專利名稱：使用多功能生物素類似物的生物分子標(biāo)記的制作方法
使用多功能生物素類似物的生物分子標(biāo)記本發(fā)明涉及生物素類似物，以及使用其標(biāo)記靶結(jié)構(gòu)和生物分子，例如體內(nèi)或體外的肽和蛋白的方法對細(xì)胞信號通路中蛋白表達、定位和/或構(gòu)象變化的追蹤需要創(chuàng)造在體內(nèi)用對具有熒光基團或其他有用的探針的蛋白進行位點特異性標(biāo)記的通用工具。傳統(tǒng)的化學(xué)方法依賴于半胱氨酸或賴氨酸側(cè)鏈的親核性，但對于體內(nèi)應(yīng)用太過混雜?；蚍椒ǎ缗c綠色熒光蛋白(GFP)融合，攜帶了大量負(fù)荷(GFP含有238個氨基酸)，并且在變色范圍和分光鏡讀出的性質(zhì)上很有限。最近幾年，引進了許多用于把小分子探針位點特異性地加到具有特定的肽序列的蛋白上的方法，包括 TetraCys/FlAsH 體系(B. A. Griffin, S. R. dams, R. Y. Tsien, Science, 1998，281，269-272)，HexaHis 標(biāo)記(S. Lata, Μ. Gavutis, R. Tampe, J. Piehler, JACS，2006， 128,2365-2372),以及 polyAsp 標(biāo)簽(H. Nonaka，S. Tsukiji, A. Ojida, I. Hamachi, JACS, 2007，129，15777-157779)。多種酶介導(dǎo)的標(biāo)記體系也被報道，包括那些使用分選酶A/ SorTag 的(M. W. Popp, J. M. Antos, G. M. Grotenbreg, E. Spooner, H. L. Ploegh, Nature Chem. Biol. 2007,3, 707-708 ；Τ.Tanaka,Τ. Yamamoo,S. Tsukiji,Τ. Nagmune,CemBioChem, 2008,9, 802-807)，使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶 /Q-tag 的(C. W. Lin, Α. Y. Ting, JACS, 2006，128，4542-4543)， 使用生物素連接酶的(I. Chen，Μ. Howarth, W. Lin, Α. Y. Ting, Nature Methods，2005，2， 99-104 ；M. Howarth, K. Takao, Y. Hyashi, A. Y. Ting, PNAS，2005，102,7583-7588 ；M. Howarth et al. Nature Methods，2006，3，267-273)以及使用硫辛酸連接酶的(M. Fernandez-Suarez et al. Nature Biotech. 2007,25,1483-1487 ；H.Baruh, S.Puthebveeti1, Y.A.Choi, S. Shah, Α. Y. Ting, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2008，47，7018—7021)。許多天然酶演變了底物特異性標(biāo)記以實現(xiàn)其生物學(xué)功能。一個實例是大腸桿菌酶生物素連接酶(BirA)，其參與將來源于重碳酸鹽的CO2轉(zhuǎn)化為有機酸以形成多種細(xì)胞代謝物(Chapman-Smith et al. J. Nutr. 129 :477S_484S，1999)。其在細(xì)菌中只有一種天然底物生物素羧基載體蛋白(BCCP)，其使賴氨酸122生物素化以使其準(zhǔn)備被重碳酸鹽羧化。 Schatz等使用肽篩選確定了能夠被識別并且被BirA酶促生物素化的最小的，15個氨基酸的月太·歹IJ (Schatz et al. Biotechnology 11 1138-1143,1993 ；Beckett et al. Protein Sci. 8 921-929,1999.)。上述 15 個氨基酸的序列 TTNWVAQAFKMTFDP (SEQ. ID No. 19)是最有效的從噬菌體展示文庫中發(fā)酵生物素連接酶的15個氨基酸受體肽序列(I. Chen，Y.