專利名稱：一種液滴陣列pcr芯片及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種實時定量PCR芯片及其熒光檢測系統(tǒng)，特別是涉及一種基于液滴陣列的PCR芯片和熒光成像檢測系統(tǒng)。
背景技術：
實時定量(反轉錄)聚合酶鏈式反應(以下簡稱qPCR或qRT-PCR)技術是以傳統(tǒng) PCR技術為基礎建立起來的一種可對原始核酸(包括DNA和RNA)模板拷貝數(shù)進行準確定量分析的一種現(xiàn)代分子生物學檢測技術。由于qPCR技術具有準確度高，線性范圍寬等優(yōu)勢， 因此，已經廣泛地用于分子診斷，疾病研究，臨床醫(yī)學等領域。qPCR技術通常遵循傳統(tǒng)PCR 的擴增原理，不同的是在每一個循環(huán)的退火或延伸階段進行實時定量檢測，而溶液中模板的原始拷貝數(shù)的對數(shù)與檢測閾值(Ct)存在線性關系。在過去的十幾年間，傳統(tǒng)儀器的微型化和便攜化已經成為生物、化學及醫(yī)藥行業(yè)的一個重要的發(fā)展方向，其中，微型化的傳統(tǒng)PCR裝置已經成為研究的熱點之一，尤其是微型化的qPCR技術由于其具有低成本，高靈敏度和高通量的，有希望成為大規(guī)?；虮磉_分析和藥物篩選領域的重要工具平臺而逐漸成為研究者關注的焦點。最近，Hua等[Zhishan Hua,卞 Jeremy L. Rouse,卞 Allen Ε.Eckhardt,卞 VijaySrinivasan，卞 Vamsee K. Pamula, Wiley A. Schell, Jonathan L. Benton,J Thomas G. Mitchell, § and Michael G. Pollack, Multiplexed Real-Time Polymerase ChainReaction on a Digital Microfluidic Platform Anal. Chem. 2010，82，2310-2316]提出了一種基于電潤濕驅動的數(shù)字微流控qPCR 系統(tǒng)，包裹著不同模板分子的液滴在四個平行環(huán)形通道中分別經過不同溫區(qū)，進行擴增和檢測。該系統(tǒng)的缺點是通量太低，而且每條環(huán)形通道都必須配備一套熒光檢測系統(tǒng)，過于復
ο國外一些公司也開發(fā)了一些微型化PCR產品，例如，STMicroelectronics的 In-Check 系統(tǒng)和美國佳能生命科學的數(shù)字多重PCR芯片[I. T.奈特，井上裕司，用于數(shù)字多重PCR測定的裝置和方法，公開號CN 101583724A，]。兩種產品都是基于微流控芯片技術，In-Check 芯片是在進行PCR擴增后，將產物與微陣列芯片進行雜交反應，采用端點檢測技術對基因表達進行分析的一種技術。而后者是將芯片得到的PCR產物做溶解度曲線分析，通過熒光強度不同輸出O或1信號作為陰性或陽性的閾值，進行SNP分析。另一些公司很早就將研究重點放在了 qPCR技術上，其中，比較典型的例子是美國ABI公司的 Openarray 芯片和Fluidigm的BioMark 微流控數(shù)字PCR芯片系統(tǒng)。