專利名稱：一種用于研究轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因水稻代謝差異的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分析化學(xué)領(lǐng)域，是一種基于代謝組學(xué)技術(shù)的水稻代謝輪廓譜研究轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因水稻代謝差異的方法。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因技術(shù)的快速發(fā)展，引發(fā)了轉(zhuǎn)基因植物對人類健康和生態(tài)環(huán)境影響的爭論。 目前人們對轉(zhuǎn)基因植物安全性的擔(dān)憂主要體現(xiàn)在以下幾方面(1)外源基因的毒性如何；有無過敏性；(3)是否產(chǎn)生有毒物質(zhì)；(4)對營養(yǎng)價值有無影響。為了保證轉(zhuǎn)基因植物的安全性，包括美國、歐盟、日本和我國在內(nèi)的許多國家以及FAO、WHO等一些國際組織紛紛制訂了一系列針對轉(zhuǎn)基因植物安全性的管理措施。其中“實(shí)質(zhì)等同性原則(substantial equivalence)”是目前國際公認(rèn)的轉(zhuǎn)基因食品安全性評價的通用原則。它包括三個層次的內(nèi)容(1)化學(xué)組成等同；(2)食用效果等同；(3)環(huán)境影響等同?？梢钥闯?，對轉(zhuǎn)基因植物安全性評價的關(guān)鍵內(nèi)容之一是開展轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因植物之間的組成差異研究。水稻中的代謝物種類繁多，既有維持生命活動和生長發(fā)育所必須的初生代謝產(chǎn)物，也有利用初生代謝物生成的與抗病和抗逆等關(guān)系密切的次生代謝產(chǎn)物；既有無機(jī)離子也有有機(jī)化合物；既有親水性化合物也有親脂性化合物。此外，各種物質(zhì)的含量差異也很懸殊，這就對分析方法提出了很高的要求。而代謝組學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)為上述目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)提供了可能。代謝組學(xué)是通過考察生物體系受刺激或擾動后(如將某個特定的基因變異或環(huán)境變化后)其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時間的變化，來研究生物體系代謝途徑的一種技術(shù)?；诖x組學(xué)的輪廓分析方法，可以非選擇性地檢測轉(zhuǎn)基因植物在代謝物水平潛在的生理學(xué)變化，可以檢測非預(yù)期效應(yīng)，為轉(zhuǎn)基因植物的安全性評價提供基礎(chǔ)。目前針代謝組學(xué)研究采用的技術(shù)有色譜、質(zhì)譜、核磁共振譜(NMR)等。核磁共振技術(shù)無需復(fù)雜的樣品預(yù)處理過程，無偏向性，但其靈敏度太低。色譜質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)合了色譜和質(zhì)譜的優(yōu)勢，具有高分離度、高通量及高靈敏度的特點(diǎn)，是代謝組學(xué)研究不可或缺的分離分析技術(shù)，而高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)由于應(yīng)用范圍廣、不受樣品熱穩(wěn)定性和揮發(fā)性的影響，已成為代謝組學(xué)研究的主流分析手段。轉(zhuǎn)基因水稻由于基因結(jié)構(gòu)的變化會引起一些列代謝水平上的生理學(xué)變化，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)找到這些變化，為轉(zhuǎn)基因水稻的非預(yù)期效應(yīng)及安全性評價提供依據(jù)是本研究的核心內(nèi)容。目前為止尚無采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行水稻種子代謝輪廓分析的報(bào)道。由于預(yù)處理過程分多步進(jìn)行，樣品準(zhǔn)備過程中容易引入誤差；如果樣本數(shù)比較多，質(zhì)譜運(yùn)行的時間較長，由于電噴霧離子源本身的衰減效應(yīng)，樣本的質(zhì)譜響應(yīng)信號會產(chǎn)生一定的偏差。這都將導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)偏離真實(shí)值，影響最終結(jié)果的可信度。針對上述情況，我們在實(shí)驗(yàn)過程中加入內(nèi)標(biāo)及質(zhì)量控制(QC)樣本校正實(shí)驗(yàn)偏差等措施確保數(shù)據(jù)的可靠性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于建立一種基于高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行水稻種子代謝輪廓分析，并對轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因水稻種子代謝差異進(jìn)行研究的方法。該方法具有高靈敏度、高通量的優(yōu)點(diǎn)，根據(jù)此方法可以為深入研究轉(zhuǎn)基因水稻的安全性提供根據(jù)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
