專利名稱：一種檢測(cè)血清樣本中鼠疫抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種檢測(cè)血清樣本中鼠疫抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
鼠疫桿菌(Yersinia pestis)屬于耶爾森氏菌屬(Yersina)，是引起烈性傳染病 鼠疫(Plague)的病原菌。鼠疫是一種病情極為兇險(xiǎn)的傳染病，傳染性極強(qiáng)，致死率為30% 至100%，鼠疫的潛伏期大約是2至7天，甚至更短，各型的初期癥狀像有發(fā)高燒、劇烈頭痛、 嘔吐、臉部潮紅、眼紅、皮膚有出血點(diǎn)、意識(shí)模糊、四肢劇痛、局部淋巴結(jié)腫大等等。免疫學(xué)方法酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)(ELISA)中利用抗原與抗體特異性反應(yīng)來(lái)檢測(cè)抗原或 抗體主要有由雙抗原夾心測(cè)抗體、雙抗體夾心測(cè)抗原、競(jìng)爭(zhēng)法、間接法等。間接法測(cè)抗體 的原理是特異性抗原結(jié)合到固相載體上，然后和待檢血清中的相應(yīng)抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合 物，洗滌后再加酶標(biāo)記抗體與免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合形成酶標(biāo)記抗體-抗體-固相抗原 復(fù)合物，加底物顯色，判斷抗體含量。懸浮芯片(suspension array)也稱液相芯片，是20世紀(jì)70年代美國(guó)Luminex公 司研制出的新一代生物芯片技術(shù)，利用帶編碼的微球體作為載體，流式細(xì)胞儀作為檢測(cè)平 臺(tái)，對(duì)核酸、蛋白質(zhì)等生物分子進(jìn)行大規(guī)模測(cè)定。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于免疫分析、核酸 研究、酶學(xué)分析、抗體篩選及受體與配體的識(shí)別分析等領(lǐng)域。目前發(fā)展的懸浮芯片主要是基于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的建立和方法評(píng)價(jià)及優(yōu)化，以縮 短檢測(cè)時(shí)間，降低方法的檢測(cè)成本。但是懸浮芯片方法是否能夠檢測(cè)人血清中的鼠疫抗體， 其定量檢測(cè)能力如何，尚缺乏模型和評(píng)價(jià)。

實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型的目的在于提供一種檢測(cè)血清中鼠疫抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，該芯 片系統(tǒng)包括芯片基體、加液系統(tǒng)、懸浮芯片檢測(cè)儀和計(jì)算機(jī)，其中，芯片基體內(nèi)裝有相關(guān)緩 沖溶液和待測(cè)抗體，相關(guān)緩沖液中設(shè)置有043號(hào)編碼微球，編碼微球上包被有捕獲抗原，加 液系統(tǒng)依次向芯片基體中加入生物素標(biāo)記的二抗、熒光信號(hào)檢測(cè)物，懸浮芯片檢測(cè)儀包括 微細(xì)管檢測(cè)通道和檢測(cè)激光，反應(yīng)后的溶液吸入到微細(xì)管檢測(cè)通道中，以使得每個(gè)編碼微 球依次通過(guò)微細(xì)管檢測(cè)通道，檢測(cè)激光激發(fā)并識(shí)別編碼微球的顏色及其上待測(cè)物的熒光信 號(hào)，計(jì)算機(jī)與懸浮芯片檢測(cè)儀相連，并記錄、分析懸浮芯片檢測(cè)儀的測(cè)量結(jié)果。進(jìn)一步，所述相關(guān)緩沖溶液包括用于所述待測(cè)抗體稀釋的樣品稀釋液、稀釋所述 編碼微球所用的微球稀釋液、稀釋所述生物素標(biāo)記的二抗和/或SPA所用的抗體稀釋液、每 個(gè)反應(yīng)之后洗滌編碼微球所用的微球清洗液、SA-PE稀釋液、檢測(cè)緩沖液。進(jìn)一步，所述捕獲抗原優(yōu)選為鼠疫Fl蛋白。進(jìn)一步，所述待測(cè)抗體為血清樣品。進(jìn)一步，所述生物素標(biāo)記的二抗，優(yōu)選為Biotin-羊抗兔IgG和/或Biotin-羊抗 AlgGo