Openarray 芯片是在不銹鋼材料上加工出三千個納升級孔陣列，并采用化學修飾技術將孔內外表面進行不同處理，以每個納米孔位基本單位，進行平行qPCR檢測分析。該芯片的缺點是加工工藝比較復雜， 成本較高。而BioMark 數(shù)字微流控芯片采用的材料是價格便宜的聚二甲基硅氧烷 (PDMS)，采用軟刻蝕技術在芯片上加工了幾千個微泵閥結構，可以實現(xiàn)自動化添加樣品和試劑功能，樣品通量最高達到487700。事實上液滴陣列也是一種非常適合進行微型化qPCR分析的技術，美國TTPLabTech公司開發(fā)了一套Mosquito :納升級液滴陣列生成裝置，用于高通量蛋白結晶篩選。但是，該系統(tǒng)并沒有被用于qPCR系統(tǒng)，可能由于在液滴生成過程中不可避免地會伴隨水分蒸發(fā)以及PCR熱循環(huán)過程中極易導致液滴之間相互融合易位等問題。然而，液滴陣列技術無論從成本，芯片設計，還是操作的容易程度等方面都是一種理想的用于微型化 qPCR分析的平臺和技術。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種可實時定量進行PCR檢測的反應芯片，以及包括芯片的熒光檢測系統(tǒng)。本發(fā)明采用的技術方案是一種液滴陣列PCR芯片，所述芯片是以單晶硅片或玻璃片為基材，采用標準光刻和濕法刻蝕技術制備得到，所述的芯片以單晶硅片或玻璃片為基材、在所述的基材上依次附著S^2氧化層、由S^2氧化層表面硅烷化生成的硅烷層，所述的硅烷層布置有光刻膠工藝刻蝕形成的可形成液滴狀陣列的親水坑陣列，所述微型親水陣列外圍設置有封閉成環(huán)的護欄，所述的護欄與所述硅烷層液密封連接。進一步，所述光刻膠工藝刻蝕形成的微型親水陣列為按如下步驟得到將單晶硅片或玻璃片在1000-1300°c氧化反應表面生成SiA氧化層，然后使SiA氧化層上硅烷化生成硅烷層，在硅烷層表面甩一層AZ光刻膠，于80-90°C加熱堅膜10-20分鐘，冷卻后，在光膠表面覆蓋印有透光陣列點的掩膜，在250 350nm的紫外光下進行光刻，移除掩膜后，將單晶硅片或玻璃片加入0. 5-0. 7% NaOH溶液中顯影2 8分鐘，再置于刻蝕液中反應10分鐘，所述刻蝕液的組成為lmol/L HF、0. 5mol/L朋/和0. 75mol/L HNO3，然后取出單晶硅片或玻璃片，用去離子水清洗，除去表面剩余的AZ光刻膠，即得可形成液滴狀陣列的親水坑陣列。所述芯片優(yōu)選以單晶硅片為基材。更具體的，本發(fā)明所述的護欄由環(huán)形玻璃制成。本發(fā)明所述光刻的時間通常為30秒 1分鐘。更進一步，本發(fā)明所述芯片按如下方法制得以單晶硅片或玻璃片為基材，采用標準光刻和濕法刻蝕技術制備得到單晶硅片或玻璃片在1000-1300°C高溫爐內氧化反應 2-4小時，表面生成SiO2氧化層，SiA氧化層約1 μ m厚，然后置于1 %的十八烷基三氯硅烷溶于甲苯的溶液中常溫反應2-4小時，使S^2氧化層上硅烷化，生成硅烷層，清洗后再在硅烷層表面甩一層AZ光刻膠，于80-90°C加熱堅膜10-20分鐘，冷卻后，在光膠表面覆蓋印有透光陣列點的掩膜，在250 350nm的紫外光下進行光刻，移除掩膜后，將單晶硅片或玻璃片加入0. 5-0. 7% NaOH溶液中顯影2_8分鐘，再置于刻蝕液中反應10分鐘，所述刻蝕液的組成為lmol/L HF、0. 5mol/L NH4F和0. 75mol/LHN03，然后取出硅片，用去離子水清洗，除去表面剩余AZ光刻膠，即得可形成液滴狀陣列的親水坑陣列，將一片環(huán)形玻璃片用環(huán)氧樹脂膠粘在芯片表面的陣列區(qū)域周圍作為護欄，露出陣列區(qū)域，制得所述液滴陣列PCR芯片。最優(yōu)選的，本發(fā)明所述芯片是以單晶硅片為材料，采用標準光刻和濕法刻蝕技術制備得到單晶硅片在1100°C高溫爐內氧化反應2小時，表面生成SiO2氧化層，然后置于
