專利名稱：檢測(cè)糖化血紅蛋白百分比的系統(tǒng)和方法
檢測(cè)糖化血紅蛋白百分比的系統(tǒng)和方法本申請(qǐng)要求2009年5月20日提交的題為“Test Strips and Methods forDetermining the Percentage of Glycated Hemoglobin (檢測(cè)糖化血紅蛋白百分比的測(cè)試條和方法)”的美國臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)61/180，075的權(quán)益，其公開內(nèi)容通過引用全文納入本文。
背景技術(shù)：
糖尿病是表征為胰島素缺失，高血糖和眼、腎、外周神經(jīng)、心臟及血管的并發(fā)癥高風(fēng)險(xiǎn)發(fā)展的慢性病癥。該疾病非常普遍，在美國有多到一千六百萬人患病。而且就人的痛苦和花費(fèi)來說，該疾病成本很高；估計(jì)美國用于健康護(hù)理的費(fèi)用中約七分之一用于糖尿病 護(hù)理，主要用于治療慢性并發(fā)癥。在美國，糖尿病是青年失明，腎衰竭和非外傷截肢的最常見原因。1993年完成的糖尿病控制和并發(fā)癥測(cè)試(DCCT)表明糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展與糖化血紅蛋白(GHb)測(cè)定所測(cè)量的血糖控制程度密切相關(guān)。DCCT還提供了將GHb值和血糖均值聯(lián)系起來的大量數(shù)據(jù)。因此，所述DCCT結(jié)果為用GHb作為平均血糖濃度指數(shù)來建立具體的糖尿病治療目標(biāo)創(chuàng)造了條件。理想地，血糖水平變化的早期檢測(cè)能仔細(xì)監(jiān)控和長期控制血糖濃度。需要快速精確的試驗(yàn)來檢測(cè)血糖水平。許多當(dāng)前血糖監(jiān)控測(cè)試是根據(jù)近期食物攝入或其他生活方式習(xí)慣，其可造成糖水平短期劇烈波動(dòng)。這些可能不能對(duì)血糖水平趨勢(shì)進(jìn)行精確描述且可掩蓋升高的基線水平。如上所述，先前已確立升高的血糖引起循環(huán)紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白(Hb)糖化增加和糖化Hb水平在約3個(gè)月時(shí)間內(nèi)與所述糖水平相關(guān)。因此，近期食物攝入對(duì)所述糖化Hb水平影響很小，從而提供更精確水平的血糖平均水平。已開發(fā)各種診斷試驗(yàn)和相關(guān)設(shè)備用于醫(yī)療點(diǎn)(POC)測(cè)試。鑒于POC診斷試驗(yàn)和相關(guān)設(shè)備的便利、其結(jié)果的時(shí)間性、和糖尿病的高發(fā)生率，對(duì)于發(fā)現(xiàn)糖尿病傾向以及監(jiān)控治療的早期診斷測(cè)試的需求突出了 POC診斷測(cè)試的必要性。這最適于用在非醫(yī)院環(huán)境下以及不需要抽血師的情況(即不需要抽血)。通常，POC設(shè)備可為便攜的或可運(yùn)輸?shù)?。在一些情況下，其甚至可為手持式的。此外，由于現(xiàn)有可用的測(cè)試中變化多，所以需要提供具有高靈敏度、精密度、精確性、測(cè)量可靠性且還適用于大群體的POC系統(tǒng)。本發(fā)明描述在試驗(yàn)系統(tǒng)中使用適合POC設(shè)備配置的色譜測(cè)試條，通過測(cè)量少量血液樣品中糖化血紅蛋白含量來檢測(cè)血糖水平的方法。發(fā)明概沭本發(fā)明部分基于定量分析血紅蛋白(Hb)、糖化血紅蛋白(GHb)和其他待測(cè)變體的方法的發(fā)現(xiàn)。因此本發(fā)明提供進(jìn)行所述測(cè)試的系統(tǒng)和檢測(cè)血液樣品中糖化血紅蛋白含量的方法。在一些實(shí)施方式中，本文所述系統(tǒng)和方法可用于醫(yī)療點(diǎn)(POC)測(cè)試，使用便攜甚至手持式的設(shè)備，且在一些情況下可為電池操作的。在某些實(shí)施方式中，本文所述方法可為CLIA豁免認(rèn)證(其中“CLIA”指《美國臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)修正案》)。本發(fā)明一個(gè)方面提供了與標(biāo)記有第一可檢測(cè)標(biāo)記的識(shí)別血紅蛋白的抗體和標(biāo)記有第二可檢測(cè)標(biāo)記的硼酸或其衍生物偶聯(lián)的糖化血紅蛋白。
本發(fā)明另一方面提供了檢測(cè)樣品中糖化血紅蛋白百分比的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括檢測(cè)與結(jié)合所述樣品中血紅蛋白的第一試劑偶聯(lián)的第一可檢測(cè)標(biāo)記和與僅結(jié)合所述樣品中糖化血紅蛋白的第二試劑偶聯(lián)的第二可檢測(cè)標(biāo)記，和基于所述樣品中所測(cè)的第一可檢測(cè)標(biāo)記和第二可檢測(cè)標(biāo)記的含量測(cè)量樣品中糖化血紅蛋白百分比。來自所述第一可檢測(cè)標(biāo)記和所述第二可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)可任選地同時(shí)測(cè)量。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括檢測(cè)與結(jié)合所述樣品中血紅蛋白的第一試劑偶聯(lián)的第一可檢測(cè)標(biāo)記和與僅結(jié)合所述樣品中糖化血紅蛋白的第二試劑(硼酸或其衍生物)偶聯(lián)的第二可檢測(cè)標(biāo)記，和基于所述樣品中所測(cè)的第一可檢測(cè)標(biāo)記和第二可檢測(cè)標(biāo)記的含量測(cè)量樣品中糖化血紅蛋白百分比。