3[0011 ] 進(jìn)一步，所述熒光信號(hào)檢測(cè)物為鏈親和素-藻紅蛋白。進(jìn)一步，所述芯片基體為96孔濾板或者微量離心管。進(jìn)一步，所述檢測(cè)激光包括用激發(fā)所述編碼微球基質(zhì)中的顏色、識(shí)別編碼微球分 類編碼以確定檢測(cè)項(xiàng)目的紅色激光，用于激發(fā)并識(shí)別待測(cè)分子的顏色信號(hào)、記錄信號(hào)強(qiáng)弱 以檢測(cè)所述待測(cè)抗體的含量的綠色激光。經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)和深入的研究，對(duì)鼠疫抗體的蛋白懸浮芯片制備及其檢測(cè)條件作了 實(shí)質(zhì)性的改進(jìn)和創(chuàng)新，其具有下列優(yōu)點(diǎn)1、抗原包被量的改進(jìn)鼠疫Fl抗原的包被量是成功檢測(cè)的關(guān)鍵，本實(shí)用新型對(duì)包被微球的抗原包被量 進(jìn)行實(shí)質(zhì)性優(yōu)化使血清樣本的檢測(cè)效果非常良好，并且包被蛋白懸浮芯片所需的抗原包 被量很低，本實(shí)用新型的抗原包被量為0. 1 240μ g/1. 25X106個(gè)編碼微球或0. 02 960ng/2500 5000個(gè)微球/測(cè)試，而傳統(tǒng)免疫學(xué)ELISA方法的包被量為1 μ g/測(cè)試。2、生物素標(biāo)記的改進(jìn)通常，標(biāo)記抗體需要使用過(guò)量的生物素。理論上講，在檢測(cè)過(guò)程中，過(guò)量的生物素 因未標(biāo)記上抗體而不被微球上結(jié)合捕獲抗體的抗體連接，清洗時(shí)被抽濾掉，不會(huì)與隨后加 入的SA-PE反應(yīng)，不影響檢測(cè)。但在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，偶爾遇到過(guò)檢測(cè)信號(hào)可能過(guò)高的現(xiàn) 象，出現(xiàn)假陽(yáng)性，因此建議生物素標(biāo)記抗體后，盡量去除多余的生物素。以標(biāo)記ang/mL的 IgG (分子量150，000) ImL溶液為例，需加入IOmM生物素溶液約27 μ L。3、檢測(cè)的靈敏度及動(dòng)態(tài)范圍本實(shí)用新型的血清樣品鼠疫抗體的蛋白懸浮芯片定量檢測(cè)方法與經(jīng)典的免疫學(xué) ELISA檢測(cè)方法，結(jié)果有著很好的吻合性(相關(guān)系數(shù)R2 = 0.9994)。同時(shí)，蛋白懸浮芯片方 法靈敏度為2. 12ng/mL，其高于ELISA方法的312. 5ng/mL，靈敏度增高100倍以上；并且蛋 白懸浮芯片方法動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍為1. 22 20000ng/mL，其高于ELISA方法動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍(即 312. 5 20000ng/mL) 2 個(gè)數(shù)量級(jí)。4、方法的特異性本實(shí)用新型通過(guò)選用鼠疫Fl抗原為包被抗原，以兔抗鼠疫Fl抗體為待測(cè)抗體， 以生物素化的羊抗兔為檢測(cè)抗體。本研究試驗(yàn)證明，在存在鼠抗流感NP IgG、兔抗禽流感 H5migG、兔抗結(jié)核抗體、兔抗SARS IgG等干擾抗體存在的條件下，本方法具有良好的特異 性。5、樣品的檢測(cè)能力本實(shí)用新型評(píng)價(jià)了蛋白懸浮芯片方法對(duì)人血清的檢測(cè)能力。通過(guò)對(duì)人血清的檢 測(cè)，初步證實(shí)了該方法在檢測(cè)人血清中鼠疫抗體的實(shí)用性。


圖1為本實(shí)用新型結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為043號(hào)微球包被鼠疫Fl蛋白檢測(cè)鼠疫抗體示意圖；圖3為蛋白懸浮芯片方法檢測(cè)兔抗鼠疫Fl抗體劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖4為ELISA方法檢測(cè)兔抗鼠疫Fl抗體標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖5為蛋白懸浮芯片與ELISA方法檢測(cè)兔抗鼠疫Fl抗體的相關(guān)性。
具體實(shí)施方式
如圖1至圖5所示，本實(shí)用新型一種檢測(cè)血清樣本中鼠疫抗體的蛋白懸浮芯片系 統(tǒng)，包括芯片基體1、加液系統(tǒng)2、懸浮芯片檢測(cè)儀3和計(jì)算機(jī)4，其中，芯片基體1為96孔 濾板或者微量離心管，其內(nèi)裝有相關(guān)緩沖溶液和待測(cè)抗體，相關(guān)緩沖液中設(shè)置有編碼微球 (圖中未示)，編碼微球上包被有鼠疫Fl蛋白，用于捕獲待檢測(cè)血清樣品中的待測(cè)抗體，如 果樣品中有鼠疫Fl抗體，鼠疫Fl抗體與編碼微球上的鼠疫Fl蛋白結(jié)合，再加入帶有生物 素標(biāo)記的二抗，形成編碼微球-鼠疫Fl蛋白-鼠疫Fl抗體-二抗-生物素復(fù)合物，最后加 入鏈親和素-藻紅蛋白，鏈親和素與生物素結(jié)合，形成編碼微球-鼠疫Fl蛋白-鼠疫Fl抗 體-二抗-生物素-鏈親和素-藻紅蛋白復(fù)合物，通過(guò)懸浮芯片檢測(cè)儀對(duì)藻紅蛋白熒光信號(hào) 的檢測(cè)來(lái)達(dá)到對(duì)血清樣品中鼠疫Fl抗體的檢測(cè)，如果血清樣品中沒(méi)有鼠疫Fl抗體，包被有 鼠疫Fl蛋白的編碼微球不會(huì)與后面加入的生物素標(biāo)記的二抗、鏈親和素-藻紅蛋白結(jié)合， 最后通過(guò)懸浮芯片檢測(cè)儀器進(jìn)行檢測(cè)時(shí)無(wú)熒光信號(hào)或應(yīng)該信號(hào)非常弱。