的十八烷基三氯硅烷溶于甲苯的溶液中常溫反應2小時，使SW2氧化層上硅烷化，生成硅烷層，清洗后再在硅烷層表面甩一層AZ光刻膠，于90°C加熱堅膜10分鐘，冷卻后，在光膠表面覆蓋印有透光陣列點的掩膜，在250 350nm的紫外光下進行光刻，移除掩 膜后，將單晶硅片加入0. 7% NaOH溶液中顯影2-8分鐘，再置于刻蝕液中反應10分鐘，所述刻蝕液的組成為lmol/L HF、0. 5mol/L NH/和0. 75mol/L HNO3,然后取出單晶硅片，用去離子水清洗，除去硅片表面剩余AZ光刻膠，即得可形成液滴狀陣列的親水坑陣列，再將一片環(huán)形玻璃片用環(huán)氧樹脂膠粘在陣列區(qū)域周圍，露出陣列區(qū)域，制得所述液滴陣列PCR芯片。所述掩膜的陣列點的形狀沒有特定要求，通常為圓點，其他各種形狀的點也都適用本發(fā)明，陣列點為圓點時，點的直徑大小通常為50um-300um。所述掩膜通常采用菲林膠片，用激光照排機輸出，可以事先設計透光陣列點的形狀或排列方式，然后通過激光照排打印在膠片上，從而得到透光陣列點。在光刻的時候，透光區(qū)域處的光刻膠被曝光，除去，不透光的區(qū)域保留。所述掩膜上的透光陣列點可以布置成多個陣列單元，每個陣列單元直接相隔一定的距離。然后經光刻、顯影、刻蝕、除去光膠之后，在同一芯片上形成多個親水坑陣列單元， 然后可用玻璃刀將硅片或玻璃片上的上面多個陣列單元分別切割開來，再分別將一環(huán)形玻璃片用環(huán)氧樹脂膠粘在每個陣列區(qū)域周圍，即可同時制得多個液滴陣列PCR芯片。這種處理方式應當是本領域人員根據(jù)實際情況能夠想到并實施的。本發(fā)明提供的液滴陣列PCR芯片可應用于實時定量聚合酶鏈式反應檢測或實時定量等溫擴增反應檢測。具體的，所述應用采用包括以下裝置的檢測系統(tǒng)液滴陣列PCR芯片、覆蓋于芯片陣列區(qū)域上方的光學透明的加熱蓋，用于加熱芯片的熱循環(huán)裝置、置于芯片陣列區(qū)域上方 45度方向的激發(fā)光源，置于芯片陣列區(qū)域正上方方向的CXD檢測器，所述激發(fā)光源包括發(fā)光二極管、發(fā)光二極管前端依次設有15度透鏡和帶通激發(fā)光濾光片，所述CCD檢測器包括可變焦鏡頭(0. 3-1X)、CXD相機以及設于兩者之間的帶通熒光濾光片；所述發(fā)光二極管中心波長473nm，所述帶通激發(fā)光濾光片的中心波長470nm、帶寬lOnm，所述帶通熒光濾光片的中心波長535nm，帶寬40nm。所述激發(fā)光源通常為2個發(fā)光二極管(3W，中心波長473nm)。所述系統(tǒng)中，優(yōu)選發(fā)光二極管和CCD相機均受控于一使兩者同步開啟的控制器。