來自所述第一可檢測(cè)標(biāo)記和所述第二可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)可任選地同時(shí)測(cè)量。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括步驟用標(biāo)記有結(jié)合血紅蛋白的第一可檢測(cè) 標(biāo)記的第一試劑和標(biāo)記有僅結(jié)合糖化血紅蛋白的第二可檢測(cè)標(biāo)記的第二試劑與釋放自樣品中細(xì)胞的血紅蛋白接觸；將所述可檢測(cè)標(biāo)記的血紅蛋白固定在固體支持物上；測(cè)量來自固定在所述固體支持物上的所述第一可檢測(cè)標(biāo)記和所述第二可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)；和基于來自所述第一可檢測(cè)標(biāo)記和所述第二可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)測(cè)量樣品中糖化血紅蛋白百分比。來自所述第一可檢測(cè)標(biāo)記和所述第二可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)可任選地同時(shí)測(cè)量。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括步驟用標(biāo)記有結(jié)合血紅蛋白的第一可檢測(cè)標(biāo)記的第一試劑和標(biāo)記有僅結(jié)合糖化血紅蛋白的第二可檢測(cè)標(biāo)記的第二試劑(硼酸或其衍生物)與釋放自樣品中細(xì)胞的血紅蛋白接觸；將所述可檢測(cè)標(biāo)記的血紅蛋白固定在固體支持物上；測(cè)量來自固定在所述固體支持物上的所述第一可檢測(cè)標(biāo)記和所述第二可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)；和基于來自所述第一可檢測(cè)標(biāo)記和所述第二可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)測(cè)量樣品中糖化血紅蛋白百分比。在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，同時(shí)測(cè)量來自所述第一可檢測(cè)標(biāo)記和所述第二可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括步驟用標(biāo)記有結(jié)合血紅蛋白的第一可檢測(cè)標(biāo)記的第一試劑和標(biāo)記有僅結(jié)合糖化血紅蛋白的第二可檢測(cè)標(biāo)記的第二試劑與釋放自樣品中細(xì)胞的血紅蛋白接觸；將包括所述可檢測(cè)標(biāo)記的糖化血紅蛋白在內(nèi)的所述可檢測(cè)標(biāo)記的血紅蛋白，固定在固體支持物的相同區(qū)域上；同時(shí)測(cè)量來自固定在所述固體支持物上的所述第一可檢測(cè)標(biāo)記和所述第二可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)；和基于來自所述第一可檢測(cè)標(biāo)記和所述第二可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)測(cè)量樣品中糖化血紅蛋白百分比。所述第一可檢測(cè)標(biāo)記為暴露于第一波長光時(shí)發(fā)出突光的第一突光團(tuán)且所述第二可檢測(cè)標(biāo)記為暴露于第二波長光時(shí)發(fā)出熒光的第二熒光團(tuán)，且檢測(cè)來自固定在所述固體支持物上的所述第一可檢測(cè)標(biāo)記和所述第二可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)是通過將固定包括糖化血紅蛋白在內(nèi)的血紅蛋白的固體支持物區(qū)域暴露于所述第一和第二波長光。本發(fā)明另一方面提供了定量檢測(cè)血液樣品中糖化血紅蛋白百分比的系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了定量檢測(cè)血液樣品中糖化血紅蛋白百分比的測(cè)試條。所述測(cè)試條包括色譜條；含有結(jié)合樣品中血紅蛋白的捕獲劑的部分所述色譜條上的涂層；所述色譜條上添加樣品的區(qū)域；和所述色譜條上包含標(biāo)記有結(jié)合血紅蛋白的第一可檢測(cè)標(biāo)記的第一試劑和標(biāo)記有僅結(jié)合糖化血紅蛋白的第二可檢測(cè)標(biāo)記的第二試劑的區(qū)域，其中所述包含有所述第一試劑和所述第二試劑的色譜條區(qū)域位于(i)添加所述樣品的區(qū)域或(ii)添加所述樣品的區(qū)域和含所述捕獲劑的區(qū)域之間，從而加入所述測(cè)試條的樣品在到達(dá)含所述捕獲劑的區(qū)域前流過含所述第一和第二試劑的區(qū)域。任選地，所述第一可檢測(cè)標(biāo)記為暴露于第一波長光時(shí)發(fā)出突光的第一突光團(tuán)且所述第二可檢測(cè)標(biāo)記為暴露于第二波長光時(shí)發(fā)出突光的第二突光團(tuán)。在一個(gè)不例性實(shí)施方式中，所述第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記同時(shí)檢測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述測(cè)試條包括色譜條；含有結(jié)合樣品中血紅蛋白的捕獲劑的部分所述色譜條上的涂層；所述色譜條上添加樣品的區(qū)域；和所述色譜條上包含標(biāo)記有結(jié)合血紅蛋白的第一可檢測(cè)標(biāo)記的第一試劑和標(biāo)記有僅結(jié)合糖化血紅蛋白的第二可檢測(cè)標(biāo)記的第二試劑(包括硼酸或其衍生物)的區(qū)域，其中所述包含有所述第一試劑和所述 第二試劑的色譜條區(qū)域位于(i)添加所述樣品的區(qū)域或(ii)添加所述樣品的區(qū)域和含所述捕獲劑的區(qū)域之間，從而加入所述測(cè)試條的樣品在到達(dá)含所述捕獲劑的區(qū)域前流過含所述第一和第二試劑的區(qū)域。附圖
