本發(fā)明涉及生物技術和植物育種技術領域，具體地說，涉及一種水稻轉(zhuǎn)基因創(chuàng)制細胞質(zhì)雄性不育系的方法。

背景技術：

水稻細胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic Male Sterility，CMS)種質(zhì)創(chuàng)新是雜種優(yōu)勢利用的基礎。目前，在生產(chǎn)上利用的水稻雄性不育種質(zhì)資源主要是從自然界發(fā)現(xiàn)的突變體或遠緣雜交后代產(chǎn)生，由此選育出的細胞質(zhì)雄性不育系均為細胞質(zhì)和細胞核源于不同類型或不同品種的質(zhì)核異源細胞質(zhì)雄性不育系，尚未見到選育出細胞質(zhì)和細胞核均源于同一品種(系)的質(zhì)核同源雄性不育系的報道。而且，由于自然CMS種質(zhì)有限，遠緣雜交難以成功以及細胞質(zhì)母性遺傳等因素，又限制了雜交種產(chǎn)量的持續(xù)提高，并存在單一細胞質(zhì)雜交種大面積推廣存在的某一生理小種大范圍存在的風險。由于轉(zhuǎn)基因具有不受物種限制的特點，而且栽培品種的細胞質(zhì)資源比一般野生種資源豐富，若能將栽培品種細胞質(zhì)的遺傳多樣性和轉(zhuǎn)基因技術相結(jié)合選育CMS系，將極大地擴大CMS的細胞質(zhì)來源。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種水稻轉(zhuǎn)基因創(chuàng)制細胞質(zhì)雄性不育系的方法，可同時選育出質(zhì)核異源和質(zhì)核同源細胞質(zhì)雄性不育系。

本發(fā)明人長期致力于植物雄性不育種質(zhì)創(chuàng)新及其分子基礎的研究工作。2008年，由周瑞陽教授指導的博士研究生李剛采用同重標簽相對定量與絕對定量(簡稱iTRAQ)技術分析了紅麻雄性不育系和保持系花藥線粒體蛋白質(zhì)組差異，發(fā)現(xiàn)了一個差異表達的PDIL(protein disulfide isomerase-like，類蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶，縮寫為“PDIL”)蛋白。該蛋白質(zhì)部分氨基酸殘基的同源序列比對結(jié)果表明，其與AtPDIL5-2、OsPDIL5-2和OsPDIL5-3直系同源。2010年，由周瑞陽教授指導的另一位博士研究生金剛在此基礎上，根據(jù)GenBank中公布的OsPDIL5-2、OsPDIL5-3、AtPDIL5-2及其他同源基因的cDNA序列，基于同源克隆和RACE技術，克隆了兩個紅麻PDIL同源基因，并通過全長cDNA的擴增加以驗證。兩個基因分別命名為Hcpdil5-2a和Hcpdil5-2b，在NCBI基因數(shù)據(jù)庫中的登錄號分別為HQ638208和HQ898859。同時，這兩個基因在不育系開花期的不同組織器官的表達量存在差異，其中Hcpdil5-2a在各組織的表達均受到不育胞質(zhì)的影響，而其Hcpdil5-2b的表達僅在營養(yǎng)器官中受到不育胞質(zhì)的影響。說明Hcpdil5-2a可能與雄性不育有關。然而，與雄性不育相關基因的發(fā)現(xiàn)，與細胞質(zhì)雄性不育系的創(chuàng)制是兩個截然不同的問題。

經(jīng)過多年研究，本發(fā)明人采用花粉管通道法轉(zhuǎn)紅麻非全長Hcpdil5-2a基因，成功創(chuàng)造出了水稻細胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)，繼而轉(zhuǎn)育成水稻細胞質(zhì)雄性不育系。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明水稻轉(zhuǎn)基因創(chuàng)制細胞質(zhì)雄性不育系的方法，包括以下步驟：