所述加熱蓋優(yōu)選由氧化銦錫玻璃制成。所述應用的方法為向液滴陣列PCR芯片的陣列區(qū)域滴加足量的分子生物學級別液體石蠟油，用移液器向芯片上的親水坑陣列位置滴加反應溶液，生成液滴陣列，再進行實時定量聚合酶鏈式反應檢測或實時定量等溫擴增反應檢測。所述系統(tǒng)進行實時定量聚合酶鏈式反應檢測或實時定量等溫擴增反應檢測時，大功率發(fā)光二極管經過15度透鏡聚焦以及帶通激發(fā)光濾光片過濾，從芯片上方45度斜射均勻照射在芯片上。斜射光路可有效降低激發(fā)光散射背景，提高熒光檢測的靈敏度。芯片上的液滴內部的熒光被激發(fā)，被上方的可變焦鏡頭收集，經帶通熒光濾光片過濾后進入CCD相機采集熒光圖片。為了防止連續(xù)照射造成的熒光漂白，采用計算機來同步發(fā)光二極管的開啟與相機的采集。非采集狀態(tài)下發(fā)光二極管保持關閉狀態(tài)。本發(fā)明提供的液滴陣列芯片的材料采用具有較高導熱性能的單晶硅基片，保證了有效的熱量傳導。采用玻璃片為基材時，玻璃芯片的導熱性能不如硅片材料，但是可以降低玻璃芯片的厚度來保證有效的熱量傳導。而且，對于等溫擴增反應而言，不存在循環(huán)溫度程序，因此玻璃芯片不會影響反應溫度。本發(fā)明提供的液滴陣列PCR芯片表面經過硅烷化處理，并通過光刻膠工藝刻蝕得到局部親水和疏水區(qū)域，從而可以使加入的液滴在芯片表面有序排列，并且在加熱升溫過程中不會存在幾個液滴融合或易位的問題。本發(fā)明的檢測系統(tǒng)中，采用氧化銦錫(ITO)玻璃作為加熱蓋，一方面可以防止PCR 過程中液滴的蒸發(fā)，另一方面由于ITO具有光學透明性質，不會妨礙每個循環(huán)熒光信號的采集。本發(fā)明提供的液滴陣列PCR芯片在進行實時定量聚合酶鏈式反應檢測或實時定量等溫擴增反應檢測時，先加入液體石蠟油，再加入反應溶液，生成液滴陣列，則液滴被包裹在液體石蠟油中，在PCR過程中不會因蒸發(fā)引起溶液反應體積和濃度發(fā)生變化。此外，由于芯片表面進行了局部親水和疏水處理，液滴在PCR熱循環(huán)過程中不會因溫度變化而發(fā)生隨機移動和液滴融合現(xiàn)象，降低了液滴間的相互污染，以及避免對數(shù)據(jù)采集和定量分析產生干擾。本發(fā)明采用的熒光檢測系統(tǒng)包括激發(fā)和發(fā)射光濾光片組件，兩個大功率發(fā)光二極管(LED)和一個普通CCD檢測器，與現(xiàn)有商品化qPCR系統(tǒng)相比，成本大為降低，具有較好的商業(yè)化前景。與現(xiàn)有技術相比，現(xiàn)有普通的實時定量PCR儀器使用PCR管或96/384孔板作為反應容器，一般的反應體積為15uL+20uL(反轉錄+PCR)，體積大所消耗的試劑和樣品量就大。 本發(fā)明提供的實時定量聚合酶鏈式反應檢測系統(tǒng)將反應體積降低到500nL以下。而反應體積雖然很小，但是檢測靈敏度和商品化定量PCR儀相當，從而降低了試劑消耗和樣品用量， 節(jié)約成本。
四

圖1液滴陣列PCR芯片制備過程示意2實時定量聚合酶鏈式反應檢測系統(tǒng)組成示意3熒光素溶液液滴陣列圖4液滴體積對qPCR影響圖5芯片qRT-PCR分析mir-122(a)熒光圖像；(b)標準曲線；(c)擴增曲線圖6細胞中mir-122表達分析(a)總RNA加入量；(b)五種細胞系中mir_122表
達量圖7不同劑量STOR Green組液滴的熒光變化曲線8RCA凝膠電泳9擴增曲線和標準曲線