簡要說明圖I表示檢測(cè)血液樣品中示例流程圖。所述血液樣品經(jīng)裂解以從紅細(xì)胞中釋放Hb。所釋放的Hb與用第一熒光團(tuán)可檢測(cè)標(biāo)記的結(jié)合Hb (fll-Abl)的抗體和用第二熒光團(tuán)可檢測(cè)標(biāo)記的僅結(jié)合糖化Hb(fl2_BD)的硼酸衍生物BD接觸。所標(biāo)記的Hb和糖化Hb暴露于分別指向所述第一和第二熒光團(tuán)的預(yù)定波長的光以誘導(dǎo)熒光?；趤碜运龅谝缓偷诙还鈭F(tuán)的突光檢測(cè)糖化Hb的百分比。圖2表示依本發(fā)明一實(shí)施方式檢測(cè)血液樣品中糖化Hb的示意圖。所述血液樣品暴露于裂解液中以從所述紅細(xì)胞中釋放Hb。將裂解的樣品加入測(cè)試條，所述測(cè)試條包含用第一熒光團(tuán)可檢測(cè)標(biāo)記的結(jié)合Hb (fll-Abl)的抗體和用第二熒光團(tuán)可檢測(cè)標(biāo)記的僅結(jié)合糖化Hb(fl2-BD)的硼酸衍生物3-氨基苯基硼酸(PB)。所述樣品中的血紅蛋白結(jié)合標(biāo)記有所述第一熒光團(tuán)的抗體，且所述樣品中的糖化血紅蛋白結(jié)合可檢測(cè)標(biāo)記有所述第二熒光團(tuán)的硼酸衍生物。所述標(biāo)記的血紅蛋白沿著所述色譜條流向含結(jié)合(并因此捕獲或固定化)血紅蛋白的抗Hb抗體的捕獲區(qū)、檢測(cè)區(qū)或“測(cè)試帶”。所述色譜條暴露于635nm和SOOnm波長的光以誘導(dǎo)來自所述第一或第二熒光團(tuán)的熒光?；趤碜运龅谝缓偷诙晒鈭F(tuán)的熒光檢測(cè)糖化Hb的百分比。圖3表示依本發(fā)明另一實(shí)施方式檢測(cè)血液樣品中糖化Hb的另一示意圖。所述血液樣品暴露于裂解液中以從所述紅細(xì)胞中釋放Hb。所述裂解液包含用第一熒光團(tuán)可檢測(cè)標(biāo)記的結(jié)合Hb (fll-Abl)的抗體和用第二熒光團(tuán)可檢測(cè)標(biāo)記的僅結(jié)合糖化Hb (fl2-BD)的硼酸衍生物3-氨基苯基硼酸(PB)。所述樣品中的血紅蛋白結(jié)合標(biāo)記有所述第一熒光團(tuán)的抗體，且所述樣品中的糖化血紅蛋白結(jié)合可檢測(cè)標(biāo)記有所述第二熒光團(tuán)的硼酸衍生物。所述標(biāo)記的血紅蛋白加入色譜條并沿著所述色譜條流向含結(jié)合(并因此捕獲或固定化)血紅蛋白的抗Hb抗體的捕獲區(qū)、檢測(cè)區(qū)或“測(cè)試帶”。測(cè)量來自固定在所述色譜條上的所述第一可檢測(cè)標(biāo)記和所述第二可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)?；趤碜运龅谝缓偷诙晒鈭F(tuán)的信號(hào)檢測(cè)糖化Hb的百分比。圖4顯示能偶聯(lián)可檢測(cè)標(biāo)記以產(chǎn)生結(jié)合糖化Hb的可檢測(cè)標(biāo)記試劑的示例性硼酸衍生物。圖5a顯示在3’位置含氨基殘基的硼酸與熒光團(tuán)DY-782的結(jié)合。圖5b顯示在3’位置含巰基殘基的硼酸與熒光團(tuán)DY-636的結(jié)合。
圖6顯示不用氨基或巰基基團(tuán)時(shí)用硼酸基團(tuán)直接轉(zhuǎn)換或置換熒光團(tuán)的羧酸。圖7顯示本發(fā)明示例性測(cè)試條的示意圖。所描述的測(cè)試條為雙向側(cè)流測(cè)試條，其中加在位于或接近末端I的口 I上的液體流向末端2，且加在位于或接近末端2的口 II上的液體流向末端I。在所示測(cè)試條中，樣品加在口 I上并流向含一“測(cè)試帶”和兩“對(duì)照帶”的反應(yīng)區(qū)或捕獲區(qū)、或檢測(cè)區(qū)。測(cè)試帶含結(jié)合(并因此捕獲或固定)所述樣品中分析物的捕獲劑，例如所述測(cè)試帶可含有結(jié)合血紅蛋白的抗Hb抗體。所述對(duì)照帶“高對(duì)照”和“低對(duì)照”含結(jié)合并因此捕獲樣品中存在的對(duì)照的捕獲劑。在另一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的測(cè)試條可不包括或包括一個(gè)或多于兩個(gè)對(duì)照帶。諸如額外樣品或緩沖液如洗滌緩沖液的液體可任選地加在所示口 II上。發(fā)明詳沭本文描述的是分析血液樣品以定量確定所述血液樣品中糖化血紅蛋白百分比的 系統(tǒng)和方法。通常，本文所述方法和系統(tǒng)可用在醫(yī)療點(diǎn)(POC)設(shè)備以及其他適當(dāng)?shù)捏w外診斷(IVD)設(shè)備中。在一些實(shí)施方式中，所述POC系統(tǒng)設(shè)計(jì)為用于非技術(shù)人員現(xiàn)場測(cè)試且可為CLIA豁免認(rèn)證的。在某些情況下，本文所述方法和系統(tǒng)可用在制造相對(duì)不昂貴且因此可廣泛獲得的設(shè)備中。