一種用于研究轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因水稻代謝差異的方法，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對水稻粉末提取液進(jìn)行分析得到水稻種子代謝輪廓，然后用多變量統(tǒng)計(jì)方法區(qū)分轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因水稻數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)對代謝表型差異有重要貢獻(xiàn)的化合物。具體步驟如下，
1)將具有代表性的轉(zhuǎn)基因水稻種子樣本和非轉(zhuǎn)基因水稻種子樣本，分別用研缽研磨后過60目篩，水稻種子粉末可儲存于超低溫冰箱(-80 °C)中，備用；
2)水稻樣品預(yù)處理分別稱取一定量的水稻種子樣品于玻璃管中，向每支管中加入含內(nèi)標(biāo)IysoPC (19:0)的提取溶劑(甲醇/水，ν/ν為3/2)，斡旋，超聲處理后離心，取上清液凍干重溶于甲醇/水(ν/ν 3/2)溶液中，斡旋，離心后，將上清液移至進(jìn)樣瓶中。3)對水稻樣本依次進(jìn)行液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析；
液相條件為色譜柱Shrbax SB-Aq柱(1.8 Mm, 3. OX 100 mm)，流動相A為體積濃度 0. 1% 甲酸溶液，B 為乙腈；梯度洗脫條件0 2min 95/5CA/B, V/V),4 min 60/40 (Α/Β, V/ V), 20 min 5/95 (A/B, V/V), 22. Imin 0/100 乙腈持續(xù)沖洗色譜柱 4 min, 28 min 95/5 (A/B, V/V),隨后起始梯度平衡7 min;流速0.30 mL/min，柱后流出液不經(jīng)分流直接導(dǎo)入質(zhì)譜系統(tǒng)檢測；
質(zhì)譜條件為電噴霧離子源(ESI)，采用正離子模式檢測；使用高純N2輔助噴霧電離與脫溶劑，干燥氣溫度350 °C，干燥氣流速為11 L/min;離子源溫度350 °C，毛細(xì)管電壓為4000 V，溶劑化離子去簇電壓175 V,Centroid模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，質(zhì)量掃描范圍m/z 100 1000，獲得被分析樣本的總離子流圖；最終得到水稻樣本的總離子流圖，其即為水稻種子代謝輪廓譜。將水稻種子樣本中隨機(jī)抽取一個樣品或一個以上樣品的混合物作為QC樣，作為質(zhì)譜檢測過程中的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。在對水稻樣本種子依次進(jìn)行液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析過程中，先將QC樣進(jìn)樣一次，然后每分析4-8個樣本后，再將QC樣進(jìn)樣一次，通過保證QC樣總離子流圖的重復(fù)性確保實(shí)驗(yàn)過程中液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀有較好的穩(wěn)定性。4)采用LC-MS數(shù)據(jù)處理軟件對水稻樣本的水稻代謝輪廓譜進(jìn)行峰提取，峰匹配后形成一個數(shù)據(jù)矩陣。首先將數(shù)據(jù)歸一化至總峰面積，然后將數(shù)據(jù)矩陣中的變量進(jìn)行缺失值處理，然后將在QC樣本中RSD>25%的變量刪除，接下來對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)度化后利用偏最小二乘一判別分析(PLS-DA)方法對數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對轉(zhuǎn)基因水稻以及非轉(zhuǎn)基因水稻的代謝指紋數(shù)據(jù)進(jìn)行建模。根據(jù)模型中的變量重要性因子篩選對分類有重要貢獻(xiàn)的10個或 10個以上的檢測離子，這些檢測離子對應(yīng)的代謝物可被認(rèn)為是在轉(zhuǎn)基因水稻及其對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因水稻分類中起重要作用的化合物。5)對篩選出的化合物進(jìn)行t檢驗(yàn)，得到含量差異顯著的重要化合物。