豬流行性腹瀉病毒抗體捕獲elisa檢測(cè)方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于動(dòng)物免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種豬流行性腹瀉病毒抗體捕獲 ELISA檢測(cè)方法及應(yīng)用，本方法適用于臨床豬群中豬流行性腹瀉病毒血清抗體的快速檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬流行性腹瀉（Porcine Epidemic Diarrhea,簡(jiǎn)稱(chēng)PED)是由豬流行性腹瀉病毒 (Porcine Epidemic Diarrhea Virus，簡(jiǎn)稱(chēng)PEDV)引起的一種急性高度接觸性腸道傳染病， 以水樣腹瀉、嘔吐和脫水為主要特征，不同日齡和品種的豬均易感，其中對(duì)10日齡以?xún)?nèi)仔 豬的危害最為嚴(yán)重，發(fā)病率和病死率均可達(dá)100%。該病于1791年首次發(fā)生于英國(guó)并在歐 洲普遍流行，被稱(chēng)作"流行性病毒腹瀉（epidemic viral diarrhea, EVD)"。1976年英國(guó)豬 群中再次出現(xiàn)了病毒性腹瀉，所有日齡的豬均可感染發(fā)病，為了與1971年所發(fā)生的EVD相 區(qū)別，將這次發(fā)生的腹瀉稱(chēng)為EVD 2型。1978年比利時(shí)學(xué)者從一份標(biāo)記為CV777的糞便樣 品中分離到病毒，證實(shí)該病毒能引起哺乳仔豬和育肥豬發(fā)病，于是將這一疾病命名為豬流 行性腹瀉（PED)，并沿用至今。我國(guó)1973年在豬群中發(fā)生傳染性腹瀉，1984年證實(shí)PEDV在 我國(guó)存在，2006年在國(guó)內(nèi)出現(xiàn)PED流行，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2010年以來(lái) PED在包括我國(guó)在內(nèi)的多個(gè)亞洲國(guó)家爆發(fā)流行，嚴(yán)重制約了亞洲國(guó)家養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。即 使在之前從未出現(xiàn)過(guò)PED流行的美國(guó)也在2013年出現(xiàn)了 PED的流行，給美國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了 嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 血清抗體水平檢測(cè)在PEDV流行病學(xué)調(diào)查、疫苗免疫效果評(píng)價(jià)等方面具有廣泛的 應(yīng)用，目前檢測(cè)PEDV血清抗體的方法主要有中和試驗(yàn)、間接免疫熒光試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸 附試驗(yàn)（ELISA)，3種檢測(cè)方法均具有特異敏感的特點(diǎn)，其中中和試驗(yàn)是最經(jīng)典最可靠的方 法，但中和試驗(yàn)和間接免疫熒光試驗(yàn)均存在實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、技術(shù)要求高和檢測(cè)成本高的問(wèn)題， 且兩種方法不適合大規(guī)模樣品的檢測(cè)和基層使用，而酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)的操作簡(jiǎn) 單快速、成本低廉、可以同時(shí)檢測(cè)大量樣品，對(duì)技術(shù)條件要求較低，因此發(fā)展PEDV抗體的 ELISA檢測(cè)方法將為我國(guó)豬流行性腹瀉的快速準(zhǔn)確診斷提供有力的工具，從而為養(yǎng)豬業(yè)的 健康發(fā)展保駕護(hù)航。
[0004] 目前已經(jīng)公布的PEDV抗體檢測(cè)方法的專(zhuān)利文獻(xiàn)有兩個(gè)，分別是黃偉堅(jiān)等的"檢測(cè) 豬流行性腹瀉病毒抗體的間接ELISA試劑盒"（專(zhuān)利【申請(qǐng)?zhí)枴?01310701145X)和李彬等的 "檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒抗體的ELISA試劑盒"（專(zhuān)利【申請(qǐng)?zhí)枴?014102242274)。黃偉堅(jiān)等 采用的是間接ELISA方法，所用的抗原蛋白是PEDV N蛋白內(nèi)部的主要親水區(qū)序列135-319 位氨基酸；李彬等也是采用的間接ELISA方法，而所用抗原是原核表達(dá)的PEDV完整N蛋白。 但是上述文獻(xiàn)還存在如表1所述的缺陷，這正是本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有間接ELISA存在的非特異性反應(yīng)問(wèn)題，用制備的針對(duì) PEDV N蛋白的單克隆抗體包被ELISA板，捕獲原核表達(dá)的PEDV完整N蛋白，建立一種檢測(cè) 豬流行性腹瀉病毒（PEDV)抗體的捕獲ELISA方法，用于豬流行性腹瀉病毒抗體的檢測(cè)、流 行病學(xué)調(diào)查及疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)等。