此外，其可用在能在相對(duì)短時(shí)間段內(nèi)(如取樣后60分鐘或更少、50分鐘或更少、40分鐘或更少、30分鐘或更少、20分鐘或更少、15分鐘或更少、10分鐘或更少、或5分鐘或更少)提供所述血樣定量分析的設(shè)備如POC設(shè)備中。本文所述的系統(tǒng)和試驗(yàn)方法可使用如 2010 年 4 月 14 日提交的題為 “Diagnostic Devices and Related Methods (診斷設(shè)備和相關(guān)方法)”的美國專利申請(qǐng)系列號(hào)12/760，518所述的設(shè)備，所述申請(qǐng)通過引用全文納入本文。血紅蛋白為給予血液紅色的載氧色素，且也是紅細(xì)胞中的主要蛋白。約有90%的血紅蛋白為血紅蛋白A (所述“A”表示成人類型)。盡管一種化學(xué)成分構(gòu)成92 %的血紅蛋白A，但約8%的血紅蛋白A由化學(xué)上稍稍不同的次要組分組成。這些次要組分包括血紅蛋白Alc、Alb、Alal、和Ala2。血紅蛋白Alc (HbAlc)是結(jié)合葡萄糖的血紅蛋白次要組分。HbAlc還指糖基化血紅蛋白、葡萄糖基化血紅蛋白或糖化血紅蛋白(GHb)。這些GHb術(shù)語在本文中可互換使用。本文所用的“血紅蛋白”(Hb)指血紅蛋白或“總”血紅蛋白的所有組分，包括糖化血紅蛋白。因此，結(jié)合、捕獲或固定血紅蛋白的試劑也結(jié)合、捕獲或固定糖化血紅蛋白。本發(fā)明一方面提供了檢測(cè)樣品中糖化血紅蛋白百分比的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括檢測(cè)與結(jié)合所述樣品中血紅蛋白的第一試劑偶聯(lián)的第一可檢測(cè)標(biāo)記和檢測(cè)與僅結(jié)合所述樣品中糖化血紅蛋白的第二試劑偶聯(lián)的第二可檢測(cè)標(biāo)記。所述樣品中的糖化血紅蛋白百分比可基于該樣品中檢測(cè)的所述第一可檢測(cè)標(biāo)記和所述第二可檢測(cè)標(biāo)記的含量確定。所述樣品可為含血紅蛋白的任何液體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述樣品是血液樣品即血滴或其他需要量的血液。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述樣品包括含分離自血液的血紅蛋白的細(xì)胞如紅細(xì)胞(“RBC”)。所述細(xì)胞可以但不必需裂解或制備成可滲透以釋放所述血紅蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述樣品為血液樣品或含分離自血液的血紅蛋白的細(xì)胞，且將所述血液或所述血細(xì)胞裂解或制備成可滲透以釋放所述細(xì)胞中的血紅蛋白。所述樣品可與裂解劑或使細(xì)胞可滲透的試劑接觸足夠的時(shí)間以釋放所述血紅蛋白。也可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他裂解方法或使之可滲透的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中可使用裂解緩沖液。例如，所述樣品可在pH 7. 5、含1%曲通(Triton) X-100、150mM NaCl的4mM磷酸緩沖液中裂解1-2分鐘，或用其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的裂解緩沖液。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可使用機(jī)械方法如高能超濾(或“超聲波降解法”)。
然后，包含釋放自所述RBC的血紅蛋白的裂解樣品可接觸標(biāo)記有結(jié)合血紅蛋白的第一可檢測(cè)標(biāo)記的第一試劑和標(biāo)記有僅結(jié)合血紅蛋白中糖化血紅蛋白(“GHb”)部分的第二可檢測(cè)標(biāo)記的第二試劑。所述第一試劑結(jié)合血紅蛋白形成第一檢測(cè)復(fù)合體。所述第二試劑結(jié)合GHb。因此，例如圖2和3所示，糖化血紅蛋白具有兩種(2)標(biāo)記，一種來自結(jié)合血紅蛋白的試劑且一種來自對(duì)糖化血紅蛋白特異的試劑。能檢測(cè)所述第一可檢測(cè)標(biāo)記和所述第二可檢測(cè)標(biāo)記且所述樣品中的糖化血紅蛋白百分比可基于該樣品中檢測(cè)的所述第一可檢測(cè)標(biāo)記和所述第二可檢測(cè)標(biāo)記的含量確定。在一個(gè)實(shí)施方式中，在檢測(cè)所述第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記前，不結(jié)合血紅蛋白的任何第一試劑和不結(jié)合糖化血紅蛋白的任何第二試劑分別從結(jié)合血紅蛋白和糖化血紅蛋白的所述第一試劑和所述第二試劑中分離?？赏ㄟ^已知或以后發(fā)現(xiàn)的任何方法，包括但不限于將所述樣品置于電場中用電泳如凝膠或毛細(xì)管電泳，或通過固定所述血紅蛋白進(jìn)行這類分離。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，血液樣品中細(xì)胞釋放的血紅蛋白接觸標(biāo)記有結(jié)合血紅蛋白的第一可檢測(cè)標(biāo)記的第一試劑和標(biāo)記有僅結(jié)合糖化血紅蛋白的第二可檢測(cè)標(biāo)記的第二試劑(硼酸或其衍生物)。然后將包括可檢測(cè)標(biāo)記的糖化血紅蛋白在內(nèi)的所述可檢測(cè)標(biāo)記的血紅蛋白定位在檢測(cè)區(qū)中，在所述檢測(cè)區(qū)中檢測(cè)所述第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)。