6)對篩選出的重要化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。本發(fā)明具有的效果是樣本的儲存、預(yù)處理采用自主建立的標(biāo)準(zhǔn)化程序，避免引入人為誤差。水稻樣品預(yù)處理過程相對簡單，不需要衍生化，引入的誤差小，增加了數(shù)據(jù)的可靠性。采用基于高分離度快速液相色譜一四極桿飛行時間質(zhì)譜(RRLC/QTOF MS)的代謝組學(xué)的研究平臺，在較高的線速度下依然可以保持很好的分離度，縮短了分析時間，提高了分析通量。同時，飛行時間質(zhì)譜的分辨率高，掃描速度快，一次分析可以得到質(zhì)量精度高的大量代謝物信息，為標(biāo)志物的鑒定提供了可靠的依據(jù)，也節(jié)省了鑒定時間。樣本預(yù)處理過程中加入內(nèi)標(biāo)，校正預(yù)處理過程和儀器運(yùn)行過程中響應(yīng)微小漂移帶來的誤差。樣本序列分析過程中插入由所有水稻樣本混合的質(zhì)量控制(QC)樣本，通過對QC樣本總離子流圖的監(jiān)控，可以檢測分析序列中儀器響應(yīng)有無漂移，確保了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。本發(fā)明的分析方法簡單，快速，重復(fù)性好，適合于實(shí)際樣品的批量分析。


圖1水稻小分子組份LC-MS代謝輪廓對比。(A)非轉(zhuǎn)基因樣本的總離子流(TIC) 圖；(B)轉(zhuǎn)基因樣本的TIC圖2 PLS — DA模型(A)得分矩陣。書為轉(zhuǎn)基因水稻，■為非轉(zhuǎn)基因水稻，每個點(diǎn)表示一個樣品，t表示樣本在主成分投影值。(B)S-plot X軸代表協(xié)方差，它表示了 I3LS-DA載荷矩陣中變量對分類的貢獻(xiàn)度。Y軸代表了相關(guān)性，它表示變量在分類中的可靠性。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
1、水稻樣本采集
轉(zhuǎn)基因水稻樣本為Marker-free雙價抗蟲株系材料；包括3個株系，分別為N6080， N6049，N6130，是明恢86作為受體轉(zhuǎn)化，經(jīng)過連續(xù)多代自交及田間選擇的優(yōu)良株系。轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻明恢86是均是在海南種植，同期播種，收種。水稻樣本采集后放在-80°C冰箱保存。2、分析方法
2.1水稻種子樣本預(yù)處理
水稻種子樣本從-80 ！冰箱中取出，在干燥器中等待其溫度恢復(fù)至室溫。將每種水稻種子脫殼后放在研缽中研磨，過60目篩，得到粒徑均一的粉末。將水稻粉末分裝至塑料管中，備用。稱取N6080或N6049各5份(每份0. 1500 g)，分別置于5 mL玻璃管中。稱取 N6130 4份(每份0.1500 g)，分別置于5 mL玻璃管中。稱取非轉(zhuǎn)基因水稻明恢86 5份(每份0. 1500 g)，分別置于5 mL玻璃管中。作為質(zhì)量控制(QC)樣本，稱取每種(N6080、N6049、N6130、明恢86)水稻0. 5 g, 混合均勻，然后稱取QC樣本4份(每份0. 1500 g)，于5 mL玻璃管中。稱取內(nèi)標(biāo)lysopc(19:0) 1.0 mg于1. 5 mL離心管中，加入1 mL甲醇。斡旋，超聲，使之完全溶解，獲得濃度為1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。取20 mL水，30 mL甲醇，超聲混勻，配置50 mL 60%甲醇(ν/ν)溶液作為提取溶齊U。向提取溶劑中加入50 μ 1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，混勻。向每個玻璃管中加入2 mL帶內(nèi)標(biāo)提取溶劑，斡旋10 s,超聲40分鐘。取出1.2 mL移至印pendorf管中，于4 "C, 14000 rpm下離心10分鐘。離心結(jié)束后，取1.0 mL上清液置于凍干機(jī)中凍干。儀器分析前，加入200 UL水/甲醇(ν/ν 2:3)溶液復(fù)溶。斡旋30 s，于4 14000 rpm下離心10分鐘后將上清液移至進(jìn)樣瓶，用于高效液相色譜質(zhì)譜分析。2. 2高效液相色譜質(zhì)譜分析
液相條件為色譜柱Shrbax SB-Aq柱(1.8 Mm, 3. OX 100 mm)，柱溫60 °C，進(jìn)樣量2 μ L，流動相A為體積濃度0. 1%甲酸溶液，B為乙腈；梯度洗脫條件0 2 min 95/5 (A/B， V/V),4 min 60/40 (A/B, V/V), 20 min 5/95 (A/B, V/V), 22.1 min 0/100 乙腈持續(xù)沖洗色譜柱4 min, 28 min 95/5 (A/B, V/V),隨后起始梯度平衡7 min ；流速0. 30 mL/min，柱后流出液不經(jīng)分流直接導(dǎo)入質(zhì)譜系統(tǒng)檢測；