上述芯片系統(tǒng)中，編碼微球在微球稀釋液，待測(cè)抗體在樣品稀釋液中，生物素標(biāo)記 的二抗在抗體稀釋液中，熒光信號(hào)檢測(cè)物在SA-PE稀釋液中，懸浮芯片檢測(cè)儀檢測(cè)時(shí)編碼 微球復(fù)合物在檢測(cè)緩沖液中，每步結(jié)合之后均用微球清洗液洗滌微球，使得沒(méi)有結(jié)合的物 質(zhì)清除體系。懸浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比 例的紅光及紅外光發(fā)色劑，而產(chǎn)生100種不同比例顏色，作為100種獨(dú)特的色彩編號(hào)，每顆 微球大小約5. 6 μ m，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受體和配體識(shí)別分 析等，并根據(jù)不同研究目的而標(biāo)定特定抗體、核酸探針及各種受體探針。標(biāo)記探針的微球與 待測(cè)物在96孔板中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)后，利用機(jī)器自動(dòng)將反應(yīng)液吸起并通過(guò)一微細(xì)管檢測(cè)通 道，每次僅允許一個(gè)微球通過(guò)檢測(cè)通道。檢測(cè)通道中設(shè)有兩道激光，一道為紅色，激發(fā)微球 基質(zhì)中的顏色，識(shí)別微球分類編碼以確定檢測(cè)項(xiàng)目；一道為綠色，激發(fā)報(bào)告分子的顏色，記 錄信號(hào)強(qiáng)弱以檢測(cè)待測(cè)物的含量。當(dāng)待測(cè)樣本與特定微球的探針吸附在一起時(shí)，兩道激光 所激發(fā)的光都可被檢測(cè)到。而若樣本中不含該標(biāo)的物，則僅有微球中的激發(fā)光可被檢測(cè)到。 再通過(guò)機(jī)器與計(jì)算機(jī)自動(dòng)統(tǒng)計(jì)分析兩道激光所激發(fā)的微球種類與數(shù)量，從而判定待測(cè)樣本 中有幾種測(cè)試目標(biāo)物在其中，得知測(cè)試樣本中有無(wú)待測(cè)病原存在，或同時(shí)存在有幾種至數(shù) 十種病原。懸浮芯片技術(shù)由于利用微球在溶液中反應(yīng)，克服了片膜芯片在大分子檢測(cè)時(shí)受 表面張力、空間效應(yīng)等對(duì)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響，同時(shí)利用激光檢測(cè)技術(shù)，大大提高了樣品檢測(cè) 的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，具有優(yōu)于片膜芯片的操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好等特點(diǎn)。本實(shí)用新型一種檢測(cè)血清樣本中鼠疫抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，通過(guò)下面的具體 實(shí)施方式作進(jìn)一步說(shuō)明，但本實(shí)用新型不以任何方式受該實(shí)施例的限定。一、材料1.蛋白懸浮芯片的相關(guān)緩沖液(I)PBS 緩沖液(pH7. 4) :NaCl 137mmol/L ；KCl 2. 7mmol/L ；Na2HP04 10mmol/L ； KH2P04 2mmol/L。用 800mL 蒸餾水溶解 8gNaCl，0. 2gKCl，1. 44g Na2HP04 和 0. 24g KH2P04。 用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7. 4，加水至1L。分裝后在15psi (1. 05kg/cm2)高壓蒸汽20分 鐘，或過(guò)濾除菌，保存于室溫。(2)微球清洗液:PBS(ρΗ7· 4) ,0. 05% TWEEN-20。[0039](3)微球活化緩沖液 IOOmM NaH2P04 :3g NaH2P04,5N NaOH 1. 5mL，定容于 25OmL, pH 6. 2。(4)微球包被緩沖液 0. 05M MES, pH 5. 0 2. 44g MES, 5NNaOHO. 