五具體實施例方式實施例1制備芯片6寸單晶硅片在1100°C高溫爐內氧化反應2小時，表面生成SiO2氧化層，然后置于的十八烷基三氯硅烷(溶劑為甲苯)溶液中常溫反應2小時，使SiO2氧化層表面硅烷化，取出后分別用甲苯，異丙醇和無水乙醇清洗一次，最后用去離子水清洗，晾干。接下來將硅片置于甩膠機中，在表面滴少量AZ光刻膠，于2000rpm轉速下甩膠1分鐘，，再將硅片置于烤膠機中90°C加熱堅膜10分鐘，冷卻后，在光膠表面覆蓋一片印有透光陣列點的掩膜， 掩膜上的透光陣列點為直徑300um尺寸的圓點，形成6X6的方形陣列，陣列中相鄰兩孔的最小間距為500um，每個6X6的方形陣列為一個陣列單元，共布置有10個陣列單元。然后在250 350nm的紫外光下進行光刻1分鐘，移除掩膜后，將單晶硅片浸入0. 7% NaOH溶液中顯影2分鐘，再置于刻蝕液中反應10分鐘，刻蝕液的組成為lmol/L HF、0. 5mol/L NH4F 和0. 75mol/L HNO3，然后取出單晶硅片，用去離子水清洗。用蘸有丙酮溶液的棉花輕輕除去硅片表面剩余AZ光刻膠，用去離子水清洗，烘干，然后用玻璃刀將硅片上面多個陣列分別切割開來，將一片環(huán)形玻璃片用環(huán)氧樹脂膠分別粘在每個陣列區(qū)域周圍，露出陣列區(qū)域，制得10個液滴陣列PCR芯片，備用。 制得的芯片上滴加IOOuL體積的分子生物學級別液體石蠟油，用如附圖2所示的實時定量聚合酶鏈式反應檢測系統(tǒng)，進行下列檢測。具體的，實時定量聚合酶鏈式反應檢測系統(tǒng)包括液滴陣列聚合酶鏈式反應芯片、 覆蓋于芯片陣列區(qū)域上方的光學透明的由氧化銦錫玻璃制成的加熱蓋，用于加熱芯片的熱循環(huán)裝置、置于芯片陣列區(qū)域上方45度方向的激發(fā)光源，置于芯片陣列區(qū)域正上方方向的 CCD檢測器，所述激發(fā)光源為2個發(fā)光二極管(3W，中心波長473nm)、發(fā)光二極管前端依次設有15度透鏡和帶通激發(fā)光濾光片，所述CXD檢測器包括可變焦鏡頭(0. 3-1X)、CXD相機以及設于兩者之間的帶通熒光濾光片；所述帶通激發(fā)光濾光片的中心波長470nm、帶寬lOnm， 所述帶通熒光濾光片的中心波長535nm，帶寬40nm。發(fā)光二極管和CXD相機均受控于一使兩者同步開啟的控制器。實施例2多步加入試劑穩(wěn)定性和重現(xiàn)性考察以熒光素染料溶液為樣品，用0. 1-2. 5 μ L量程的移液器，在6 X 6陣列芯片上依次加樣三次，第一次生成IOOnL濃度為10-6mol/L的熒光素溶液液滴陣列(如附圖3a所示)， 接著在生成的液滴中分別加入IOOnL濃度為10_5mol/L的熒光素溶液(如附圖3b所示)， 最后加入300nL濃度為10_5mol/L的熒光素溶液(如附圖3c所示)。附圖3中，上排為明場照片(用普通鎢燈光源照射，直接拍照)，下排為熒光照片。用數(shù)據(jù)處理程序分析熒光強度，根據(jù)36個液滴的熒光強度的平均值，可以計算得到相對標準偏差小于8%。同時，還考察了不同液滴體積對qPCR結果的影響，發(fā)現(xiàn)在IOOnL到500nL范圍內，液滴體積對qPCR結果無顯著性影響(如附圖4所示)。實施例3microRNA定量分析對于以RNA為模板的大多數(shù)RT-PCR反應體系，逆轉錄反應和PCR擴增都需要分開兩步分別進行操作。