質(zhì)譜條件為電噴霧離子源(ESI)，采用正離子模式檢測；使用高純N2輔助噴霧電離與脫溶劑，干燥氣溫度350 °C,干燥氣流速為11 L/min，霧化氣壓45 psig ；離子源溫度 350°C，毛細(xì)管電壓為4000 V，溶劑化離子去簇電壓175 V，錐孔電壓65 V，Centroid模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，每0.50 s采集一次數(shù)據(jù)；質(zhì)量掃描范圍m/z 100 1000，獲得被分析樣本的總離子流圖；最終得到水稻種子的總離子流圖，其即為水稻種子代謝輪廓譜。在對19個水稻樣本依次進(jìn)行高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析過程中，先將QC樣本進(jìn)樣一次，然后每分析5個樣本后，再將QC樣進(jìn)樣一次，通過保證QC樣品保留時間和響應(yīng)信號的重現(xiàn)性，確保實(shí)驗(yàn)過程中液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀有較好的穩(wěn)定性。根據(jù)以上操作，獲得水稻種子小分子代謝物的輪廓(圖1)。對14個轉(zhuǎn)基因樣本和 5個非轉(zhuǎn)基因?qū)φ账緲颖具M(jìn)行分析。樣品分析順序?yàn)檗D(zhuǎn)基因與對照組交替進(jìn)行。在分析序列中插入QC樣品，QC樣品為轉(zhuǎn)基因水稻與非轉(zhuǎn)基因水稻的混合物。在分析時間內(nèi)QC樣品的重復(fù)性良好，沒有出現(xiàn)明顯的組分變化，保留時間沒有出現(xiàn)飄移，可知所有的水稻樣品在整個分析時間內(nèi)也是穩(wěn)定的(表1)。通過內(nèi)標(biāo)和QC樣品，可以確保數(shù)據(jù)的可靠性。3模式識別及標(biāo)志物篩選
將所獲得的所有的水稻種子的總離子流圖的原始數(shù)據(jù)利用MFE (molecular feature extraction)軟件提取化合物信息，此步驟中將保留時間在0到20分鐘，m/z值為100到 1000,峰高大于1000的峰保留，并計(jì)算準(zhǔn)確化合物分子量，生成MHD文件。將MHD文件導(dǎo)入 gene spring軟件進(jìn)行峰匹配后得到原始峰表，此步驟中質(zhì)量偏差的斜率設(shè)為5. Oppm，截距設(shè)為2.0π ^，其他參數(shù)均為軟件默認(rèn)值。對原始峰表歸一化至總峰面積來減少系統(tǒng)誤差，然后對缺失值進(jìn)行處理。然后將缺失值處理后的峰表利用SIMCA-P 11. 5 (Umetrics, Umea, Sweden )進(jìn)行 PLS-DA 分析。T 檢驗(yàn)采用 SPSS 13. 0 (SPSS Inc. , Chicago, IL)進(jìn)行。為了考察轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因水稻的代謝輪廓差別，我們把每個樣品的測量數(shù)據(jù)進(jìn)行峰識別、峰匹配。峰識別匹配后形成一張由保留時間、質(zhì)量數(shù)和峰面積構(gòu)成的EXCEL峰表。首先將數(shù)據(jù)歸一化至總峰面積，然后將數(shù)據(jù)按照在QC樣本中80%存在的變量保留的原貝U，對缺失值進(jìn)行處理。然后刪除QC樣本中相對標(biāo)準(zhǔn)偏差大于25%的變量，得到一張數(shù)據(jù)可靠的峰表。水稻種子代謝輪廓中有數(shù)以百計(jì)的組分，而利用多變量分析方法可以將數(shù)據(jù)降維，從大量的數(shù)據(jù)中提取有用的信息。PLS-DA是一種基于偏最小二乘法的多變量分類方法， 它模擬了數(shù)據(jù)組矩陣和類別從屬矩陣的關(guān)系，解釋數(shù)據(jù)矩陣中已定義類別樣本之間的最大偏差。利用PLS-DA可以解釋轉(zhuǎn)基因樣本和非轉(zhuǎn)基因樣本之間的最大偏差。
將峰表中的每個變量(LC/MS分析得到的質(zhì)譜峰)除以其標(biāo)準(zhǔn)偏差的平方根，進(jìn)行par標(biāo)度化，在一定程度減少PLS-DA運(yùn)算中因響應(yīng)強(qiáng)度造成的偏差，也可以使低濃度的代謝物分子的作用得到體現(xiàn)。轉(zhuǎn)基因樣本賦予分類值1，非轉(zhuǎn)基因水稻賦予分類值2，所有的計(jì)算參數(shù)均為軟件默認(rèn)值，由此得到PLS-DA模型。PLS-DA模型的相關(guān)數(shù)據(jù)如下A=2、 R2X=O. 513、R2Y=O. 97、Q2Y=O. 955。其中A為模型使用的主成分?jǐn)?shù)，R2X, R2Y分別代表模型對原數(shù)據(jù)矩陣X，Y信息的解釋程度，Q2Y為模型的預(yù)測能力。上述數(shù)據(jù)明模型具有良好的穩(wěn)定性和預(yù)測能力。模型具有2個主成分，根據(jù)每個樣本在主成分上的投影，得到得分矩陣圖(圖2)， 從中可知，14個轉(zhuǎn)基因樣本和5個非轉(zhuǎn)基因樣本的投影在第一主成分上可以得到很好的分離，表明轉(zhuǎn)基因水稻與非轉(zhuǎn)基因水稻的代謝輪廓存在明顯的區(qū)別。根據(jù)每個變量在主成分上的投影，得到載荷矩陣圖，在此基礎(chǔ)上，根據(jù)每個變量的在載荷圖上的坐標(biāo)可計(jì)算其變量重要性因子VIP (VIP由PLS-DA直接獲得)