在一個(gè)實(shí)施方式中，包括所述糖化血紅蛋白的血紅蛋白定位在相同檢測(cè)區(qū)中，在所述檢測(cè)區(qū)中測(cè)量所述第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述糖化血紅蛋白位于檢測(cè)區(qū)中如第一檢測(cè)區(qū)，在該檢測(cè)區(qū)中測(cè)量所述第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)，且未糖化血紅蛋白位于不同的檢測(cè)區(qū)域如第二檢測(cè)區(qū)域，在該檢測(cè)區(qū)中僅測(cè)量所述第一可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何定位方法。例如，所述可檢測(cè)標(biāo)記的血紅蛋白可固定在固體支持物上?？晒潭ǖ鞍椎娜魏喂腆w支持物能用于固定所述可檢測(cè)標(biāo)記的血紅蛋白。示例性固體支持物包括但不限于色譜條如側(cè)流測(cè)試條，浸潰條，微流體設(shè)備，玻璃或塑料珠、板或柱，具有或不具有玻璃或塑料涂層的磁力珠等。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他固體支持物也可用于固定所述可檢測(cè)標(biāo)記的血紅蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述固體支持物為色譜條如側(cè)流測(cè)試條或浸潰條。在另一實(shí)施方式中，所述固體支持物為微流體設(shè)備，在ELISA試驗(yàn)或微毛細(xì)管系統(tǒng)中使用的多孔塑料板。所述固體支持物可以但不必需包含結(jié)合并因此固定所述血紅蛋白的固定化捕獲齊U。在一個(gè)實(shí)施方式中，在所述樣品或可檢測(cè)標(biāo)記的血紅蛋白接觸所述固體支持物前，所述捕獲劑固定在所述支持物上。在另一實(shí)施方式中，在所述樣品加入所述固體支持物前，所述捕獲劑可加入該樣品(或存在于加入樣品的液體如裂解緩沖液中)。所述捕獲劑結(jié)合所述樣品或其他加入樣品的液體中的血紅蛋白。當(dāng)樣品加入所述固體支持物如含諸如樹脂珠或生物素/鏈霉親和素的珠的柱子時(shí)，所述捕獲劑結(jié)合所述支持物并因此固定所述結(jié)合的血紅蛋白。本文所用的術(shù)語“捕獲劑”指能被固定在固體支持物上且識(shí)別并結(jié)合樣品中血紅蛋白的部分(或組分)，從而當(dāng)其結(jié)合所述血紅蛋白時(shí)，該血紅蛋白被“捕獲”在該固體支持物上。來自結(jié)合血紅蛋白的第一可檢測(cè)標(biāo)記和結(jié)合糖化血紅蛋白的第二可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)可通過本領(lǐng)域已知的任何方法測(cè)量。來自所述第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)可以但不必需同時(shí)測(cè)量。應(yīng)理解當(dāng)包括GHb在內(nèi)的Hb被固定在固體支持物上時(shí)，僅檢測(cè)來自結(jié)合或固定在所述固體支持物上的所述可檢測(cè)標(biāo)記試劑的信號(hào)，而不檢測(cè)溶液中游離的試劑。在一些實(shí)施方式中，可能需要清洗步驟以消除任何未結(jié)合的可檢測(cè)標(biāo)記的試劑。在這些使用上述其他分離技術(shù)的實(shí)施方式中，確保僅檢測(cè)來自結(jié)合血紅蛋白和糖化血紅蛋白的可檢測(cè)標(biāo)記試劑的信號(hào)的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見。 所述血液樣品中的糖化血紅蛋白百分比可基于所述第一可檢測(cè)標(biāo)記和所述第二可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)確定。此外，可按照美國國家糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)劃(NGSP)確定所述糖尿病指數(shù)。盡管本發(fā)明方法可用于如上所述可配制為定量確定樣品中糖化血紅蛋白百分比的任何系統(tǒng)，但本文所述方法參考示例性系統(tǒng)，含色譜條的測(cè)試條。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，在樣品加入所述色譜條前，樣品如血液樣品中細(xì)胞釋放的血紅蛋白接觸標(biāo)記有結(jié)合血紅蛋白的第一可檢測(cè)標(biāo)記的第一試劑和標(biāo)記有僅結(jié)合糖化血紅蛋白的第二可檢測(cè)標(biāo)記的第二試劑。在一個(gè)實(shí)施例中，可通過將所述樣品與裂解液接觸而裂解所述樣品中的細(xì)胞。所述第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記的試劑，可例如存在于所述裂解液中，從而所述Hb —旦從所述裂解的RBC中釋放就接觸所述第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記的試劑?；蛘?，所述樣品先經(jīng)過裂解且隨后該裂解的樣品接觸所述第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記的試劑。所述第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記的試劑分別結(jié)合所述血紅蛋白和糖化血紅蛋白后，將所述樣品加入所述色譜條中，其中該血紅蛋白(包括該糖化血紅蛋白)被所述捕獲劑固定并定量檢測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，如圖2所示，所述裂解的樣品加入所述色譜條而不用先接觸所述第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記的試劑。