[0006] 本發(fā)明采用抗PEDV N蛋白的單克隆抗體包被ELISA板，再捕獲原核表達(dá)的PEDV 完整N蛋白作為抗原，在檢測(cè)方法的建立、抗原選擇、抗原吸附方式等方面與黃偉堅(jiān)、李彬 等的報(bào)道的方法均有本質(zhì)的不同。本發(fā)明通過(guò)單克隆抗體主動(dòng)吸附N蛋白可以最大程度上 減少雜質(zhì)蛋白和無(wú)活性蛋白的結(jié)合，從而減少非特異性反應(yīng)，提高檢測(cè)方法的特異性和靈 敏性。
[0007] 本發(fā)明應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)，獲得表達(dá)純化的PEDV N蛋白并制備了 針對(duì)PEDV N蛋白的單克隆抗體，在此基礎(chǔ)上建立了豬流行性腹瀉病毒（PEDV)抗體捕獲酶 聯(lián)免疫吸附（ELISA)檢測(cè)方法，并對(duì)其性能進(jìn)行了測(cè)定。所建立的方法特異性好、靈敏度 高、檢測(cè)結(jié)果可靠，適用于豬群中豬流行性腹瀉病毒（PEDV)抗體的檢測(cè)。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述：
[0009] 1.本發(fā)明構(gòu)建了 PEDV完整N蛋白的重組表達(dá)菌株，表達(dá)純化了 PEDV N蛋白：
[0010] 以豬流行性腹瀉病毒（PEDV) AJ1102株病毒基因組為模版進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增獲得 PEDV N基因，擴(kuò)增用上下游引物中分別引入了 BamH I和Hind III酶切位點(diǎn)，將擴(kuò)增的N基 因經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切后連接到pET-30a載體的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，構(gòu)建了 pET-30a-N 重組質(zhì)粒，并經(jīng)雙酶切鑒定，將鑒定正確的pET-30a-N質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑 取陽(yáng)性菌落。將陽(yáng)性菌于37°C培養(yǎng)，待菌液OD值達(dá)到0. 4-0. 6時(shí)加入終濃度為0. 8mmol/L 的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，7h后收集菌體，低溫高壓破碎，分別對(duì)沉淀和上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒 定。根據(jù)鑒定結(jié)果，對(duì)上清中的N蛋白通過(guò)Ni柱親和純化，獲得純化的PEDV N蛋白。
[0011] 2.本發(fā)明制備了一株針對(duì)PEDV N蛋白的單克隆抗體：
[0012] 以純化的PEDV N蛋白為免疫原，免疫BALB/c小鼠，經(jīng)兩次免疫后檢測(cè)小鼠血清效 價(jià)，取達(dá)到免疫效價(jià)要求的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，用原核表的的PEDV N蛋白 包被ELISA板，建立ELISA方法對(duì)獲得的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，經(jīng)過(guò)三輪篩選，獲得一株可 以穩(wěn)定分泌抗PEDV N蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株N2D1，申請(qǐng)人將該雜交瘤細(xì)胞株命名為雜 交瘤細(xì)胞株N2D1，于2014年9月23日送交中國(guó).武漢.武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中 心保藏，其保藏號(hào)為：CCTCC NO !C2014174。
[0013] 3.本抗體捕獲ELISA檢測(cè)方法的相關(guān)試劑材料：
[0014] (I)ELISA板：以雜交瘤細(xì)胞株N2D1分泌的單克隆抗體包被ELISA板，用2%牛血 清白蛋白（BSA)封閉Ih后加入原核表達(dá)并經(jīng)純化的N蛋白進(jìn)行吸附結(jié)合，在超凈工作臺(tái)中 風(fēng)干后密閉封裝，4°C保存。
[0015] (2)洗滌液：含0· 05 %吐溫20的磷酸鹽緩沖液（PBST)
[0016] (3)血清稀釋液：含5% (m/v)脫脂奶的PBST
[0017] (4)封閉液：含