專利名稱：一種硫酸依替米星新的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高效液相色譜分析方法，具體涉及一種基于柱前衍生化法，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為分離填料的測定硫酸依替米星及其制劑的含量及有關(guān)物質(zhì)的分析方法。
背景技術(shù)：
硫酸依替米星是我國獨立開發(fā)的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的半合成氨基糖苷類抗生素， 因為其具有抗菌譜廣，耳腎毒性低，耐藥性低等優(yōu)點，而廣泛應(yīng)用于臨床。長期以來，硫酸依替米星因為只有紫外吸收末端吸收難以用紫外檢測器進(jìn)行測定，所以只能通過生物效價法、旋光法等方法測定含量及有關(guān)物質(zhì)。這些方法操作繁瑣且準(zhǔn)確度和可信度較低。目前已有通用型檢測器對硫酸依替米星含量測定的一些研究，通用型檢測器如示差折光檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器雖然在依替米星含量測定上有優(yōu)勢，但由于它們靈敏度低專屬性差， 重現(xiàn)性差，在依替米星有關(guān)物質(zhì)測定上往往達(dá)不到滿意的效果，而控制有關(guān)物質(zhì)的量是硫酸依替米星質(zhì)量控制的關(guān)鍵。也有文獻(xiàn)報道過用柱前衍生化測定氨基糖苷類抗生素，但分離度達(dá)不到要求，衍生化試劑也各不相同，衍生化效率低。因此發(fā)明一種衍生化效率高、分離高效的能使用常規(guī)紫外可見光檢測的分析方法，用于硫酸依替米星及其制劑的含量及有關(guān)物質(zhì)檢測，對于硫酸依替米星的生產(chǎn)和工藝開發(fā)都有非常積極的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是研究開發(fā)一種能對硫酸依替米星及其制劑的含量測定和有關(guān)物質(zhì)測定的分析方法。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下一種基于柱前衍生化的硫酸依替米星及其制劑的含量及有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜分析檢測方法，其特點在于使用OPA溶液作為衍生化試劑， 3(T60°C避光水浴反應(yīng)15 20min后，用高效液相色譜紫外-可見光檢測器分析，具體高效液相色譜條件和參數(shù)為
1、有機相與水相的體積比為陽巧5 :45 25，有機相為甲醇或乙腈，水相為25%冰醋酸。2、水相含離子對試劑庚烷磺酸鈉0. OIM^O. 03M,以氨水或醋酸銨調(diào)節(jié)pH范圍為 2. 5 3. 5 ；
3、流速為0.5 1. Oml/min ；進(jìn)樣量為10 20 μ 1 ；
4、檢測器為常規(guī)紫外-可見光檢測器，檢測波長為33(T350nm。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點和效果如下
1、本發(fā)明使用OPA溶液作為柱前衍生化試劑，并控溫避光水浴，衍生化效率高，反應(yīng)時間短。2、本發(fā)明通過以氨水或醋酸銨調(diào)節(jié)pH，水相和有機相比例控制在55 75 :45 25使各雜質(zhì)和主峰分離度良好，分離時間較短，有利于在線高效分析檢測硫酸依替米星含量和有關(guān)物質(zhì)。3、本發(fā)明使用常規(guī)十八烷基硅烷鍵合硅膠填料色譜柱和紫外-可見光檢測器，具有分析簡便，耐用性好的優(yōu)點。4、本發(fā)明操作簡單，分離效果好，利于硫酸依替米星質(zhì)量控制和在線檢測，利于硫酸依替米星工藝開發(fā)和質(zhì)量提高。
具體實施方案實驗器材及試劑
1、實驗儀器
Agilent 1200 series, Chemstation 工作站
2、實驗試劑
硫酸依替米星原料、硫酸依替米星注射劑、硫酸依替米星氯化鈉大輸液(無錫濟(jì)民可信山禾藥業(yè))，依替米星對照品(中檢所)，甲醇(色譜純，Merck),乙腈(色譜純，Merck)，氨水 (分析純，國藥)，冰醋酸(分析純，國藥)，醋酸銨(分析純，國藥)，超純水(自制)。3、色譜條件
色譜柱填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠，粒徑壙ΙΟμπι，柱規(guī)格為 15(T250mmX4. 6 8. Omm。流動相甲醇或乙腈25%冰醋酸含0. OlM 0. 03M庚烷磺酸鈉(以氨水或醋酸銨調(diào)節(jié)PH范圍為2. 5^3. 5) =55 75 45^25 ；流速為0. 5^1. Oml/min ；進(jìn)樣量為 10^20 μ 1 ；檢測器為常規(guī)紫外-可見光檢測器，檢測波長為33(T350nm。4、樣品溶液配制
供試品溶液配制精密稱取或量取供試品(原料、注射液、大輸液)適量，用水配制成每 ml含依替米星0. 5mg的供試品，0. 22 μ m過濾，備用。對照品溶液配制精密稱取對照品適量，用水配制成每ml含依替米星0.5mg。5、衍生化反應(yīng)
OPA溶液配制取鄰苯二醛1. Og，加甲醇5ml與0. 4M硼酸溶液(pH10. 4) 95ml，振搖使溶解，加硫乙醇酸anl，以45%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至10. 4。衍生化反應(yīng)精密量取供試品溶液或水(作為空白)4ml置IOml量瓶中，分別加異丙醇2ml和OPA溶液1. Oml,以異丙醇稀釋至刻度，搖勻，3(T60°C避光水浴反應(yīng)15 20min。實施例1