在此實(shí)施方式中，將所述第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記的試劑提供在所述色譜條上位于或接近所述裂解樣品加入所述色譜條的位點(diǎn)，從而所述裂解樣品中Hb和GHb在流過所述色譜條到達(dá)含所述捕獲劑的部分前與所述第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記的試劑在所述色譜條上相互作用。示例性捕獲劑包括但不限于抗體、抗體片段、抗原、肽、半抗原、或工程改造的蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述捕獲劑是識(shí)別和結(jié)合Hb的抗體。所述捕獲劑可為單克隆抗體或多克隆抗體如識(shí)別所有血紅蛋白分子如A、A2、F、C、D、E和S中存在的常見抗原表位的多克隆抗體。或者，所述捕獲劑可包括對(duì) 各變體特異的抗體的混合物。捕獲劑的其他例子包括抗體片段如Fab、F(ab)2、納米抗體、雙抗體、適體、模擬抗體蛋白(adnectin)、抗脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(anticalin)或由各種過程產(chǎn)生的各種其他Hb特異性結(jié)合分子,包括DARPin和DART0分別結(jié)合血紅蛋白和糖化血紅蛋白的第一和第二試劑可為分別結(jié)合血紅蛋白和糖化血紅蛋白，且能可檢測(cè)標(biāo)記的部分或組分。如上所述，在一個(gè)實(shí)施方式中，所述第一和第二試劑為抗體或抗體片段。其可為單克隆抗體或多克隆抗體。應(yīng)注意盡管所述捕獲劑和所述第一試劑都結(jié)合Hb，但其既不結(jié)合Hb上的相同抗原表位，也不彼此競爭結(jié)合Hb。在一個(gè)實(shí)施方式中，結(jié)合糖化血紅蛋白的第二試劑為硼酸[RB(OH)2]或其衍生物?？墒褂锰禺愋越Y(jié)合GHb的已知或之后發(fā)現(xiàn)的任何硼酸衍生物。所述硼酸衍生物優(yōu)選對(duì)GHb有高親合力和對(duì)結(jié)合GHb有高結(jié)合速率(或“附加速率”)和低解離或“去除”速率。實(shí)際考慮如將所述硼酸偶聯(lián)所述可檢測(cè)標(biāo)記的能力或便利可偏好使用具體的硼酸。這樣的考慮在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。所述第二試劑可為例如苯基硼酸。硼酸衍生物的例子包括但不限于3-氨基苯基硼酸、4-氨基-3-硝基苯基硼酸、或3-或4-巰基(或含巰基的)苯基硼酸以及下表I中所列物質(zhì)?？捎米魈禺愋越Y(jié)合GHb的所述第二試劑的示例性硼酸衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖4所示。表I :示例性硼酸和其電離常數(shù)(pKa) 硼酸，RB(OH)2
硼酸970
甲基硼酸10. 4
苯基硼酸8 9
3，5- 二氯苯基硼酸7. 4
3，5-雙(三氟甲基)苯基硼酸~2
3-甲氧基苯基硼酸
4-甲氧基苯基硼酸9^
4-竣基苯基棚酸8. 4
2-硝基苯基硼酸9^
4-硝基苯基硼酸~
4-溴苯基硼酸8. 6
4-氟苯基硼酸9Π
2-甲苯基硼酸
3-甲苯基硼酸9Γθ
4-甲苯基硼酸9^
權(quán)利要求
1.一種與(i)標(biāo)記有第一可檢測(cè)標(biāo)記的識(shí)別血紅蛋白的抗體和(ii)標(biāo)記有第二可檢測(cè)標(biāo)記的硼酸或其衍生物偶聯(lián)的糖化血紅蛋白。
2.一種測(cè)定樣品中糖化血紅蛋白百分比的方法，所述方法包括 (a)檢測(cè) (i)與結(jié)合所述樣品中血紅蛋白的第一試劑偶聯(lián)的第一可檢測(cè)標(biāo)記；和 (ii)與僅結(jié)合所述樣品中糖化血紅蛋白的第二試劑偶聯(lián)的第二可檢測(cè)標(biāo)記；和 (b)基于所述樣品中檢測(cè)的所述第一可檢測(cè)標(biāo)記和所述第二可檢測(cè)標(biāo)記的含量確定所述樣品中的糖化血紅蛋白百分比。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一可檢測(cè)標(biāo)記和所述第二可檢測(cè)標(biāo)記同時(shí)檢測(cè)。
4.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述第一可檢測(cè)標(biāo)記為暴露于第一波長光時(shí)發(fā)出熒光的第一熒光團(tuán)且所述第二可檢測(cè)標(biāo)記為暴露于第二波長光時(shí)發(fā)出熒光的第二突光團(tuán)。
5.如權(quán)利要求2-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第二試劑是硼酸或其衍生物。
6.如權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，檢測(cè)所述第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記前，不結(jié)合血紅蛋白的任何第一試劑和不結(jié)合糖化血紅蛋白的任何第二試劑分別從結(jié)合血紅蛋白和糖化血紅蛋白的所述第一試劑和所述第二試劑中分離。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述分離可通過將所述樣品置于電場中經(jīng)電泳、或通過固定所述血紅蛋白進(jìn)行。