-Α. Choi and A. Y. Ting，J. Am. Chem. Soc. 2007，129，6619)。將這個被稱為〃 Avi_Tag 〃 的改性序列引入感興趣的蛋白從而在體外或活菌中進行位點特異性生物素化的純化的BirA和克隆載體是有售的。(Avidity，Boulder, Colo. USA)是一個源自肺炎克雷伯菌BCCP的72 個氨基酸的序列，由Irwitrogen以商品名BioEase 提供。BioEase 表達體系提供了一種表達、純化以及檢測生物素化重組蛋白的方法。BioEase 載體包括一個源自肺炎克雷伯菌草酰乙酸脫羧酶的72個氨基酸的序列，其能夠在體外指導(dǎo)特定賴氨酸殘基的生物素化。載體上制得的蛋白被表達為帶有這個序列的融合蛋白。生物素(維生素H或B7)以及其類似物在以前也被描述涉及在體內(nèi)或體外標(biāo)記肽和蛋白。已知BirA能高選擇性地連接酮生物素到包括在特定的15個氨基酸序列中的賴氨酸的 α-氨基上(Chen et al Nature Meth. 2005,2,99-104 ；McNeill et al. Organic Lett. 2006 8，4593-4595)。使用酮生物素的問題在于在缺乏酶BirA時，酮基也相對活潑， 導(dǎo)致其與生物素連接酶或反應(yīng)體系中的其它蛋白上的賴氨酸側(cè)鏈反應(yīng)。而且，該化合物被發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生一個抑制BirA連接產(chǎn)率到 50%的產(chǎn)物。其它的生物素類似物也被制備出來。除其他外，Ting還等制備了，特別是脫硫生物素疊氮化物、順-N-炔丙基生物素、以及反-N-炔丙基生物素，并且將這些作為來源于多 f ·禾中白勺白勺(Human, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis,Pyrococcus horikoshii,Trypanosoma cruzi,Glardia Iambiia,Methanococcus jannaschii 禾口 Escherichia coli (BirA)(Slavoff et al.J.Am. Chem. Soc. ,2008,130, 1160)。據(jù)證明，釀酒酵母酶可以使用順-N-炔丙基生物素，而超嗜熱古菌酶可以使用脫硫生物素和順-N-炔丙基生物素作為底物。然而，這些類似物沒有以與天然生物素同樣的水平加成到15-氨基酸受體肽上。此外，由于生物素上的正交基團的位置，可以預(yù)料這些生物素類似物對抗生物素蛋白、鏈霉親和素、抗生物素標(biāo)記抗體或其它與抗生物素連接的蛋白僅具有低親合力。一旦與適合的反應(yīng)物反應(yīng)，這些分子可能表現(xiàn)出對這些蛋白更低的親合力。本發(fā)明的一個目的是提供一種新的生物素類似物，其為生物素連接酶的底物，并且以可接受的，理想的與天然生物素接近的效率水平，加成到特定的肽上。本發(fā)明進一步的目的在于提供一種新的生物素類似物，其具有可接受的，優(yōu)選可逆的，與抗生物素蛋白、鏈霉親和素、或它們的其它突變體或同系物的結(jié)合親合力。本發(fā)明更進一步的目的在于提供一種新的生物素類似物，其與到目前為止制備的生物素類似物相比通過更少的步驟和/或更高的產(chǎn)率更容易地合成。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種采用新的生物素類似物作為親和標(biāo)簽或進一步連接分子探針的共價連接特異性位點標(biāo)記靶生物分子結(jié)構(gòu)，例如蛋白質(zhì)和肽的方法。因此，本發(fā)明的第一方面提供了一種生物素類似物，其包含天然生物素的脲環(huán)，以及至少一個經(jīng)修飾的噻吩環(huán)或一個經(jīng)修飾的側(cè)鏈，其具有功能性端基以及位于側(cè)鏈其它位置的至少一個生物正交性化學(xué)反應(yīng)基團。優(yōu)選地，所述生物素類似物具有天然生物素未經(jīng)修飾的噻吩環(huán)，僅具有一個經(jīng)修飾的側(cè)鏈，其具有功能性端基以及位于側(cè)鏈其它位置的至少一個生物正交性化學(xué)反應(yīng)基團。然而，可以意識到，噻吩環(huán)的硫可以被選自CH2、O、NH和C = O的其它基團所取代，例如， 當(dāng)經(jīng)修飾的戊酸側(cè)鏈中的功能性基團與存在于噻吩環(huán)的硫原子不穩(wěn)定時。作為選擇的，所述類似物可以包含具有經(jīng)修飾的戊酸側(cè)鏈的脫硫生物素。優(yōu)選地，所述功能性端基選自包括羧酸、醇、醛、胺、硫醇和鹵素的組。天然生物素的結(jié)構(gòu)如下