色譜條件色譜柱Phenomenex Gemini NX (150 X 4. 6mm，5 μ m)，流動相甲醇25%冰醋酸(含0. 02M庚烷磺酸鈉，以氨水調(diào)pH至3. 0) =61 39，流速0. 8ml/min,進(jìn)樣量10 μ 1，檢測波長330nm，進(jìn)樣物質(zhì)供試品溶液與對照溶液。結(jié)果，依替米星及其有關(guān)物質(zhì)均達(dá)到基線分離。實施例2
色譜條件色譜柱Agilent Zorbax C18 (250 X 6. 6mm，4 μ m)，流動相乙腈25%冰醋酸 (含0. 03M庚烷磺酸鈉，以醋酸銨調(diào)pH至2. 5)=55 45，流速1. Oml/min,進(jìn)樣量15 μ 1，檢測波長335nm，進(jìn)樣物質(zhì)供試品溶液與對照溶液。結(jié)果，依替米星及其有關(guān)物質(zhì)均達(dá)到基線分離。實施例3色譜條件色譜柱Diamonsil C18 (150 X 5. Omm，10 μ m)，流動相乙腈25%冰醋酸(含 0. OlM庚烷磺酸鈉，以醋酸銨調(diào)pH至3. 5) =58:42，流速:0. 5ml/min，進(jìn)樣量20 μ 1，檢測波長340nm，進(jìn)樣物質(zhì)供試品溶液與對照溶液。結(jié)果，依替米星及其有關(guān)物質(zhì)均達(dá)到基線分
1 O 實施例4
色譜條件色譜柱 Agilent Eclipse XDB C18 (150X4. 6mm，8 μ m)，流動相甲醇25% 冰醋酸(含0. 03M庚烷磺酸鈉，以氨水調(diào)pH至2. 8)=70 30，流速:1. Oml/min,進(jìn)樣量20 μ 1， 檢測波長350nm，進(jìn)樣物質(zhì)供試品溶液與對照溶液。結(jié)果，依替米星及其有關(guān)物質(zhì)均達(dá)到基線分離。
權(quán)利要求
1.一種高效液相色譜法測定硫酸依替米星及其制劑含量和有關(guān)物質(zhì)的方法，其特征在于基于柱前衍生化法，以O(shè)PA為衍生化試劑，異丙醇為溶液，3(T60°C水浴避光加熱，反應(yīng)時間 15 20min。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述測定硫酸依替米星及其制劑含量和有關(guān)物質(zhì)的方法，其特征在于選用十八烷基硅烷鍵合硅膠填料色譜柱。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述測定硫酸依替米星及其制劑含量和有關(guān)物質(zhì)的方法， 其特征在于色譜條件為十八烷基硅烷鍵合硅膠填料色譜柱，粒徑Γιο μ m,柱規(guī)格為 150"250mmX4. 6 8. Omm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述測定硫酸依替米星及其制劑含量和有關(guān)物質(zhì)的方法，其特征在于流動相分為有機相和水相，有機相為甲醇或乙腈，水相為25%冰醋酸，其中有機相與水相的體積比為陽巧5 :45 25，等度或梯度洗脫。
5.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述測定硫酸依替米星及其制劑含量和有關(guān)物質(zhì)的方法， 其特征在于水相含離子對試劑庚烷磺酸鈉0. 01M 0. 03M，以氨水或醋酸銨調(diào)節(jié)pH范圍為 2 · 5 3 · 5 ο
6.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述測定硫酸依替米星及其制劑含量和有關(guān)物質(zhì)的方法，其特征在于流速為0. 5 1. Oml/min ；進(jìn)樣量為10^20 μ L·
7.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述測定硫酸依替米星及其制劑含量和有關(guān)物質(zhì)的方法，其特征在于檢測器為常規(guī)紫外-可見光檢測器，檢測波長為33(T350nm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測定硫酸依替米星原料及其制劑的含量和有關(guān)物質(zhì)的檢測方法。本發(fā)明采用柱前衍生化法，衍生化條件為取樣品適量濃度4ml加OPA溶液1ml以異丙醇稀釋至10ml，30~60℃水浴避光加熱，即得衍生化溶液。發(fā)明采用高效液相色譜法，色譜條件為十八烷基硅烷鍵合硅膠填料色譜柱，粒徑4~10μm，柱規(guī)格為150~250mm×4.6~8.0mm；流動相分為有機相和水相，其中有機相與水相的體積比為55~7545~25，有機相為甲醇或乙腈，水相為25%冰醋酸含離子對試劑庚烷磺酸鈉0.01M~0.03M，以氨水或醋酸銨調(diào)節(jié)pH范圍為2.5~3.5；流速為0.5~1.0ml/min；進(jìn)樣量為10~20μl；檢測器為常規(guī)紫外-可見光檢測器，檢測波長為330~350nm。本發(fā)明使用常規(guī)檢測器和高效液相色譜儀，可以實現(xiàn)在線檢測硫酸依替米星及其制劑的含量和有關(guān)物質(zhì)，方法簡便可行，準(zhǔn)確可靠。
文檔編號G01N30/02GK102565208SQ20101061036
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月29日
發(fā)明者楊春艷, 錢小燕, 陳環(huán) 申請人:無錫濟(jì)民可信山禾藥業(yè)股份有限公司, 江西濟(jì)民可信集團(tuán)有限公司