fā)樣品中被激活的光開 關(guān)染料分子一EMCXD成像一TCSPC計(jì)數(shù)。
實(shí)驗(yàn)步驟如下
(1)利用大功率的CW激光Laserl，對(duì)樣品S進(jìn)行全場(chǎng)面照明，通過Laserl的控制器或設(shè)于所述第一濾光片前側(cè)或后側(cè)的中性密度濾光片(圖2中未示出)來控制照明強(qiáng) 度，通過快門來控制照明時(shí)間，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中光開關(guān)染料分子的稀疏激活。
(2)利用小功率的皮秒脈沖激光Laser2，并通過掃描振鏡kan Device對(duì)樣品進(jìn) 行掃描，激發(fā)樣品中已被激活的開關(guān)分子。
(3)由于樣品在整個(gè)空間發(fā)射光子，實(shí)現(xiàn)本項(xiàng)目超分辨成像的根本思路是先進(jìn)行 分子定位，然后將光子“分配”到正確的分子上。因此，對(duì)激活分子所發(fā)出的熒光，分別由01 和02兩個(gè)物鏡收集。02物鏡收集的光子采用普通的STORM成像方法，對(duì)單分子進(jìn)行定位分 析，獲得超分辨熒光顯微圖像；01物鏡的光子被光電倍增管PMT接收，送入時(shí)間相關(guān)單光子 計(jì)數(shù)器TCSPC進(jìn)行熒光壽命測(cè)量。
(4)重復(fù)步驟1-3，直至所有分子均被定位及壽命分析完畢。通過圖像重構(gòu)得到樣 品的超分辨熒光壽命圖像。
本發(fā)明將基于單分子定位的超分辨熒光顯微技術(shù)和基于時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)的 熒光壽命成像結(jié)合，實(shí)現(xiàn)超分辨熒光壽命成像，突破了光學(xué)衍射極限限制，極具科學(xué)意義與 應(yīng)用價(jià)值，將有力地推動(dòng)中國(guó)在生命科學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種超分辨熒光壽命成像方法，其特征在于，所述方法包括下述步驟 對(duì)標(biāo)記于樣品中的光開關(guān)染料分子進(jìn)行稀疏激活；激發(fā)樣品中被激活的光開關(guān)染料分子，收集被激發(fā)的光開關(guān)染料分子所發(fā)射的光子并 記錄光開關(guān)染料分子的熒光圖像，對(duì)熒光圖像中的光開關(guān)染料分子進(jìn)行質(zhì)心定位；對(duì)在質(zhì)心定位處接收到的光子進(jìn)行計(jì)數(shù)，確定被激發(fā)的光開關(guān)染料分子的熒光壽命； 結(jié)合得到的光開關(guān)染料分子的質(zhì)心定位結(jié)果和熒光壽命，構(gòu)建超分辨熒光壽命圖像。
2.如權(quán)利要求1所述的超分辨熒光壽命成像方法，其特征在于，所述對(duì)樣品中的光開 關(guān)染料分子進(jìn)行稀疏激活的步驟通過對(duì)樣品進(jìn)行全場(chǎng)面照明實(shí)現(xiàn)。
3.一種用于實(shí)現(xiàn)如權(quán)利要求1所述的超分辨熒光壽命成像方法的成像系統(tǒng)，其特征在 于，包括第一激光器，用于實(shí)現(xiàn)對(duì)標(biāo)記于樣品中的光開關(guān)染料分子的稀疏激活； 第二激光器，用于激發(fā)樣品中被激活的光開關(guān)染料分子；合束鏡，用于將所述第一激光器所發(fā)出的光和所述第二激光器所發(fā)出的光合成為一束 光；所述第一激光器所發(fā)出的光由所述合束鏡的第一反射面呈一定入射角射入，并在第一 反射面反射；所述第二激光器所發(fā)出的光由所述合束鏡的第二反射面射入，經(jīng)所述合束鏡 透射后由所述合束鏡的第一反射面射出；依次設(shè)于所述第一激光器和所述合束鏡之間的第一透鏡、第一濾光片、反射鏡； 依次設(shè)于所述第二激光器和所述合束鏡之間的第二透鏡、第二濾光片、掃描振鏡； 第一物鏡、第二物鏡；依次設(shè)于所述合束鏡的第一反射面與所述第一物鏡的之間的第一管鏡、雙色鏡； 時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)器，用于對(duì)接收到的光子進(jìn)行計(jì)數(shù)；依次設(shè)于所述雙色鏡與所述時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)器之間的第一發(fā)射濾光片、第二管 鏡、光電倍增管；電子倍增型CCD攝相機(jī)，用于記錄光開關(guān)染料分子的熒光圖像； 設(shè)于所述第二物鏡與所述電子倍增型CCD攝相機(jī)之間的第二發(fā)射濾光片、第三管鏡； 主機(jī)，同時(shí)連接所述時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)器和所述電子倍增型CCD攝相機(jī)，用于結(jié)合 所述電子倍增型CCD攝相機(jī)記錄的光開關(guān)染料分子的熒光圖像，對(duì)熒光圖像中的光開關(guān)染 料分子進(jìn)行質(zhì)心定位，并根據(jù)所述時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)器在質(zhì)心定位處對(duì)接收到的光子進(jìn) 行計(jì)數(shù)的結(jié)果，構(gòu)建超分辨熒光壽命圖像；同時(shí)還連接所述第一激光器和所述第二激光器， 用于控制所述第一激光器和所述第二激光器的工作； 以及延遲器，連接于所述主機(jī)和所述電子倍增型CCD攝相機(jī)之間，用于實(shí)現(xiàn)所述第二激光 器和所述電子倍增型CCD攝相機(jī)的同步。
4.如權(quán)利要求3所述的成像系統(tǒng)，其特征在于，還包括設(shè)于所述第一濾光片前側(cè)或后 側(cè)的中性密度濾光片。
5.如權(quán)利要求3所述的成像系統(tǒng)，其特征在于，所述第一激光器為連續(xù)光激光器。
全文摘要
本發(fā)明適用于光學(xué)、生物學(xué)、化學(xué)等領(lǐng)域，提供了一種超分辨熒光壽命成像方法，所述方法包括下述步驟對(duì)標(biāo)記于樣品中的光開關(guān)染料分子進(jìn)行稀疏激活；激發(fā)樣品中被激活的光開關(guān)染料分子，收集被激發(fā)的光開關(guān)染料分子所發(fā)射的光子并記錄光開關(guān)染料分子的熒光圖像，對(duì)熒光圖像中的光開關(guān)染料分子進(jìn)行質(zhì)心定位；對(duì)在質(zhì)心定位處接收到的光子進(jìn)行計(jì)數(shù)，確定被激發(fā)的光開關(guān)染料分子的熒光壽命；結(jié)合得到的光開關(guān)染料分子的質(zhì)心定位結(jié)果和熒光壽命，構(gòu)建超分辨熒光壽命圖像。本發(fā)明將基于單分子定位的超分辨熒光顯微技術(shù)和基于時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)的熒光壽命成像結(jié)合，實(shí)現(xiàn)超分辨熒光壽命成像，突破了傳統(tǒng)的光學(xué)衍射極限限制，極具科學(xué)意義與應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102033058SQ201010551748
公開日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2010年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月19日
發(fā)明者于斌, 屈軍樂, 牛憨笨, 邵永紅, 陳丹妮, 齊璟 申請(qǐng)人:深圳大學(xué)