15mL,定容于 250mLo(5)微球保存液PBS-TBN :PBS，0· BSA，0. 02% TWEEN，0. 05%疊氮化物，pH 7.4。(6)微球封閉液 PBS-BN :PBS, 1% BSA,0. 05%疊氮化物，ρΗ7· 4。(7)檢測(cè)緩沖液:PBS, 1 % BSA, ρΗ7· 4。(8)抗體稀釋液 PBS，ρΗ7· 4。。(9)微球稀釋液:PBS, 1 % BSA, ρΗ7· 4。(10)樣品稀釋液 PVX :PBS,0. 5% PVA,0. 8% PVP ；(11) SA-PE 稀釋液:PBS (pH7. 4),1% BSA。2.抗原與抗體本實(shí)用新型所使用的抗原為鼠疫Fl蛋白，可購(gòu)自青海省地方病預(yù)防控制所。本實(shí)用新型所使用檢測(cè)抗體為兔抗鼠疫Fl抗原多克隆抗體，可購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科 學(xué)研究院微生物流行病研究所，檢測(cè)抗體為生物素化羊抗兔IgG和生物素化羊抗人IgG，所 述的羊抗兔IgG和羊抗人IgG可購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司。二、待測(cè)樣品的制備1、目標(biāo)分析物樣品的制備目標(biāo)分析物為兔抗鼠疫Fl IgG,干擾樣品或作為方法特異性測(cè)試的樣品是目標(biāo)檢 測(cè)物外的其它抗體或其它蛋白質(zhì)，包括兔抗結(jié)核血清、兔抗SARS IgG、兔抗禽流感H5W血 清、兔抗鼠疫IgG、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等。將上述待分析樣品均溶于樣品稀釋液中，-4°C 保存。兔抗鼠疫FlIgG的儲(chǔ)備液濃度為0.08mg/mL。比較實(shí)驗(yàn)中，相同樣品用于ELISA和蛋 白懸浮芯片的檢測(cè)。將待分析的兔抗鼠疫Fl IgG用樣品稀釋液以4倍倍比系列稀釋為不同濃度樣品， 以繪制樣品檢測(cè)劑量-反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中幾個(gè)樣品濃度低于檢測(cè)的敏感度，高濃度樣 品應(yīng)使編碼微球的結(jié)合位點(diǎn)處于飽和狀態(tài)。2、人血清樣本的處理分別將鼠疫病人血清樣本和人血清樣本用樣品稀釋1 10稀釋，例如血清樣本 5 μ L加樣品稀釋液50 μ L混勻后，作為待檢樣品進(jìn)行蛋白懸浮芯片方法的檢測(cè)。實(shí)施例1、檢測(cè)鼠疫抗體的蛋白懸浮芯片的制備1、捕獲抗原包被編碼微球本實(shí)用新型采用的043號(hào)編碼微球購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，編碼微球用于標(biāo)記可 以捕獲鼠疫抗體的鼠疫Fl蛋白抗原，即利用鼠疫Fl蛋白包被微球。Α、編碼微球的活化 取100 μ L (1. 25 X IO6個(gè))編碼微球到1. 5mL離心管中，14000 X g離心，小心吸出并 棄去上清液。加入100 μ L的微球清洗緩沖液懸浮，震蕩并超聲后14000 Xg離心，小心吸出 并棄去上清液。加入100 μ L的微球活化緩沖液，接著先加入10 μ L新鮮配置的EDC(50mg/ mL)，再加入10 μ L新鮮配置的50mg/mL的Sulfo-NHS，高速震蕩30秒后用鋁箔包裹，在室 溫震搖20分鐘。加入150 μ L的PBS (ρΗ7· 4)，震蕩后，14000 X g離心，小心吸出并棄去上清液。加入100 μ L的PBS (ρΗ7· 4)懸浮編碼微球。B、用抗原包被編碼微球取捕獲抗原西尼羅E蛋白抗原0. 1 M μ g加入到活化后的編碼微球中，用PBS緩 沖液定容至500 μ L，室溫震搖2小時(shí)。14000 Xg離心，小心吸出并棄去上清液。用500 μ L 的PBS緩沖液洗一次，14000 Xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入250 μ L的封閉緩沖液 懸浮編碼微球，在室溫震搖30分鐘，14000Xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入500 μ L 的微球保存液洗滌編碼微球，16000Xg離心，小心吸出并棄去上清液。最后用150yL的微 球保存液懸浮編碼微球，于4°C避光保存?zhèn)溆?。C、包被微球的計(jì)數(shù)吸取適量微球，稀釋后，用血球計(jì)數(shù)板(0. 10mm;l/400mm2)在普通顯微鏡下計(jì)數(shù)。 根據(jù)公式(每個(gè)大格數(shù)Xio4X稀釋倍數(shù)X體積(mL))計(jì)算微球數(shù)量。