S1、重組表達載體PBI121-Hcpdil5-2a-GFP的構(gòu)建

將從紅麻中克隆獲得的Hcpdil5-2a基因非全長CDS序列插入到PBI121-GFP載體的Xba I和Kpn I酶切位點之間，即構(gòu)建得到重組表達載體PBI121-Hcpdil5-2a-GFP；

S2、轉(zhuǎn)基因水稻植株的構(gòu)建

采用花粉管通道法將重組表達載體PBI121-Hcpdil5-2a-GFP導入水稻植株中，收獲轉(zhuǎn)基因水稻植株的T₀代種子；

S3、轉(zhuǎn)基因水稻細胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)資源的獲得

播種上述T₀代種子獲得T₁代植株，于開花期調(diào)查T₁代植株育性，選擇雄性不育株，作為水稻細胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)資源；

S4、水稻轉(zhuǎn)基因細胞質(zhì)雄性不育系的選育

(1)轉(zhuǎn)基因質(zhì)核同源細胞質(zhì)雄性不育系的選育方法之一：以上述轉(zhuǎn)基因雄性不育種質(zhì)資源為母本，以其野生型非轉(zhuǎn)基因品種或品系回交，成熟期收獲T₁代種子，然后播種，觀察T₂代植株育性，如果仍表現(xiàn)為雄性不育，表明其為細胞質(zhì)遺傳的雄性不育，繼續(xù)與原回交親本進行核置換飽和回交所得的雄性不育系，即為質(zhì)核同源細胞質(zhì)雄性不育系，其野生型非轉(zhuǎn)基因品種或品系即為該不育系的保持系；

(2)轉(zhuǎn)基因質(zhì)核同源細胞質(zhì)雄性不育系的選育方法之二：以轉(zhuǎn)基因質(zhì)核異源細胞質(zhì)雄性不育系選育過程中任一世代的雄性不育株為母本，與不育株原始來源相同的野生型非轉(zhuǎn)基因品種或品系雜交，并與該親本進行核置換回交，由此選育出的雄性不育系，也屬于質(zhì)核同源細胞質(zhì)雄性不育系，其輪回親本即為該不育系的保持系；

(3)轉(zhuǎn)基因質(zhì)核異源細胞質(zhì)雄性不育系的選育：以上述轉(zhuǎn)基因雄性不育種質(zhì)或轉(zhuǎn)基因質(zhì)核同源細胞質(zhì)雄性不育系選育過程中任一世代的雄性不育株為母本，與其異源保持系或常規(guī)品種或品系雜交，并與回交親本進行核置換回交，由此選育出的雄性不育系，即為質(zhì)核異源細胞質(zhì)雄性不育系，其輪回親本即為該不育系的保持系。

本發(fā)明中，所述異源保持系是指與轉(zhuǎn)基因材料沒有親緣關系的雄性不育保持系或常規(guī)品種(系)。

本發(fā)明中，同源保持系是指與轉(zhuǎn)基因材料為同一來源的非轉(zhuǎn)基因野生型保持系或品種(系)。

本發(fā)明中，所述紅麻Hcpdil5-2a基因非全長CDS序列為：

i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個核苷酸且表達相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或

iii)在嚴格條件下與SEQ ID NO:1所示序列雜交且表達相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述嚴格條件為在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下雜交，并用該溶液洗膜；或

iv)與i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表達相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列。

前述的方法，步驟S2具體如下：

S21、選擇受體材料：選擇生長健壯、無病蟲害的水稻保持系植株；

S22、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：在開花時期的晴天上午，選取當天已經(jīng)開花授粉的穎花，用剪刀剪掉一半左右的穎殼，減掉柱頭后，用微量注射器吸取PBI121-Hcpdil5-2a-GFP質(zhì)粒溶液，每次注射質(zhì)粒直至將剩余一半穎殼裝滿，然后用雜交袋套好；

