專利名稱：一種檢測(cè)血液中游離大腸癌細(xì)胞標(biāo)志物的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)試劑盒及復(fù)合的檢測(cè)技術(shù)，具體地說是一種準(zhǔn)確性高的從血液中檢測(cè)大腸癌細(xì)胞(惡性腫瘤細(xì)胞)的檢測(cè)技術(shù)和試劑盒，特別是能夠分離和提取并鑒定放、化療治療后殘存在患者血液中的游離大腸癌細(xì)胞的檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
大腸癌作為一種惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，其對(duì)人類的危害也是不言喻的。大腸癌腫瘤的早期檢測(cè)和篩查以及腫瘤化療后的預(yù)后及療效的分析和預(yù)測(cè)，對(duì)于大腸癌的治療具有相當(dāng)重要的指導(dǎo)意義。惡性腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞是一種維持和可擴(kuò)散的惡性腫瘤細(xì)胞。盡管許多科學(xué)家認(rèn)為腫瘤細(xì)胞是不死的，即它們可以毫無限制的分裂和生長(zhǎng)，但大部分腫瘤細(xì)胞在分裂一定次數(shù)后還是死亡了。腫瘤干細(xì)胞的假說認(rèn)為，惡性腫瘤本身可能不會(huì)死亡，因其有腫瘤干細(xì)胞的補(bǔ)給，而腫瘤干細(xì)胞是一小類特別危險(xiǎn)的細(xì)胞，它們甚至在產(chǎn)生出更多細(xì)胞構(gòu)成腫瘤主體的時(shí)候，仍能通過分裂而自我更新。更糟糕和可怕的是，腫瘤干細(xì)胞可能不受大多數(shù)現(xiàn)有的腫瘤治療方案和治療方法的影響，即通常所說的對(duì)腫瘤干細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療、放射治療以及部分生物工程的治療方法不敏感。眾所周知的科學(xué)知識(shí)告訴大家，惡性腫瘤的患者通常是在經(jīng)過確診、手術(shù)或其它有效治療的過程。但往往在經(jīng)過放、化療的治療后，患者通常會(huì)發(fā)生腫瘤全身轉(zhuǎn)移的狀況，發(fā)生多個(gè)器官的腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。對(duì)腫瘤患者醫(yī)學(xué)上通常會(huì)用5年存活率的指標(biāo)來進(jìn)行評(píng)判，很形象的說明了腫瘤嚴(yán)重的威脅了人類生存的狀況。從醫(yī)學(xué)的角度來講，腫瘤的可怕性是在于經(jīng)過化學(xué)療法和放射療法后，雖然放化療常常會(huì)摧毀腫瘤的大部分，可是確不能殺死全部的腫瘤細(xì)胞，當(dāng)然也包括沒有完全殺死腫瘤干細(xì)胞。未被殺死的腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞，將會(huì)死灰復(fù)燃。由于他們是腫瘤細(xì)胞，在他們“身上”具有獨(dú)特的分子標(biāo)記或生物標(biāo)記(biomarker)。在目前的治療手段中，通常考慮的是化學(xué)與物理治療的手段為什么能夠殺死絕大部分的腫瘤細(xì)胞而不能同時(shí)殺死全部的腫瘤細(xì)胞？這其中涉及到了兩個(gè)方面的原因。第一、腫瘤細(xì)胞方面由于腫瘤通常是由腫瘤組織細(xì)胞和腫瘤組織干細(xì)胞組成，在現(xiàn)有的治療手段中，相對(duì)殺死腫瘤組織細(xì)胞的概率會(huì)較高，對(duì)殺死腫瘤組織干細(xì)胞的概率會(huì)較低，而腫瘤組織干細(xì)胞又有較強(qiáng)的分裂能力，實(shí)際上我們可以理解為沒有從“根上”殺死，所以可以發(fā)生“死灰復(fù)燃”。另一方面，腫瘤組織細(xì)胞和腫瘤組織干細(xì)胞具有很強(qiáng)的適應(yīng)與應(yīng)變能力，他們將會(huì)產(chǎn)生一種“耐藥蛋白”來防止化學(xué)與物理的手段對(duì)他們的損傷。第二、采取的化學(xué)與物理手段對(duì)腫瘤細(xì)胞沒有治療上的特異性。換句話說，就是在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也在對(duì)體內(nèi)正常的細(xì)胞進(jìn)行殺傷，往往由于追求大劑量才能殺死腫瘤細(xì)胞而采用大劑量的治療，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)腫瘤患者沒有死于腫瘤疾病，而是死于化、物療對(duì)機(jī)體全身正常組織的毒性，致使機(jī)體的正常組織功能衰竭而亡。由此，也經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)機(jī)體的強(qiáng)烈的防御反應(yīng)，諸如惡心嘔吐、白細(xì)胞的極度低下、甚至直接影響到呼吸和循環(huán)組織功能的衰竭等等，迫使患者2/7頁