⑴
公式(1)中A為模型主成分?jǐn)?shù)，K為變量數(shù)，Wai為變量在PLS中的權(quán)重，SSY表示第a 個成分可解釋的SS，SS為上一個主成分殘差的平方和，a表示第a個成分。S-plot以圖形化的方式同時表現(xiàn)了變量對分類的貢獻(xiàn)度與可靠性(圖2B)，X軸代表協(xié)方差，它表示了 PLS-DA載荷矩陣中變量對分類的貢獻(xiàn)度。具有低協(xié)方差的變量可能來源于分析誤差和噪音差生的信號，Y軸代表了相關(guān)性，它表示變量在分類中的可靠性。變量在圖中呈S型。分布在S兩端的變量，貢獻(xiàn)度與可靠性都比較高，它們是對分類起重要作用的代謝物。由于S-plot結(jié)合了協(xié)方差以及相關(guān)性的信息，可以降低標(biāo)志物選取過程中存在的假陽性的風(fēng)險(xiǎn)。將位于S-plot圖兩端且VIP (VIP>1)最大10個的變量的信息提取，并將其含量信息導(dǎo)入到SPSS進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，通過t檢驗(yàn)的變量(p<0. 05)認(rèn)為是轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因水稻的代謝有顯著性差異的化合物(表2)。對表2中的離子進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，分別為tryptophan，linolenic acid, phytosphingosine，9, 10，13-TriH0ME，LPE (16:0), palmitic acid 等。它們是轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因差異較大的化合物，可為轉(zhuǎn)基因水稻的非預(yù)期效應(yīng)和安全性評價提供依據(jù)。本發(fā)明是利用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立水稻種子代謝輪廓分析方法，結(jié)合多變量數(shù)據(jù)尋找轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻的代謝差異。經(jīng)過超聲輔助提取技術(shù)對水稻組份進(jìn)行預(yù)處理后，利用液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)分離檢測水稻種子中的小分子代謝物，獲得水稻種子代謝輪廓信息。將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化、缺失值處理后建立PLS-DA模型，對轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻種子的代謝進(jìn)行整體區(qū)分。同時，結(jié)合載荷因子和S-plot圖篩查出對分類有重要貢獻(xiàn)的化合物，并對其進(jìn)行t檢驗(yàn)。本發(fā)明建立的水稻代謝輪廓分析方法在預(yù)處理過程中加入內(nèi)標(biāo)，最大程度的降低在實(shí)驗(yàn)過程中引起的誤差，方法驗(yàn)證結(jié)果良好。另外，通過質(zhì)量控制(QC)實(shí)現(xiàn)了對儀器運(yùn)行過程中保留時間和相應(yīng)信號的監(jiān)控，確保了數(shù)據(jù)的可靠性。本發(fā)明篩選出多個對分類有重要貢獻(xiàn)的化合物，可以為轉(zhuǎn)基因植物的非預(yù)期效應(yīng)和安全性評
權(quán)利要求
1.一種用于研究轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因水稻代謝差異的方法，其特征在于采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對水稻種子提取物進(jìn)行分析得到水稻代謝輪廓譜；然后用多變量統(tǒng)計(jì)方法研究轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻的代謝輪廓數(shù)據(jù)的整體差異，發(fā)現(xiàn)對代謝表型差異有重要貢獻(xiàn)的化合物，為轉(zhuǎn)基因水稻的非預(yù)期效應(yīng)和安全性評價提供依據(jù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因水稻是以所述非轉(zhuǎn)基因水稻為受體進(jìn)行基因插入，經(jīng)過自交并選擇具有抗蟲性的樣本獲得的轉(zhuǎn)基因水稻；通過找出的對代謝表型差異有重要貢獻(xiàn)的化合物，進(jìn)一步獲知由基因插入對受體的影響。