為了展示該系統(tǒng)進行兩步法實時定量RT-PCR檢測分析的適用性，以人工合成的mir-122為樣品，考察了該系統(tǒng)的檢測靈敏度和線性范圍。首先，在芯片上生成 6X6個IOOnL液滴(芯片陣列與附圖3 —致)，每列6個液滴內含有相同濃度的mir_122樣品，6列液滴中mir-122的加入量分別為(從右到左)空白，9. 6X 103，9. 6X 104，9. 6X 105， 9. 6X IO6,9. 6X IO7個拷貝，跨越了 5個數(shù)量級。接著，向每個液滴中加入IOOnL反轉錄試劑預混液(反轉錄預混液體積為10uL，其中含有dNTP混合液濃度為lmMJultiscribe 反轉錄酶50U，1 X RT緩沖液，核酸酶抑制劑3. 8U，以及3 μ L RT引物)，然后將芯片置于PCR儀上面進行反轉錄反應(16°C進行30分鐘，42°C進行30分鐘，85°C進行5分鐘)。反應完畢后，再向液滴中加入PCR預混合液300nL(其中包括150nL2XTaqMan試劑，15nL探針和引物混合液)。PCR程序為95°C，預反應10分鐘；46個循環(huán)包括95°C，15秒和60°C，1分鐘。本實驗所用試劑包括引物、探針均為ABI商品化microRNA檢測試劑盒(No. 4366596和 No. 4324018)。熒光檢測系統(tǒng)在PCR程序終每個循環(huán)的60°C時采集一次數(shù)據(jù)((XD拍攝一次)，整個反應結束后得到46個熒光圖片，附圖fe給出了其中8個循環(huán)的熒光圖片。采用數(shù)據(jù)處理程序對每個循環(huán)的熒光圖片中液滴的熒光強度進行數(shù)據(jù)提取和處理，得到附圖5c 的PCR擴增曲線，其中相同顏色的幾條曲線代表具有相同模版濃度的液滴。每條擴增曲線都會與熒光閾值(c圖中虛線)有個交點，對應橫坐標得到一個Ct值。Ct值與液滴中最初加入的模版拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，因而可以得到定量標準曲線(附圖5b)。該標準曲線可以作為mir-122表達分析的定量依據(jù)。從圖中可得mir-122的加入量的對數(shù)與Ct值具有良好的線性關系(R2 = O. 999)。芯片實時定量PCR擴增的效率為86. 32%，無論是靈敏度還是線性范圍都達到了商品化實時定量PCR儀的水平，樣品和試劑的用量與常規(guī)qRT-PCR 相比降低了至少70倍。進一步將該系統(tǒng)應用于測定五種細胞中mir-122的含量。首先，我們采用Trizol 試劑(DP405，天根公司)提取Huh-7，MCF-7，H印G-2，HL-60及HeLa五種細胞中的總RNA，用分光光度計對所提取的總RNA含量和純度進行分析。以上述細胞中提取的總RNA為樣品， 按照上述方法進行芯片RT-PCR實驗。對于Huh-7細胞，在總RNA加入量為3pg-3000pg的范圍內，總RNA加入量與得到的CT值呈現(xiàn)出良好的線性關系(附圖6a)。這說明樣品量在這個范圍內可以得到準確地定量分析，因為通常認為每個細胞中總RNA的量在15-25pg，也顯示了該系統(tǒng)在單細胞分析水平的潛力。附圖6b顯示了五種細胞中mir-122的表達量，將本系統(tǒng)與商品化實時定量PCR儀(ABI 7500)的測定數(shù)據(jù)進行比較，得到比較一致的結果。