S23、收獲：待上述注入PBI121-Hcpdil5-2a-GFP質(zhì)粒的水稻植株果實成熟后，收集的種子即為T₀代種子。

在本發(fā)明中，所述核置換回交的回交世代數(shù)不低于5-6代。

本發(fā)明所述水稻保持系包括但不限于水稻保持系M2B等。所述異源保持系選自以下水稻雄性不育保持系：中九B、內(nèi)香B等。

本發(fā)明采用轉(zhuǎn)基因方法成功創(chuàng)造出了轉(zhuǎn)基因水稻細胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)，繼而與同源或異源保持系進行核置換回交，選育出了質(zhì)核同源和異源的雄性不育系。

本發(fā)明以栽培品種為轉(zhuǎn)基因供體，由此選育的雄性不育系為栽培品種細胞質(zhì)雄性不育系。由于栽培種的進化程度高于野生種，有利基因多，因此，利用栽培品種細胞質(zhì)雄性不育系有利于組配出制強優(yōu)勢組合；同時，也避免了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上由于單一細胞質(zhì)雜交種的大面積推廣和長期利用可能導致的某一病害大流行的潛在風險。按照本發(fā)明方法選育的細胞質(zhì)雄性不育系，經(jīng)分子生物學鑒定表明，不含轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒載體，與非轉(zhuǎn)基因植物無異，不存在安全風險和市場風險，具有極為廣闊的應用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明重組表達載體PBI121-Hcpdil5-2a-GFP的構(gòu)建流程示意圖。

圖2為本發(fā)明實施例6中水稻轉(zhuǎn)非全長Hcpdil5-2a基因創(chuàng)制細胞質(zhì)雄性不育系的技術路線圖。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

實施例1紅麻Hcpdil5-2a基因非全長CDS序列的獲得

紅麻Hcpdil5-2a基因非全長CDS序列為963bp(構(gòu)建載體去掉終止密碼子后長度為960bp)，為全長序列的一部分。紅麻Hcpdil5-2a基因CDS全長序列為1521bp，兩者相差558bp。具體序列見SEQ ID NO:1。

Hcpdil5-2a基因非全長CDS序列的擴增方法如下：

提取紅麻發(fā)育花藥中總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈；然后根據(jù)cDNA序列設計帶有酶切位點Xba I、Kpn I特異引物對Hcpdil5-2a-TY，通過RT-PCR方法擴增紅麻Hcpdil5-2a基因非全長CDS序列。

所述特異引物對為Hcpdil5-2a-TY：

正向引物5’-TCTAGAATGTTGCTGTTCTCGATCTTGA-3’

反向引物5’-GGTACCTCAATCTTCTTTCTTCTCAGGTCTA-3’

PCR反應體系如下：

反應體系用雙蒸水補足至總體積20μl。

其中，PCR反應條件為：94℃預變性3min；94℃30s，51.7℃30s，72℃1min30s，30個循環(huán)；72℃終延伸10min。

利用天根凝膠回收試劑盒回收上述片段后，將其連入PMD-19T(simple)載體(購自寶生物工程有限公司)中，構(gòu)建成測序中間載體，稱為非全長pHcpdil5-2a，然后用該載體進行基因擴增和酶切驗證，最后進行序列測定，驗證克隆序列的正確性。

實施例2重組表達載體PBI121-Hcpdil5-2a-GFP的構(gòu)建

本實施例中，重組表達載體PBI121-Hcpdil5-2a-GFP由紅麻非全長基因Hcpdil5-2a的開放閱讀框序列與植物表達載體PBI121構(gòu)成。

具體方法如下：將上述獲得的含有非全長Hcpdil5-2a編碼區(qū)cDNA的pHcpdil5-2a中間測序載體經(jīng)過Xba I和Kpn I雙酶切后獲得帶有酶切粘性末端的Hcpdil5-2a基因CDS序列片段。PBI121-GFP載體也用同樣的Xba I和Kpn I雙酶切，回收帶有CaMV35S啟動子的載體片段。將Hcpdil5-2a基因CDS序列片段與載體片段用連接酶連接，得到以CaMV35S啟動子驅(qū)動的紅麻非全長Hcpdil5-2a的植物超量表達載體，稱為PBI121-Hcpdil5-2a-GFP。超量表達載體的構(gòu)建流程見圖1。