2、檢測(cè)物標(biāo)記生物素A、生物素的標(biāo)記分別配制好濃度為IOmM生物素溶液和^iig/mL的待標(biāo)記抗體溶液，將計(jì)算好體 積的生物素加入到待標(biāo)記物溶液中，在室溫震搖30分鐘(或冰上2小時(shí))，過(guò)柱脫鹽后分 裝，-20°C凍存?zhèn)溆谩、抗體的用量以標(biāo)記ang/mL的IgG (分子量150，000) ImL溶液為例，需加入IOmM生物素溶液約 27 μ 1。實(shí)施例2、蛋白懸浮芯片制備法條件的優(yōu)化1、微球包被抗原包被量的選擇分另Ij以 0. 1μ g、2y g、4y g、6y g、8y g、10y g、12y g、16y g、20y g、24y g 的量包 被100 μ L編碼為043號(hào)的微球。經(jīng)檢測(cè)效果比較，以0. 1 My g/1. 25 X 106個(gè)編碼微球 或0. 02 96ng/2500 5000個(gè)微球/測(cè)試，包被效果最好，顯微鏡下計(jì)數(shù)后避光冷藏保存 待用。如圖1所示，包被鼠疫Fl蛋白抗原的043號(hào)微球均落在其正確檢測(cè)區(qū)域內(nèi)，并且獲 得高信噪比結(jié)果(MFI值遠(yuǎn)大于2000)，說(shuō)明優(yōu)化的蛋白懸浮芯片檢測(cè)系統(tǒng)可成功用于鼠疫 Fl抗體的檢測(cè)。2、生物素化檢測(cè)物的優(yōu)化本實(shí)用新型分別用氨基活性的生物素，例如LC-酰胼(hydrazide)-生物素和羧基 活性的生物素，例如Sulfo-NHS-生物素和SH-活性的生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體，經(jīng)質(zhì)控過(guò)程檢 測(cè)效果比較，本實(shí)驗(yàn)中Sulfo-NHS-生物素標(biāo)記檢測(cè)物檢測(cè)效果較好，檢測(cè)效果的方法采用 本領(lǐng)域的常規(guī)方法或安裝制造商的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)所述的方法。本實(shí)用新型人經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)ang/mL生物素化的抗體羊抗兔以1 500稀 釋作為檢測(cè)物進(jìn)行檢測(cè)兔血清中的鼠疫Fl抗體，檢測(cè)結(jié)果顯示生物素化檢測(cè)物Bio-羊抗 兔抗體可獲得高檢測(cè)值和低背景值的檢測(cè)效果；2mg/mL生物素化的檢測(cè)物Biotin-羊抗人 抗體以1 2500稀釋作為檢測(cè)人血清中鼠疫抗體的檢測(cè)物，檢測(cè)結(jié)果顯示生物素化檢測(cè)物 Biotin-羊抗人抗體可獲得高檢測(cè)值和低背景值的檢測(cè)效果。實(shí)施例3、蛋白懸浮芯片樣品制備、檢測(cè)及結(jié)果判定1、待測(cè)樣品制備[0079]用樣品稀釋液將待測(cè)樣本配置為不同濃度樣本進(jìn)行蛋白懸浮芯片檢測(cè)。2、樣品的檢測(cè)及結(jié)果判定檢測(cè)過(guò)程全部反應(yīng)均在96孔濾板上進(jìn)行，檢測(cè)過(guò)程如下1)每孔加入50 μ L含相應(yīng)編碼微球的工作溶液，用清洗液洗滌并用真空泵抽濾；2)加入50 μ L檢測(cè)樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并抽濾；3)加入50 μ L適當(dāng)濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化檢測(cè)物，混勻后室溫避 光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾；4)加入50 μ L的SA-PE，混勻后室溫避光震搖10分鐘。洗液洗滌并真空泵抽濾；5)加入125 μ L的檢測(cè)緩沖液，經(jīng)蝸旋重懸混勻；6)用懸浮芯片系統(tǒng)讀取MFI數(shù)值并分析數(shù)據(jù)。3、檢測(cè)結(jié)果判定根據(jù)試驗(yàn)研究結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道，本實(shí)用新型定義蛋白懸浮芯片方法檢測(cè)鼠疫 抗體的最低檢出限(L0D值)為檢測(cè)熒光強(qiáng)度臨界值(Cutoff)對(duì)應(yīng)的檢測(cè)物濃度。其中， Cutoff的定義是采用空白對(duì)照樣品(Blank)熒光檢測(cè)信號(hào)MFI均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，即 Cutoff值為=MFI (空白對(duì)照)+3倍標(biāo)準(zhǔn)差。若檢測(cè)結(jié)果高于LOD對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度值則判定 為鼠疫抗體檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性；若檢測(cè)結(jié)果低于LOD對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度值則判定為鼠疫抗體檢測(cè)結(jié) 果陰性。