權(quán)利要求
1.一種新的生物素類似物，包含天然生物素的脲環(huán)、任選地包含被修飾的噻吩環(huán)以及一個被修飾的側(cè)鏈，其具有一個功能性端基和位于側(cè)鏈其它位置的至少一個生物正交性化學(xué)反應(yīng)基團。
2.如權(quán)利要求1所述的新的生物素類似物，其中功能性端基選自由羧酸、醛、醇、胺、硫醇和鹵素組成的組。
3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的生物素類似物，其中至少一個生物正交性化學(xué)反應(yīng)基團選自由疊氮化物、炔、烯、雜環(huán)基團、二烯基團和/或一個或多個選自S、N、Se、P和0 的雜原子組成的組。
4.如權(quán)利要求1、權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所述的生物素類似物，其中反應(yīng)基團位于生物素類似物戊酸側(cè)鏈上，或是戊酸側(cè)鏈的一部分，或取代了戊酸側(cè)鏈。
5.如前述權(quán)利要求之一所述的生物素類似物，其中生物素類似物中噻吩環(huán)的硫環(huán)被其它基團所取代，其它基團選自由CH2、0、NH和C = 0的組。
6.如權(quán)利要求1至4任一項所述的生物素類似物，其中所述生物素類似物為具有被修飾側(cè)鏈的去硫生物素。
7.如權(quán)利要求3所述的生物素類似物，其具有如下通式
8.如權(quán)利要求7所述的生物素類似物，其中功能性端基選自由羧酸、醛、醇、胺、硫醇和鹵素組成的組。
9.如權(quán)利要求7或權(quán)利要求8所述的生物素類似物，其中生物正交反應(yīng)基團位于戊酸側(cè)鏈1至5的任一位點。
10.如權(quán)利要求9所述的生物素類似物，其中生物正交反應(yīng)基團在生物素類似物戊酸側(cè)鏈的2位點上提供。
11.如權(quán)利要求7、8或9所述的生物素類似物，其中R選自以下側(cè)鏈
12.如權(quán)利要求7至10任一項所述的生物素類似物，其中保留了所述類似物戊酸側(cè)鏈的5-碳骨架。
13.如權(quán)利要求7至10任一項所述的生物素類似物，其中戊酸側(cè)鏈的骨架含有1至10 個碳原子。
14.如權(quán)利要求12或13所述的生物素類似物，其中戊酸側(cè)鏈的骨架包括ー個或多個雜 原子，雜原子選自由硫、氮、硒、磷或氧組成的組。
15.一種新的生物素類似物，具有結(jié)構(gòu)
16.一種新的生物素類似物，具有結(jié)構(gòu)
17.一種新的生物素類似物，具有結(jié)構(gòu)
18.一種新的生物素類似物，具有結(jié)構(gòu)
19.一種新的生物素類似物，具有結(jié)構(gòu)
20.一種新的生物素類似物，具有結(jié)構(gòu)
21.如前述任一項權(quán)利要求所述的生物素類似物，進一步地被修飾，在端基結(jié)合活性酯形成中間體化合物。
22.如權(quán)利要求21所述的生物素類似物，具有以下通式
23.如前述任一項權(quán)利要求所述的生物素類似物，其以中等至高的親合力與抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、或它們的同族體，和/或抗生物素抗體和/或合成的生物素受體結(jié)I=I ο
24.如權(quán)利要求23所述的生物素類似物，其中所述類似物可以通過環(huán)境的變化或被更緊密的結(jié)合配體取代而從其與抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素或抗生物素抗體中釋放。