不得不放棄腫瘤的放化療的治療，腫瘤細(xì)胞得以泛濫，最終發(fā)生腫瘤的廣泛轉(zhuǎn)移而影響到生存。簡(jiǎn)單的總結(jié)一下，在目前的腫瘤治療時(shí)刻，面臨主要困難和經(jīng)常遇到的問題有使用放化療的劑量、多長(zhǎng)時(shí)間或是否仍需要持續(xù)性的進(jìn)行放化療治療、放化療后是否還有未被殺死的腫瘤細(xì)胞等。就目前開展的工作來看，根據(jù)臨床的工作經(jīng)驗(yàn)，研究和檢測(cè)主要的工作重點(diǎn)是檢測(cè)血液中的腫瘤標(biāo)記物(蛋白標(biāo)記物)，但檢測(cè)血液中的腫瘤標(biāo)記物存在著微量檢測(cè)準(zhǔn)確性差、血液中存在著多種蛋白檢測(cè)的特異性差、檢測(cè)到后確定量效關(guān)系困難、干擾因素多等缺陷，在現(xiàn)有的對(duì)已發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)記物的檢測(cè)使不能解決上述的放化療存在的不能解決的問題，對(duì)腫瘤的治療的療效的判斷和對(duì)正常組織細(xì)胞的損傷的判斷都是無法通過檢測(cè)血液中的腫瘤蛋白標(biāo)記物的檢測(cè)能夠解決，我們現(xiàn)在提出的方法和提供的檢測(cè)試劑盒主要是針對(duì)檢測(cè)血液中的游離的腫瘤細(xì)胞，只有判斷出血液中是否還有游離的腫瘤細(xì)胞，如果能夠得到血液中游離的腫瘤細(xì)胞，可以說明體內(nèi)尚存有未被殺死的腫瘤細(xì)胞。干細(xì)胞是具有自我更新、無限增殖及多向分化能力的細(xì)胞群體。最近越來越多的證據(jù)顯示，腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞株中的細(xì)胞存在著等級(jí)性，即存在著不同分化階段的細(xì)胞，這些細(xì)胞在性質(zhì)及功能上存在著諸多差異，其中有一部分的腫瘤細(xì)胞充當(dāng)干細(xì)胞的角色，在啟動(dòng)腫瘤形成和維持腫瘤生長(zhǎng)中起決定性作用，被命名為腫瘤干細(xì)胞(cancer stemcells，CSC)。大腸癌腫瘤干細(xì)胞是一群未分化、具有自我更新、多系分化潛能的細(xì)胞?？梢圆捎枚喾N策略成功地分離出大腸癌干細(xì)胞。隨著大腸癌干細(xì)胞的成功分離以及體外的成功培養(yǎng)，對(duì)其生物學(xué)行為的認(rèn)識(shí)也逐漸深入?；煹挚剐浴⒎暖煹挚剐?、缺氧抵抗性、高致瘤性、高侵襲轉(zhuǎn)移性是這群細(xì)胞的特征，成為腫瘤難以根除、日后復(fù)發(fā)的一個(gè)重要原因。而大腸癌腫瘤干細(xì)胞相關(guān)的“侵襲性”基因信號(hào)(“ invasiveness”gene signature, IGS)與預(yù)后的關(guān)系令人矚目，具有重要的臨床指導(dǎo)意義。大腸癌腫瘤干細(xì)胞的自我更新、分化以及轉(zhuǎn)移等特性受到許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和微環(huán)境的調(diào)控。如何靶向治療大腸癌腫瘤干細(xì)胞，最終根治大腸癌，正逐漸成為腫瘤靶向治療研究的一個(gè)熱點(diǎn)。目前針對(duì)腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)試劑盒很多，一般是利用磁珠去檢測(cè)血液中大腸癌標(biāo)志物的含量，以判斷被檢測(cè)者是否患有大腸癌。但是這種檢測(cè)方法非常不準(zhǔn)確。我們知道腫瘤標(biāo)記物含量的增加有可能是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞的分泌，也有可能是其他應(yīng)激反應(yīng)等因素造成該標(biāo)志物蛋白含量增加，因此即使檢測(cè)到腫瘤標(biāo)志物含量增加也不能準(zhǔn)確判斷血液中是否真的存在腫瘤細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞。面對(duì)這些問題，本領(lǐng)域技術(shù)人員通常的做法是將多個(gè)腫瘤標(biāo)志物結(jié)合檢測(cè)，用以增加檢測(cè)的準(zhǔn)確性，但是檢測(cè)成本非常高，普通患者很難接受。另外即使結(jié)合檢測(cè)，也不能斷定該檢測(cè)就一定準(zhǔn)確。綜上所述，目前本領(lǐng)域急需一種能夠準(zhǔn)確檢測(cè)外周血中游離腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物含量的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可以準(zhǔn)確檢測(cè)血液中游離大腸癌細(xì)胞標(biāo)志物的試劑盒，該檢測(cè)結(jié)果對(duì)大腸癌治療方案的選擇和預(yù)后具有重要指導(dǎo)意義。本發(fā)明的發(fā)明思路為制備攜帶有與大腸癌腫瘤細(xì)胞表面抗原結(jié)合的抗體的磁珠，利用該磁珠將外周血中的大腸癌細(xì)胞分離出來，通過檢測(cè)分離得到的腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志物GA733、CEA和EGFR的表達(dá)水平來判斷該細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞。進(jìn)而確定大腸