實(shí)施例4、蛋白懸浮芯片對(duì)鼠疫Fl蛋白抗原特異性檢測(cè)應(yīng)用蛋白懸浮芯片檢測(cè)方法分別對(duì)兔抗結(jié)核IgG、鼠抗流感NP IgG、兔抗SARS IgG、兔抗禽流感H5W血清、兔抗鼠疫Fl IgG、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)實(shí)施 例3中檢測(cè)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，僅兔抗鼠疫FlIgG為陽(yáng)性，其余干擾抗體或蛋白均為陰性。說(shuō)明 本實(shí)用新型所建立的鼠疫抗體的蛋白懸浮芯片檢測(cè)方法與其它測(cè)試抗體均不發(fā)生交叉反 應(yīng)或非特異反應(yīng)。實(shí)施例5、蛋白懸浮芯片定量檢測(cè)模型的建立1、兔抗鼠疫FlIgG標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品制備用樣品稀釋液將兔抗鼠疫Fl IgG標(biāo)準(zhǔn)品由滴度為0. 08mg/mL以4倍倍比梯度稀 釋至滴度為73. 6pg/mL成系列濃度樣品。2、劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制按照實(shí)施例3中的檢測(cè)方法檢測(cè)上述系列濃度樣品，并根據(jù)蛋白懸浮芯片系統(tǒng)檢 測(cè)結(jié)果繪制劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖2所示)。其中，X軸代表抗體濃度，Y軸代表懸浮 芯片儀檢測(cè)的熒光值(MFI)。每個(gè)數(shù)據(jù)代表3次的檢測(cè)結(jié)果平均值，坐標(biāo)軸以對(duì)數(shù)-對(duì)數(shù)關(guān) 系設(shè)定，圖2中兔抗鼠疫Fl IgG的濃度(ng/mL)分別為=Sl 0. 0763, S2 0. 305, S3 :1. 221， S4 4. 883，S5 :19. 531，S6 :78. 125，S7 :312. 5，S8 :1250. 0，S9 :5000. 0，SlO :20000. 0。蛋白懸浮芯片系統(tǒng)根據(jù)檢測(cè)結(jié)果擬合兔抗鼠疫FlIgG劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程FI = -7. 99831+(16838. 6+7. 99831)/[1+(Cone/1006. 33)^ 53611]°'1987013、蛋白懸浮芯片檢測(cè)兔抗鼠疫Fl IgG的靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍根據(jù)最低檢出限定義和劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，本實(shí)用新型即蛋白懸浮芯片方 法檢測(cè)兔抗鼠疫 FlIgG 的靈敏度為50. 3pg/mL(Cutoff = 8，Blank = 8，SD = 0)。本實(shí)用新型定義最高檢出限為使編碼微球的結(jié)合位點(diǎn)處于飽和狀態(tài)的檢測(cè)物濃度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線隨著兔抗鼠疫FlIgG濃度的升高，其對(duì)應(yīng)的MFI值也隨之遞增，當(dāng)兔抗鼠 疫FlIgG濃度達(dá)到0. 02mg/mL時(shí)，抗原抗體的免疫反應(yīng)達(dá)到飽和狀態(tài)，MFI值開(kāi)始進(jìn)入平臺(tái) 期，說(shuō)明樣品中的待檢物濃度過(guò)高，需要將樣品稀釋后再檢測(cè)。因此，根據(jù)最低檢出限與最高檢出限可以判定本實(shí)用新型即蛋白懸浮芯片定量檢 測(cè)兔抗鼠疫Fl IgG的動(dòng)態(tài)范圍為1. 22 20000ng/mL。實(shí)施例6、蛋白懸浮芯片方法與ELISA方法檢測(cè)兔抗鼠疫Fl抗體的比較1、生物素-親和素ELISA (BAS-ELISA)檢測(cè)方法作為對(duì)比，生物素-親和素ELISA采用包括下列步驟1)向普通ELISA微孔板每 孔加入50 μ L用PBS緩沖液稀釋的鼠疫Fl蛋白1-50 μ g，4°C靜止過(guò)夜；2)加入封閉液，在37°C封閉2小時(shí)；3)洗液洗3次，拍干；4)加入檢測(cè)樣品，每孔50 μ L，室溫放置40分鐘；洗液洗3次，拍干；5)加入適量生物素化檢測(cè)物，每孔50 μ L，室溫放置30分鐘；洗液洗3次，拍干；6)加入適量SA/HRP (辣根酶標(biāo)記鏈霉親和素)，50 μ L/孔，室溫放置3分鐘；洗液 洗3次，拍干；7)加入TMB顯色液(可溶型單組分TMB底物溶液)顯色，50 μ L/孔，室溫放置10 分鐘；8)用 2Μ H2SO4 終止反應(yīng)；9)應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)讀A450nm數(shù)值。