25.如權(quán)利要求4至24中任一項所述的生物素類似物，其中所述生物素類似物的戊酸側(cè)鏈包括在生物素類似物的雙環(huán)核心和端基以及生物正交基團之間具有可斷裂的連接體。
26.被如前任一項權(quán)利要求所述的生物素類似物標(biāo)記的特定的靶結(jié)構(gòu)。
27.如權(quán)利要求26所述的特定的靶結(jié)構(gòu)，其中所述靶結(jié)構(gòu)通過標(biāo)準(zhǔn)耦合化學(xué)連接到生物素類似物上。
28.如權(quán)利要求26所述的特定的靶結(jié)構(gòu)，其中所述靶結(jié)構(gòu)為蛋白或肽，并且包括作為生物素類似物連接到蛋白或肽的底物的受體肽。
29.如權(quán)利要求28所述的特定的靶結(jié)構(gòu)，其中所述受體肽為源自大腸桿菌或其突變體或同族體之一的生物素連接酶的底物。
30.如權(quán)利要求28或權(quán)利要求29所述的特定的靶結(jié)構(gòu)，其中所述受體肽通過肽鍵或可斷開的鍵或連接體融合到靶蛋白上。
31.如權(quán)利要求4至25中任一項所述的生物素類似物，或當(dāng)依賴于權(quán)利要求4至25 時，如權(quán)利要求26至30中任一項的特定的靶結(jié)構(gòu)，其中所述類似物被修飾的戊酸側(cè)鏈上的生物正交功能基與反應(yīng)性基團反應(yīng)，從而進一步將所述類似物或靶結(jié)構(gòu)功能化。
32.如權(quán)利要求31所述的生物素類似物或特定的靶結(jié)構(gòu)，其中所述生物素類似物具有被直接檢測的方法，包括熒光試劑、冷光試劑、核磁共振造影劑、正電子發(fā)射成像試劑、磷光試劑的活化或催化取代。
33.如權(quán)利要求31所述的生物素類似物或特定的靶結(jié)構(gòu)，其中所述生物素類似物被間接檢測的標(biāo)簽標(biāo)記，所述標(biāo)簽選自由酶、酶的底物、抗體、抗體片段、抗原、半抗原、配體、親和分子、發(fā)色體底物、蛋白、肽、核酸、碳水化合物和脂質(zhì)組成的組。
34.標(biāo)記靶結(jié)構(gòu)的方法，包括通過作為生物素連接酶底物的受體肽連接根據(jù)權(quán)利要求 1至25之一的生物素類似物與靶結(jié)構(gòu)的步驟。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，進一步包含所述類似物的戊酸側(cè)鏈上的生物正交功能基與反應(yīng)基團的反應(yīng)，以進一步將所述類似物或靶結(jié)構(gòu)功能化，所述反應(yīng)發(fā)生在靶蛋白與受體肽和/或生物素類似物連接之前或之后。
36.如權(quán)利要求34或35所述的方法，其發(fā)生在體外或體內(nèi)。
37.如權(quán)利要求34、35或36所述的方法，其中所述靶結(jié)構(gòu)為細(xì)胞表面蛋白。
38.如權(quán)利要求34至37任一項所述的方法，其中靶蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達生物素連接酶。
39.如權(quán)利要求37或權(quán)利要求38所述的方法，其中所述細(xì)胞為原核的或真核的細(xì)胞。
全文摘要
新的生物素類似物，例如2-疊氮生物素，包含天然生物素的脲環(huán)和任選地包含被修飾的噻吩環(huán)，一個被修飾的側(cè)鏈，其具有功能性端基，優(yōu)選選自由羧酸、胺、醇、硫醇、醛和鹵素組成的組，以及位于側(cè)鏈其它位置的至少一個生物正交性化學(xué)反應(yīng)基團。所述類似物被用于標(biāo)記靶結(jié)構(gòu)和生物分子，例如體內(nèi)或體外的肽和蛋白。
文檔編號G01N33/50GK102439014SQ201080022171
公開日2012年5月2日 申請日期2010年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月20日
發(fā)明者威廉·C·德魯, 尼爾·R·托馬斯, 楊·永青 申請人:諾丁漢大學(xué)