8.—種檢測(cè)樣品中糖化血紅蛋白百分比的方法，所述方法包括 將所述樣品中細(xì)胞釋放的血紅蛋白接觸結(jié)合血紅蛋白的第一試劑和僅結(jié)合糖化血紅蛋白的第二試劑，其中所述第一試劑標(biāo)記有第一可檢測(cè)標(biāo)記且所述第二試劑標(biāo)記有第二可檢測(cè)標(biāo)記； 將所述可檢測(cè)標(biāo)記的血紅蛋白固定在固體支持物上； 測(cè)量來自固定在所述固體支持物上的所述第一可檢測(cè)標(biāo)記和所述第二可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)；和 基于所述第一可檢測(cè)標(biāo)記和所述第二可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)確定所述樣品中的糖化血紅蛋白百分比。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述固體支持物的一部分包含涂層，所述涂層含結(jié)合所述樣品中血紅蛋白的固定化捕獲劑。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述捕獲劑為抗體或抗體片段。
11.如權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述固體支持物包含色譜條。
12.如權(quán)利要求8-11中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述血紅蛋白固定于所述固體支持物前，所述血紅蛋白接觸標(biāo)記有所述第一可檢測(cè)標(biāo)記的所述第一試劑和標(biāo)記有所述第二可檢測(cè)標(biāo)記的所述第二試劑。
13.如權(quán)利要求8-11中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述血紅蛋白加入所述固體支持物，所述固體支持物包括的區(qū)域含標(biāo)記有所述第一可檢測(cè)標(biāo)記的所述第一試劑和標(biāo)記有所述第二可檢測(cè)標(biāo)記的所述第二試劑，且其中所述血紅蛋白在固定前接觸所述固體支持物上存在的所述第一標(biāo)記的試劑和所述第二標(biāo)記的試劑。
14.如權(quán)利要求8-13中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第一試劑為抗體或抗體片段。
15.如權(quán)利要求8-14中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第二試劑是硼酸或其衍生物。
16.如權(quán)利要求8-15中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第一試劑和所述第二試劑從所述固體支持物的大致相同區(qū)域檢測(cè)。
17.如權(quán)利要求8-16中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第一可檢測(cè)標(biāo)記和所述第二可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)通過將來自所述第一光源和所述第二光源的光應(yīng)用到所述固體支持物上的所述固定的血紅蛋白上來檢測(cè)。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述第一光源或所述第二光源包括激光。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述第一光源包括第一激光且所述第二光源包括與所述第一激光不同的第二激光。
20.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述第一可檢測(cè)標(biāo)記為暴露于來自所述第一光源的光時(shí)發(fā)出熒光的第一熒光團(tuán)。
21.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述第二可檢測(cè)標(biāo)記為暴露于來自所述第二光源的光時(shí)發(fā)出熒光的第二熒光團(tuán)。
22.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述第一可檢測(cè)標(biāo)記為暴露于第一波長光時(shí)發(fā)出突光的第一突光團(tuán)且所述第二可檢測(cè)標(biāo)記為暴露于與所述第一波長不同的第二波長的光時(shí)發(fā)出熒光的第二熒光團(tuán)。
23.如權(quán)利要求8-22中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第一可檢測(cè)標(biāo)記和所述第二可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)同時(shí)檢測(cè)。
24.一種檢測(cè)樣品中糖化血紅蛋白百分比的方法，所述方法包括 將所述樣品中細(xì)胞釋放的血紅蛋白接觸結(jié)合血紅蛋白的第一試劑和僅結(jié)合糖化血紅蛋白的第二試劑，其中所述第一試劑標(biāo)記有第一可檢測(cè)標(biāo)記且所述第二試劑標(biāo)記有第二可檢測(cè)標(biāo)記，且其中所述第二試劑為硼酸或其衍生物； 將所述可檢測(cè)標(biāo)記的血紅蛋白固定在固體支持物上； 測(cè)量來自固定在所述固體支持物上的所述第一可檢測(cè)標(biāo)記和所述第二可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)；和 基于所述第一可檢測(cè)標(biāo)記和所述第二可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)確定所述樣品中的糖化血紅蛋白百分比。