2、樣品的蛋白懸浮芯片檢測(cè)方法采用間接法測(cè)抗體的免疫學(xué)檢測(cè)模式，檢測(cè)過(guò)程中全部反應(yīng)均在96孔濾板上進(jìn) 行。1)每孔加入50 μ L含相應(yīng)編碼微球的工作溶液，洗液洗滌并用真空泵抽濾2次；2)加入50μ L檢測(cè)樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并抽濾3次；3)加入50 μ L適當(dāng)濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化抗體，混勻后室溫避光 震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾3次；4)加入50 μ L的SA-PE，混勻后室溫避光震搖10分鐘。用清洗液洗滌并真空泵抽 濾3次；5)加入125 μ L的檢測(cè)緩沖液，經(jīng)蝸旋重懸混勻；6)用Bio-Plex蛋白懸浮芯片系統(tǒng)讀取MFI數(shù)值并分析數(shù)據(jù)。3、兩種檢測(cè)方法的靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍及相關(guān)性的比較制備的相同一組兔抗鼠疫Fl抗體樣品用樣品稀釋液4倍比稀釋同時(shí)應(yīng)用懸浮芯 片和ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。繪制ELISA方法檢測(cè)兔抗鼠疫Fl抗體的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖中橫坐 標(biāo)為樣品滴度，縱坐標(biāo)為吸光度值，坐標(biāo)軸取對(duì)數(shù)-對(duì)數(shù)關(guān)系)，并與蛋白懸浮芯片方法結(jié) 果進(jìn)行比較。根據(jù)兩種方法標(biāo)準(zhǔn)曲線蛋白懸浮芯片方法如，靈敏度為1.22ng/mL，線性檢測(cè) 范圍1. 22 20000ng/mL ；ELISA方法如圖3所示，靈敏度為312. 5ng/mL,線性檢測(cè)范圍 312. 5 20000ng/mL?？梢缘贸鼋Y(jié)論檢測(cè)相同兔抗鼠疫Fl抗體樣品，蛋白懸浮芯片方法 比ELISA方法具有更高的檢測(cè)靈敏度，即高100倍；并且具有更寬的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍，即高2個(gè)數(shù)量級(jí)。另外，將兩種方法檢測(cè)結(jié)果在312. 5 20000ng/mL范圍內(nèi)進(jìn)行比較，如圖4所示 可以判定蛋白懸浮芯片方法與ELISA方法有良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0. 9994。實(shí)施例7、人血清樣品的檢測(cè)1、人血清樣品的準(zhǔn)備將人血清用樣品稀釋液1 10稀釋(人血清樣本5 μ L加樣品稀釋液50 μ L混 勻)后用于蛋白懸浮芯片檢測(cè)。2、人血清樣品的檢測(cè)1)每孔加入50 μ L含相應(yīng)編碼微球的工作溶液，用清洗液洗滌并用真空泵抽濾；2)加入50 μ L待檢測(cè)人血清樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并 抽濾；3)加入50 μ L適當(dāng)濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化羊抗人抗體，混勻后室 溫避光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾；4)加入50 μ L的SA-PE，混勻后室溫避光震搖10分鐘。洗液洗滌并真空泵抽濾；5)加入125 μ L的檢測(cè)緩沖液，經(jīng)蝸旋重懸混勻；6)用懸浮芯片系統(tǒng)讀取MFI數(shù)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定待檢測(cè)人血清中鼠疫抗體 的濃度。經(jīng)過(guò)多次重復(fù)試驗(yàn)，生物素化羊抗人IgG稀釋比例選用1 2500稀釋，SA-PE稀 釋比例選用1 300稀釋，經(jīng)過(guò)對(duì)94份人血清的檢測(cè)，所得的MFI值的均值與其標(biāo)準(zhǔn)差的 3倍之和為作為判斷陰陽(yáng)性的界值，即C utoff值為632. 35，換算為濃度值是9. 6ng/mL，檢 測(cè)得到的MFI值如果大于632. 35，即血清中的西尼羅濃度超過(guò)9. 6ng/mL可視為鼠疫抗體陽(yáng) 性可能被鼠疫感染，如果MFI值小于632. 35，即血清中的鼠疫抗體濃度低于9. 6ng/mL可判 斷為鼠疫抗體陰性，未感染鼠疫病毒或鼠疫病毒隱性攜帶者。