實施例4SYBR Green 法 qPCR實施例3采用的是TaqMan探針試劑盒進行的qRT_PCR檢測系統(tǒng)，除了 TaqMan探針以外，STOR Green染料法也是非常普遍應用的qPCR分析技術，發(fā)明人進一步將該系統(tǒng)用于STOR Green法qPCR。發(fā)明人選擇商品化的SYBR Premix Ex Taq 試劑盒(Takara)， 液滴生成方法同實施例3。實驗中所用模板為pre-mir-21及其反轉錄產物，pre-mir-21為 mir-21的前體，長度為72nt，采用體外轉錄技術合成，其序列和反轉錄、PCR引物分別見表 1。表1引物序列
權利要求
1.一種液滴陣列PCR芯片，其特征在于所述芯片是以單晶硅片或玻璃片為基材，采用標準光刻和濕法刻蝕技術制備得到，所述的芯片以單晶硅片或玻璃片為基材、在所述的基材上依次附著SiO2氧化層、由SW2氧化層表面硅烷化生成的硅烷層，所述的硅烷層布置有光刻膠工藝刻蝕形成的可形成液滴狀陣列的親水坑陣列，所述親水坑陣列外圍設置有封閉成環(huán)的護欄，所述的護欄與所述硅烷層液密封連接。
2.如權利要求1所述的液滴陣列PCR芯片，其特征在于所述光刻膠工藝刻蝕形成的可形成液滴狀陣列的親水坑陣列為按如下步驟得到將單晶硅片或玻璃片在1000-1300°C 氧化反應表面生成SW2氧化層，然后使SiA氧化層上硅烷化生成硅烷層，在硅烷層表面甩一層AZ光刻膠，于80-90°C加熱堅膜10-20分鐘，冷卻后，在光膠表面覆蓋印有透光陣列點的掩膜，在250 350nm的紫外光下進行光刻，移除掩膜后，將單晶硅片或玻璃片加入 0. 5-0. 7% NaOH溶液中顯影2 8分鐘，再置于刻蝕液中反應10分鐘，所述刻蝕液的組成為lmol/L HF,0. 5mol/L朋/和0. 75mol/L HNO3,然后取出單晶硅片或玻璃片，用去離子水清洗，除去表面剩余的AZ光刻膠，即得可形成液滴狀陣列的親水坑陣列。
3.如權利要求1所述的液滴陣列PCR芯片，其特征在于所述的護欄由環(huán)形玻璃制成。
4.如權利要求1所述的液滴陣列PCR芯片，其特征在于所述芯片按如下方法制得以單晶硅片或玻璃片為基材，采用標準光刻和濕法刻蝕技術制備得到單晶硅片或玻璃片在 1000-1300°C高溫爐內氧化反應2-4小時，表面生成SiO2氧化層，然后置于的十八烷基三氯硅烷溶于甲苯的溶液中常溫反應2-4小時，使SiO2氧化層上硅烷化，生成硅烷層，清洗后再在硅烷層表面甩一層AZ光刻膠，于80-90°C加熱堅膜10-20分鐘，冷卻后，在光膠表面覆蓋印有透光陣列點的掩膜，在250 350nm的紫外光下進行光刻，移除掩膜后，將單晶硅片或玻璃片加入0. 5-0. 7% NaOH溶液中顯影2_8分鐘，再置于刻蝕液中反應10分鐘，所述刻蝕液的組成為lmol/L HF、0. 5mol/L朋/和0. 75mol/L HNO3,然后取出硅片，用去離子水清洗，除去表面剩余AZ光刻膠，即得可形成液滴狀陣列的親水坑陣列，將一片環(huán)形玻璃片用環(huán)氧樹脂膠粘在芯片表面的陣列區(qū)域周圍作為護欄，露出陣列區(qū)域，制得所述液滴陣列 PCR芯片。