4癌發(fā)展及轉(zhuǎn)歸，指導(dǎo)醫(yī)生對(duì)患者預(yù)后治療方案的選擇，對(duì)于腫瘤的個(gè)性化治療具有重要的實(shí)際意義。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案
第一步從循環(huán)血中分離出大腸癌腫瘤干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞混合細(xì)胞，如圖1所示，攜帶有大腸癌抗體的磁珠與大腸癌細(xì)胞結(jié)合，將其從循環(huán)血中分離出來。第二步將分離到的大腸癌腫瘤干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分離。第三步采用分子生物學(xué)的方法，對(duì)第二步分離的腫瘤干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞進(jìn)行鑒定，確定腫瘤細(xì)胞的性質(zhì)。一種檢測(cè)大腸癌標(biāo)志物的試劑盒，所述試劑盒組分如下
磁珠處理液、帶有大腸癌抗體的磁珠、10 X緩沖液4.0 5.0ml、dNIPs 4.0 5. 0ml、 反轉(zhuǎn)錄酶2. 0 3. 0ml、RNA酶抑制劑40 u/ml 0. 4 0. 6 ml、10 X熱啟動(dòng)PCR混合液 20. 0 30. 0 ml、PCR專用ddH20 10. 0 15. 0ml、大腸癌標(biāo)志物引物3. 0 5. 0ml。所述大腸癌標(biāo)志物為GA733-2、CEA和EGFR中的一種或多種。所述抗體為抗BerEP4單克隆抗體，抗cytokeratin單克隆抗體和抗CK20單克隆抗體中的一種或多種。所述PCR引物序列為，見表1
本發(fā)明試劑盒主要用途為用于大腸癌標(biāo)志物的檢測(cè)中，具體使用方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知內(nèi)容。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果是
1、本發(fā)明為檢測(cè)血液中殘存的大腸癌腫瘤細(xì)胞提供一個(gè)非?？煽康姆椒ǎ槐景l(fā)明首先利用磁珠將大腸癌腫瘤細(xì)胞分離出來，然后針對(duì)分離出的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，準(zhǔn)確性可達(dá)
100% O2、本發(fā)明為大腸癌治療一一即化療和放療的療效提供具體的可靠的觀察數(shù)據(jù)。針對(duì)檢測(cè)分離得到的大腸癌腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物的含量來確定所檢測(cè)的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞還是腫瘤干細(xì)胞。為預(yù)后方案的選擇和治療方案的選擇提供了有力的數(shù)據(jù)支持。3、本發(fā)明主要針對(duì)大腸癌患者治療后的監(jiān)測(cè)，為大腸癌治療后是否復(fù)發(fā)及治療效果如何提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。以上本發(fā)明內(nèi)容部分已對(duì)本發(fā)明做了充分的說明，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，本實(shí)施方式僅是本發(fā)明最佳實(shí)施方式，并非對(duì)本發(fā)明的限定。


圖1為包被有抗體的磁珠從血液中分離腫瘤細(xì)胞的示意圖。圖2為采用Agilent生物分析儀對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析實(shí)例。圖3為采用普通電泳的方法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析實(shí)例。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1磁珠的制備
抗體免疫磁珠的制備使用的抗體為抗BerEP4單克隆抗體、抗cytokeratin單克隆抗體和抗CK20單克隆抗體。本試劑盒采用分別標(biāo)記上述3種抗體然后將它們混合使用。方法采用 invitrogen 公司生產(chǎn)的 Dynabeads Antibody Coupling Kit。標(biāo)記的方法嚴(yán)格按照生產(chǎn)商的說明書進(jìn)行。實(shí)施例2大腸癌細(xì)胞的分離
1.樣品采集
采集大腸癌患者5 7. 5 ml外周血，EDTA抗凝，4hr之內(nèi)使用(或4度保存48hr內(nèi)使用)。2.選擇磁珠
2.1磁珠的處理
混均磁珠，使用移液器輕輕的吹吸，不能用混旋儀；
采用PBS緩沖液清洗，清洗時(shí)，不能碰觸微球；