25.一種檢測(cè)樣品中糖化血紅蛋白百分比的方法，所述方法包括 將所述樣品中細(xì)胞釋放的血紅蛋白接觸結(jié)合血紅蛋白的第一試劑和僅結(jié)合糖化血紅蛋白的第二試劑，其中所述第一試劑標(biāo)記有第一可檢測(cè)標(biāo)記且所述第二試劑標(biāo)記有第二可檢測(cè)標(biāo)記，且其中所述第二試劑為硼酸或其衍生物； 將所述可檢測(cè)標(biāo)記的血紅蛋白固定在固體支持物上； 同時(shí)測(cè)量來自固定在所述固體支持物上的所述第一可檢測(cè)標(biāo)記和所述第二可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)；和 基于所述第一可檢測(cè)標(biāo)記和所述第二可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)確定所述樣品中的糖化血紅蛋白百分比。
26.一種檢測(cè)樣品中糖化血紅蛋白百分比的方法，所述方法包括 將所述樣品中細(xì)胞釋放的血紅蛋白接觸結(jié)合血紅蛋白的第一試劑和僅結(jié)合糖化血紅蛋白的第二試劑，其中所述第一試劑標(biāo)記有第一可檢測(cè)標(biāo)記，所述第一可檢測(cè)標(biāo)記為暴露于第一波長光時(shí)發(fā)出突光的第一突光團(tuán)，且所述第二試劑標(biāo)記有第二可檢測(cè)標(biāo)記，所述第二可檢測(cè)標(biāo)記為暴露于第二波長光時(shí)發(fā)出熒光的第二熒光團(tuán)； 將包括所述可檢測(cè)標(biāo)記的糖化血紅蛋白的所述可檢測(cè)標(biāo)記的血紅蛋白固定在固體支持物上的相同區(qū)域； 通過將含糖化血紅蛋白的血紅蛋白所固定的固體支持物區(qū)域暴露于所述第一和第二波長的光中來同時(shí)測(cè)量固定在所述固體支持物上的第一可檢測(cè)標(biāo)記和所述第二可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)；和 基于所述第一可檢測(cè)標(biāo)記和所述第二可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)確定所述樣品中的糖化血紅蛋白百分比。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述第二試劑是硼酸或其衍生物。
28.如權(quán)利要求26或27所述的方法，其特征在于，所述第一和第二試劑分別暴露于紅光和紅外光下，或分別暴露于紅外光和紅光下，以誘導(dǎo)來自所述第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記的熒光。
29.一種測(cè)試條，所述測(cè)試條包括 色譜條； 所述色譜條一部分上的涂層，所述涂層包含結(jié)合樣品中血紅蛋白的捕獲劑； 所述色譜條上添加樣品的區(qū)域；和 所述色譜條上含結(jié)合血紅蛋白的第一試劑和僅結(jié)合糖化血紅蛋白的第二試劑的區(qū)域，其中所述第一試劑標(biāo)記有第一可檢測(cè)標(biāo)記且所述第二試劑標(biāo)記有第二可檢測(cè)標(biāo)記； 其中所述色譜條上含所述第一試劑和所述第二試劑的區(qū)域位于(i)添加所述樣品的區(qū)域或(ii)添加所述樣品的區(qū)域和含所述捕獲劑的區(qū)域之間，從而加入所述測(cè)試條的樣品在到達(dá)含所述捕獲劑的區(qū)域前流過含所述第一和第二試劑的區(qū)域。
30.如權(quán)利要求29所述的測(cè)試條，其特征在于，所述色譜條包括含標(biāo)記有第一可檢測(cè)標(biāo)記的第一試劑和標(biāo)記有第二可檢測(cè)標(biāo)記的第二試劑的偶聯(lián)板，且所述偶聯(lián)板位于(i)色譜條上添加所述樣品的區(qū)域或(ii)添加所述樣品的區(qū)域和含所述捕獲劑的區(qū)域之間，從而加入所述測(cè)試條的樣品在到達(dá)含所述捕獲劑的區(qū)域前流過所述偶聯(lián)板。
31.如權(quán)利要求29或30所述的測(cè)試條，其特征在于，所述色譜條在所述添加樣品的區(qū)域還包括樣品板。
32.如權(quán)利要求31所述的測(cè)試條，其特征在于，所述樣品板使所述樣品緩慢釋放到所述偶聯(lián)板上。
33.如權(quán)利要求29-32中任一項(xiàng)所述的測(cè)試條，其特征在于，所述第一可檢測(cè)標(biāo)記或所述第二可檢測(cè)標(biāo)記為熒光團(tuán)。
34.如權(quán)利要求29-32中任一項(xiàng)所述的測(cè)試條，其特征在于，所述第一可檢測(cè)標(biāo)記為暴露于第一波長光時(shí)發(fā)出突光的第一突光團(tuán)且所述第二可檢測(cè)標(biāo)記為暴露于與所述第一波長不同的第二波長的光時(shí)發(fā)出熒光的第二熒光團(tuán)。
35.如權(quán)利要求29-34中任一項(xiàng)所述的測(cè)試條，其特征在于，所述第二試劑是硼酸或其衍生物。
全文摘要
本文描述的是分析樣品以定量確定樣品中糖化血紅蛋白百分比的系統(tǒng)和方法。
文檔編號(hào)G01N33/533GK102640002SQ201080032364
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2010年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月20日
發(fā)明者J·H·漢, T·科溫, W·J·若特 申請(qǐng)人:瑞萊診斷體系股份有限公司