實施例3重組表達載體PBI121-Hcpdil5-2a-GFP的導入

采用花粉管通道法進行，具體步驟如下：

(1)選擇受體材料：選擇生長健壯、無病蟲害的水稻保持系或常規(guī)品種(系)植株。

(2)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：在開花時期的晴天上午，選取當天已經(jīng)開花授粉的穎花，用剪刀剪掉一半左右的穎殼，減掉柱頭后，用25μl微量注射器吸取PBI121-Hcpdil5-2a-GFP質(zhì)粒溶液，質(zhì)粒濃度為10ng/μl，每次注射質(zhì)粒直至可以將剩余一半穎殼裝滿，然后用雜交袋套好。

(3)收獲：待上述注射PBI121-Hcpdil5-2a-GFP質(zhì)粒的水稻植株果實自然成熟后，單株上的同類種子合并編號，即獲得T₀代種子。

實施例4轉(zhuǎn)基因水稻細胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)資源的獲得

播種上述T₀代即獲得T₁代植株，于開花期調(diào)查T₁代植株育性，計算雄性不育株與總植株數(shù)的比率，由此可直接獲得水稻細胞質(zhì)雄性不育種質(zhì)資源。

實施例5水稻轉(zhuǎn)基因細胞質(zhì)雄性不育系的選育

對于實施例4中選出的雄性不育株當季用其野生型可育植株進行回交，成熟期收獲T₁代種子。然后播種，觀察T₂代植株育性，發(fā)現(xiàn)仍表現(xiàn)為雄性不育，于是推斷其為細胞質(zhì)雄性不育類型(CMS)，并將其命名為M2BS。

2012年9-10月，對16個保持系材料進行花粉管通道法轉(zhuǎn)基因，一共收獲724粒種子，當年冬季南繁在海南種植觀察育性變化，結(jié)果在保持系1159(M2B)中發(fā)現(xiàn)了雄性不育株。在發(fā)現(xiàn)不育株后，立即用野生型(M2B)與之雜交，收獲雜交種BC₁代后，2013年7月在南寧播種觀察育性，其雜交后代全部表現(xiàn)不育；2013年10月繼續(xù)觀察BC₂代和F1代(與父本289，290雜交)育性，其表現(xiàn)仍為不育，由此初步斷定此不育株系為CMS類型。然后分別在南寧、陵水兩地播種、連續(xù)回交，進行雜交后代育性鑒定與不育系的選育，回交不低于5～6代。

實施例6水稻轉(zhuǎn)基因細胞質(zhì)雄性不育系選育方法的具體應用

2011年9-10月，以水稻雄性不育保持系M2B(由‘博B’與‘中浙優(yōu)1號’雜交F₅代選育而成的雄性不育保持系。其中，‘博B’為雄性不育系“博A”的保持系，由廣西大學莫永生研究員提供；‘中浙優(yōu)1號’為市售獲得)為材料，按照本發(fā)明的方法，于開花期用微量注射器將事先制備好的含有非全長Hcpdil5-2a基因CDS序列片段的重組表達載體PBI121-Hcpdil5-2a-GFP注入供試材料穎花中。2012年4月，在海南冬繁的T₁代群體中發(fā)現(xiàn)3株雄性不育株，命名為M2BS。在發(fā)現(xiàn)不育株后，立即用其野生型(M2B)與之雜交，收獲雜交種BC₁代后，2012年7月在南寧播種，以觀察育性。發(fā)現(xiàn)其雜交后代全部表現(xiàn)不育，當季用非轉(zhuǎn)基因的M2B與其回交，至2015年10月已回交6代。因其質(zhì)核均源于M2B，且為轉(zhuǎn)非全長Hcpdil5-2a所得，故命名為轉(zhuǎn)基因質(zhì)核同源雄性不育系HM2A,其輪回親本M2B為其保持系HM2B。