5.如權利要求1所述的液滴陣列PCR芯片，其特征在于所述芯片是以單晶硅片為材料， 采用標準光刻和濕法刻蝕技術制備得到單晶硅片在1100°c高溫爐內氧化反應2小時，表面生成SiO2氧化層，然后置于1 %的十八烷基三氯硅烷溶于甲苯的溶液中常溫反應2小時， 使SW2氧化層上硅烷化，生成硅烷層，清洗后再在硅烷層表面甩一層AZ光刻膠，于90°C加熱堅膜10分鐘，冷卻后，在光膠表面覆蓋印有透光陣列點的掩膜，在250 350nm的紫外光下進行光刻，移除掩膜后，將單晶硅片加入0. 7% NaOH溶液中顯影2-8分鐘，再置于刻蝕液中反應10分鐘，所述刻蝕液的組成為:lmol/L HF、0. 5mol/L NH4F和0. 75mol/L HNO3，然后取出單晶硅片，用去離子水清洗，除去硅片表面剩余AZ光刻膠，即得可形成液滴狀陣列的親水坑陣列，再將一片環(huán)形玻璃片用環(huán)氧樹脂膠粘在陣列區(qū)域周圍，露出陣列區(qū)域，制得所述液滴陣列PCR芯片。
6.如權利要求1 5之一所述的液滴陣列PCR芯片應用于實時定量聚合酶鏈式反應檢測或實時定量等溫擴增反應檢測。
7.如權利要求6所述的應用，其特征在于所述應用采用包括以下裝置的檢測系統(tǒng)液滴陣列PCR芯片、覆蓋于芯片陣列區(qū)域上方的光學透明的加熱蓋，用于加熱芯片的熱循環(huán)裝置、置于芯片陣列區(qū)域上方45度方向的激發(fā)光源，置于芯片陣列區(qū)域正上方方向的CCD 檢測器，所述激發(fā)光源包括發(fā)光二極管、發(fā)光二極管前端依次設有15度透鏡和帶通激發(fā)光濾光片，所述CXD檢測器包括可變焦鏡頭、CXD相機以及設于兩者之間的帶通熒光濾光片； 所述發(fā)光二極管中心波長473nm，所述帶通激發(fā)光濾光片的中心波長470nm、帶寬lOnm，所述帶通熒光濾光片的中心波長535nm，帶寬40nm。
8.如權利要求6所述的應用，其特征在于所述系統(tǒng)中，發(fā)光二極管和CCD相機均受控于一使兩者同步開啟的控制器。
9.如權利要求6所述的應用，其特征在于所述加熱蓋為氧化銦錫玻璃制成。
10.如權利要求6所述的應用，其特征在于所述應用的方法為向液滴陣列PCR芯片的陣列區(qū)域滴加足量的分子生物學級別液體石蠟油，用移液器向芯片上的親水坑陣列位置滴加反應溶液，生成液滴陣列，再進行實時定量聚合酶鏈式反應檢測或實時定量等溫擴增反應檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種液滴陣列PCR芯片，所述芯片是以單晶硅片或玻璃片為基材，采用標準光刻和濕法刻蝕技術制備得到，所述的芯片以單晶硅片或玻璃片為基材、在所述的基材上依次附著SiO2氧化層、由SiO2氧化層表面硅烷化生成的硅烷層，所述的硅烷層布置有光刻膠工藝刻蝕形成的可形成液滴狀陣列的親水坑陣列，所述親水坑陣列外圍設置有封閉成環(huán)的護欄，所述的護欄與所述硅烷層液密封連接。并公開了所述芯片應用于實時定量聚合酶鏈式反應檢測或實時定量等溫擴增反應檢測。本發(fā)明提供的檢測系統(tǒng)將反應體積大為降低，而且檢測靈敏度和商品化定量PCR儀相當。檢測體系簡單易操作，成本低，可應用于商業(yè)化。
文檔編號G01N21/64GK102168011SQ20101062036
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權日2010年12月31日
發(fā)明者姚波, 張云霞, 方群, ?，?申請人:浙江大學