權(quán)利要求1.一種檢測(cè)血清中鼠疫抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，該芯片系統(tǒng)包括芯 片基體、加液系統(tǒng)、懸浮芯片檢測(cè)儀和計(jì)算機(jī)，其中，芯片基體內(nèi)裝有相關(guān)緩沖溶液和待測(cè) 抗體，相關(guān)緩沖液中設(shè)置有043號(hào)編碼微球，編碼微球上包被有捕獲抗原，懸浮芯片檢測(cè)儀 包括微細(xì)管檢測(cè)通道和檢測(cè)激光，計(jì)算機(jī)與懸浮芯片檢測(cè)儀相連，并記錄、分析懸浮芯片檢 測(cè)儀的測(cè)量結(jié)果。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，所述相關(guān)緩沖溶液包括用于 所述待測(cè)抗體稀釋的樣品稀釋液、稀釋所述編碼微球所用的微球稀釋液、稀釋所述生物素 標(biāo)記的二抗所用的抗體稀釋液、每個(gè)反應(yīng)之后洗滌編碼微球所用的微球清洗液、SA-PE稀釋 液、檢測(cè)緩沖液。
3.如權(quán)利要求2所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，所述捕獲抗原優(yōu)選為鼠疫Fl蛋白。
4.如權(quán)利要求2所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，所述待測(cè)抗體為血清樣品。
5.如權(quán)利要求2所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，所述生物素標(biāo)記的二抗優(yōu)選 為Biotin-羊抗兔IgG和/或Biotin-羊抗人IgG0
6.如權(quán)利要求2所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，所述熒光信號(hào)檢測(cè)物為鏈親 和素-藻紅蛋白。
7.如權(quán)利要求1所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，所述芯片基體為96孔濾板或者微量離心管。
8.如權(quán)利要求1所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，所述檢測(cè)激光包括用激發(fā)所 述編碼微球基質(zhì)中的顏色、識(shí)別編碼微球分類編碼以確定檢測(cè)項(xiàng)目的紅色激光，用于激發(fā) 并識(shí)別待測(cè)分子的顏色信號(hào)、記錄信號(hào)強(qiáng)弱以檢測(cè)所述待測(cè)抗體的含量的綠色激光。
專利摘要本實(shí)用新型公開(kāi)了一種檢測(cè)血清中鼠疫抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，包括芯片基體、加液系統(tǒng)、懸浮芯片檢測(cè)儀和計(jì)算機(jī)，芯片基體內(nèi)裝有相關(guān)緩沖溶液和待測(cè)抗體，相關(guān)緩沖液中設(shè)置有編碼微球，編碼微球上包被捕獲抗原，加液系統(tǒng)依次向芯片基體中加入生物素標(biāo)記的二抗和/或SPA、熒光信號(hào)檢測(cè)物，懸浮芯片檢測(cè)儀包括微細(xì)管檢測(cè)通道和檢測(cè)激光，編碼微球依次通過(guò)微細(xì)管檢測(cè)通道，檢測(cè)激光激發(fā)并識(shí)別編碼微球的顏色及其上待測(cè)物的顏色，計(jì)算機(jī)與懸浮芯片檢測(cè)儀相連，并記錄、分析懸浮芯片檢測(cè)儀的測(cè)量結(jié)果。蛋白懸浮芯片技術(shù)利用微球在溶液中反應(yīng)，利用激光檢測(cè)技術(shù)，提高了樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，具有優(yōu)于片膜芯片的操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK201917573SQ20102062841
公開(kāi)日2011年8月3日 申請(qǐng)日期2010年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月24日
發(fā)明者張志華, 張曉龍, 楊宇, 楊永莉, 王靜 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院