在選育質(zhì)核同源雄性不育系的同時，于2012年同時與2個異源保持系中九B(中九B為不育系‘中九A’的保持系，由中國農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所于上世紀90年代選育而成，是水稻育種的常用材料)和內(nèi)香B(內(nèi)香B為不育系‘內(nèi)香A’的保持系，見：曹立勇，肖培村，程式華，陳勇，占小登：內(nèi)香A系列不育系的種質(zhì)創(chuàng)新及其應用，科技成果，中國水稻研究所；內(nèi)江雜交水稻科技開發(fā)中心)雜交，并進行核置換回交，于2016年選育出了質(zhì)核異源雄性不育系HZJA(H中九A)和HNXA(H內(nèi)香A)，其輪回親本‘中九B’和‘內(nèi)香B’即為其保持系。

利用載體骨架啟動子、終止子以及報告基因引物專利進行分子鑒定，結(jié)果表明，上述質(zhì)核同源雄性不育系和質(zhì)核異源雄性不育系中均未能檢測出載體質(zhì)粒。不存在轉(zhuǎn)基因安全風險。

分子鑒定的具體方法如下：

采用紅麻Hcpdil5-2a基因特異引物進行轉(zhuǎn)基因檢測，其引物序列為：

Hcpdil5-2a-F：5，-ATGGAGTTTCTATGGAGTATTCTGG-3，

Hcpdil5-2a-R：5，-TCAATCTTCTTTCTTCTCAGGTCTA-3，(Tm 51.5℃)；

反應體系10μl：gDNA 1μl(200ng)，10×PCR Buffer 1μl，dNTP(10mmol/L)0.2μl，引物(10μmol/L)0.3μl，Taq酶(5U/μl)0.1μl，ddH₂O 7.4μl。條件為：94℃預變性3min；94℃變性30s，退火30s，72℃延伸60s，共30個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

在雄性不育系的T₁世代中能檢測到目的基因。但由于用保持系連續(xù)回交5-6代后，轉(zhuǎn)基因植株的細胞核基本被替換掉，在高世代的不育系中檢測不到目的基因。

水稻轉(zhuǎn)非全長Hcpdil5-2a基因創(chuàng)制細胞質(zhì)雄性不育系的技術路線如圖2所示。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

序列表

<110> 廣西大學

<120> 水稻轉(zhuǎn)基因創(chuàng)制細胞質(zhì)雄性不育系的方法

<130> KHP161119327.4

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 963

<212> DNA

<213> 紅麻

<400> 1

atgcatggag tttctatgga gtattctgga cctaggaaag cagacttact tgttcaatat 60

ctgaagaaat tcgttgctcc tgatgtgtct attcttagtt cagactctgc catcaatgat 120

tttgttgaag cagccgggac tttctttcct atatacatag gttttggctt gaatgagaca 180

gtggtatcta atttagctgt taagtacaag aaaaaggcat ggttttctgt ggcaaaggat 240

ttctcagatg atgccatggt gttgtatgac tttgacaaag ttccttcttt ggtagcactt 300

catccgagtt ataagcagca aagtgttttc tatggccctt ttgaagatac atttttgggt 360

gattttataa aacaaaattt gctccctttg gtggtgccct tgaaccatga tacactgaag 420

ctattgaaag atgaggacag gaaaattgtt ctgacaatca tagctgatga gaatgaagac 480

caatcacaga acttgatcaa gttattgaga gctgctgctt ctgcaaaccg tgatttggta 540

tttagttatg ttggagttaa gcaatgggaa gactttgctg ataaatttga ggccaacgag 600

aagtcaaagt tgccaaaaat gattgtctgg aatggagatg tggagtactt atcggttgtt 660

ggcgttgaaa gccttgataa tgaagatcag gggtctcaga tctcacgttt cctcgaagga 720

tatagagaag gaagaacaga aagaaaaaca gttaaagggc catcatttat ggacttcatc 780

cattcactaa tcggtatcag aagtgtctac ataattgtct ttattgttgc aataatgatg 840

cttatacaaa gcattgggaa agaagacgaa tctgtcaggg atggcagtcg tggtgcagtt 900

gatggtgccg agagcttcgg ggctgaaagc agtcggtata gacctgagaa gaaagaagat 960

tga 963