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述方法，其特征在于代謝輪廓譜獲取的具體步驟為，1)取轉(zhuǎn)基因水稻種子樣本和非轉(zhuǎn)基因水稻種子樣本，分別研磨成粉末并過篩，獲得二類粒徑均一的水稻樣本；2)水稻樣品預(yù)處理分別稱取二類水稻種子樣品于玻璃管中，向每支管中加入含內(nèi)標(biāo) IysoPC (19:0)的提取溶劑(甲醇/水，ν/ν為3/2)，斡旋，超聲處理后離心，取上清液凍干重溶于甲醇/水(v/v =3/2)溶液中，斡旋，離心后，將上清液移至進(jìn)樣瓶中用于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析；3)對水稻樣本依次進(jìn)行液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析；液相條件為色譜柱為hrbax 38^9柱(1.8|^，3.0乂100 mm)，流動相A為體積濃度 0. 1%甲酸溶液，B為乙腈；流速0. 30 mL/min，柱后流出液不經(jīng)分流直接導(dǎo)入質(zhì)譜系統(tǒng)檢測；質(zhì)譜條件為電噴霧離子源(ESI)，采用正離子模式檢測；使用高純N2輔助噴霧電離與脫溶劑，干燥氣溫度350 °C，干燥氣流速為11 L/min ；離子源溫度350 °C，毛細(xì)管電壓為4000V，溶劑化離子去簇電壓175 V，Centroid模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)；質(zhì)量掃描范圍m/z 100 1000，獲得被分析樣本的總離子流圖；最終得到水稻種子樣本的總離子流圖，其即為水稻種子代謝輪廓譜。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于將水稻種子樣本中隨機(jī)抽取一個樣品或一個以上樣品的混合物作為QC樣，作為質(zhì)譜檢測過程中的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)；在對水稻樣本依次進(jìn)行液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析過程中，先將QC樣進(jìn)樣一次，然后每分析4-8個樣本后，再將QC 樣進(jìn)樣一次，通過保證QC樣總離子流圖的重復(fù)性確保實(shí)驗(yàn)過程中液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀無較大系統(tǒng)偏差，數(shù)據(jù)可靠。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述方法，其特征在于采用LC-MS數(shù)據(jù)處理軟件對水稻種子樣本的代謝輪廓譜進(jìn)行峰提取，峰匹配后形成一個EXCEL數(shù)據(jù)矩陣；將數(shù)據(jù)矩陣中的變量進(jìn)行缺失值處理，然后將在QC樣本中RSD大于25%的變量刪除，接下來利用偏最小二乘一判別分析(PLS-DA)方法對數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行整體分析，對轉(zhuǎn)基因水稻以及非轉(zhuǎn)基因水稻的代謝指紋數(shù)據(jù)進(jìn)行建模；根據(jù)模型中的變量重要性因子篩選對分類有重要貢獻(xiàn)的10個或10個以上的檢測離子，這些檢測離子對應(yīng)的代謝物可被認(rèn)為是在轉(zhuǎn)基因水稻及其對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因水稻分類中起重要作用的化合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述方法，其特征在于對篩選出的化合物進(jìn)行t檢驗(yàn)；然后對重要化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻代謝輪廓分析及代謝差異研究的方法，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對水稻種子提取物進(jìn)行分析得到水稻代謝輪廓譜，然后用多變量統(tǒng)計(jì)方法研究轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻的代謝輪廓數(shù)據(jù)的整體差異，并發(fā)現(xiàn)對代謝表型差異有重要貢獻(xiàn)的化合物，為轉(zhuǎn)基因水稻的非預(yù)期效應(yīng)和安全性評價提供依據(jù)。本發(fā)明的分析方法簡單，快速，重復(fù)性好，適合于實(shí)際樣品的批量分析。
文檔編號G01N30/88GK102478563SQ20101055902
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月25日
發(fā)明者周佳, 常玉瑋, 許國旺, 趙春霞, 趙燕妮, 路鑫 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所