吸取比所需樣品量多一些的磁珠微球加入1. 5 ml的離心管管中；
放在磁鐵上，1分鐘，棄去上清；
用Iml PBS，清洗3次，用于清除防腐劑；
移去上清；
吸取和原有體積相同的IOOul含有PBS的微球。
2. 2腫瘤細(xì)胞的選擇
將5毫升外周血放入15毫升錐形離心管中；
加入100 mL步驟2. 1制備的大腸癌選擇磁珠；
在搖床上孵育15 30分鐘。2. 3將15ml的錐形離心管插入磁鐵架中，3分鐘后收集磁珠到試管中。2. 4去除不要的細(xì)胞
在MPC-L中加磁3分鐘；
用10毫升吸管移去上清。
· 加5毫升PBS振搖。2. 5取1毫升帶有細(xì)胞的PBS，轉(zhuǎn)到1. 5毫升管中。2. 6 溶解
去除上清(PBS)；
取出磁鐵；
加200μ1溶解/結(jié)合液，用加樣器上下吹吸5次以重新混懸；
在這一步中細(xì)胞溶解，mRNA釋放到上清中；
將磁鐵放回磁鐵架上繼續(xù)孵育；
將上清移到新EP管中；
將含有大腸癌選擇磁珠的管棄去。2. 7大腸癌選擇步驟結(jié)束
接大腸癌檢測(cè)部分或_20°C儲(chǔ)存mRNA最長(zhǎng)1周，長(zhǎng)期儲(chǔ)存采用-70°C。實(shí)施例3大腸癌細(xì)胞腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè) 3. 1試劑盒準(zhǔn)備
將試管放在室溫下；
將試劑盒中的RNase-free水放室溫；
將試管上述含有上清的離心管管放在冰上；
準(zhǔn)備磁珠。3. 2準(zhǔn)備寡核苷酸
取適量的帶有寡核苷酸Oligo (dT)的磁珠(建議不要用混懸儀混勻，手工混
懸)；
轉(zhuǎn)移至1. 5ml管中；
采用裂解/結(jié)合緩沖液中沖洗2次。3. 3將mRNA結(jié)合磁珠上
加20μ1磁珠在每個(gè)細(xì)胞溶解樣本中；
孵育10分鐘。3.4 純化 mRNA
采用緩沖液清洗2次；
再用緩沖液清洗2次磁珠；
再用100 μ Tris-HCl緩沖液清洗一次；
用29. 5 μ 純凈水懸浮磁珠。3. 5 mRNA 解鏈
50 0C水浴中孵育5 min ；
冰上放置2 min。3.6反轉(zhuǎn)錄，見表2 表2反轉(zhuǎn)錄步驟
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)血液中游離大腸癌細(xì)胞標(biāo)志物的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒組分如下磁珠處理液；帶有大腸癌抗體的磁珠；10 X緩沖液4. 0 5. Oml ；dNTPs 4. 0 ~ 5. Oml ；反轉(zhuǎn)錄酶2. 0 3. Oml ；RNA 酶抑制劑 40 u/ml 0. 4 0. 6ml ；10 X熱啟動(dòng)PCR混合液20. 0 30. Oml ；ddH20 10. 0 15. Oml ；大腸癌標(biāo)志物引物3. 0 5. Oml0
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述大腸癌標(biāo)志物為GA733-2、CEA和EGFR中的一種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述GA733-2引物序列為上游 5，to 3' GTTCGGGCTTCTGCTTGC下游 5，to 3’ CACATGGAGGTGCCGTTG。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述CEA引物序列為上游 5，to3， GGTGCTTCTACTTGTCCAC下游 5，to3， GTCCGTTGCCTTCTTCATT。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述EGFR引物序列為上游 5，to3， GGATGCCGACGAGTACCTC下游 5’ to3’ AGCTTTGCAGCCCATTTCT。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述大腸癌抗體為抗Ber-EP4單克隆抗體，抗cytokeratin單克隆抗體和抗CK20單克隆抗體中的一種或多種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)大腸癌標(biāo)志物的試劑盒，所述試劑盒組分如下磁珠處理液、磁珠、10X緩沖液4.0ml、dNTPs4.0ml、反轉(zhuǎn)錄酶2.0ml、RNA酶抑制劑40u/ml0.5ml、10X熱啟動(dòng)PCR混合液25.0ml、PCR專用ddH2O13.0ml、引物4.0ml。本發(fā)明較之現(xiàn)有方法更能準(zhǔn)確的檢測(cè)到外周血中的大腸癌標(biāo)志物，對(duì)大腸癌預(yù)后方案選擇及治療方案選擇提供了重要的指導(dǎo)意義。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102565404SQ20101060604
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月24日
發(fā)明者牛剛, 譚煥然 申請(qǐng)人:牛剛, 譚煥然