專利名稱：偵測(cè)致死細(xì)胞的方法與材料及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為提供一種確認(rèn)與檢測(cè)致死細(xì)胞存在的方法與材料，無(wú)論是何種原因所造成的癌癥，經(jīng)由檢測(cè)該癌癥病患中致死細(xì)胞的存在，可確認(rèn)該病患的疾病狀態(tài)與治療反應(yīng)。
背景技術(shù)：
Hanahan 及 Weinberg 在 2000 年(Cell，2000，100 :57_70)發(fā)表文獻(xiàn)中，表列出多種癌癥的標(biāo)志(hallmarks)，但目前針對(duì)這些理論所開(kāi)發(fā)出來(lái)的臨床治療方法，在過(guò)去50年都無(wú)法完全的治愈癌癥病患。因此，近年來(lái)許多研究開(kāi)始質(zhì)疑這些無(wú)法治愈的癌癥，它的癌細(xì)胞與表現(xiàn)的標(biāo)幟(Marker)，僅是這些疾病的最終產(chǎn)物。越來(lái)越多證據(jù)顯示骨髓衍生干 / 源祖細(xì)胞(bone marrow-derived stem/progenitor cells, BMDSC)會(huì)擴(kuò)散到全身，并且在發(fā)展中的腫瘤基質(zhì)內(nèi)快速增加,這種現(xiàn)象的產(chǎn)生如傷口過(guò)度愈合時(shí),該部位會(huì)聚積生長(zhǎng)因子、化學(xué)激素、細(xì)胞因子、及組織再造因子，促使組織的微環(huán)境改變進(jìn)而逐漸破壞器官，導(dǎo)致器官衰竭，并逐漸的造成人體的免疫受到抑制、細(xì)胞凋亡抑制、上皮細(xì)胞惡性變質(zhì)、增生、生長(zhǎng)、侵襲、及癌細(xì)胞移轉(zhuǎn)擴(kuò)散等狀況。然而，骨髓衍生干/源祖細(xì)胞包含多種類型的干/源祖細(xì)胞及其衍生物，例如纖維母細(xì)胞與巨噬細(xì)胞，這些特殊的骨髓衍生干/源祖細(xì)胞在癌癥發(fā)展及病程上所扮演的角色仍然不是非常的確定，因此利用骨髓衍生干/源祖細(xì)胞在無(wú)法治愈的癌癥檢測(cè)與治療仍有許多的挑戰(zhàn)。(Bingle et al，J Pathol, 2002,196 254-265 ；De Wever and Mareel, J Pathol，2003，200 :429-447 ；Condeelis and Pollard,Cell，2006，124 :263-266 ;Direkze and Alison，Hematol Oncol，2006，24 :189-195 ;Kaplanet al, Trends Mol Med,2007,13 :72-81 ；Karnoub et al, Nature，2007，449 :557-563 ；Loberg et al, CA Cancer J Clin,2007,57 :225-241 ；Massberg et al, Cell，2007，131 994-1008 ；Biswas et al, J Immunol，2008，180 :2011-2017 ；Chantrain et al, CancerMicroenviron，2008，I :23-35 ；Germano et al，Cytokine，2008，43 :374-379 ;Laird et al,Cell，2008，132 :612-630 ；Le Bitoux and Stamenkovic，Histochem Cell Biol，2008，130 :1079-1090 ；Takaishi et al, J Clin Oncol，2008，26 :2876-2882 ;Aggarwal and Gehlot，Curr Opin Pharmacol, 2009,9 :1-19 ；Gonda et al,Cell Cycle，2009，8 :2005-2013 ；Joyceand Pollard, Nat Rev Cancer，2009，9 :239-252 ；Mishra et al, Cancer Res，2009，69 1255-1258 ;Psaila and Lyden, Nat Rev Cancer，2009，9 :285-293)。不過(guò)，傳統(tǒng)的作法已經(jīng)受到質(zhì)疑，因此，除了過(guò)去五十年來(lái)，癌癥研究著重在癌細(xì)胞本身的傳統(tǒng)分子癌腫瘤學(xué)之夕卜，細(xì)胞與臨床腫瘤學(xué)研究，特別是系統(tǒng)腫瘤研究亦應(yīng)同時(shí)受到重視。脯氨酸指導(dǎo)的蛋白激酶Fa(proline-directed protein kinase，PDPK Fa)/肝糖合成酶激酶-3a (GSK-3 a )被認(rèn)為是一種特定的蛋白質(zhì)去磷酸酶活化因子A(Vandenheedeet al，JBiol Chem，1980，255 :11768-11774 ;Yang et al, J Biol Chem，1980，255 :11759-11767 ;Woodgett，EMBO J，1990，9 :2431-2438)。發(fā)明人過(guò)去的研究中進(jìn)一步證實(shí)PDPKFA/GSK-3a是具有多受質(zhì)/多功能TOPK的特征，這些特征與各型癌細(xì)胞抗細(xì)胞凋亡、抗分化、腫瘤生成、侵犯及耐藥性相關(guān)(Lee et al, J Cell Biochem，1995，58 :474-480 ；Yang et al, J Cell Biochem, 1995, 59 :143-150 ；Yang et al, J Cell Biochem, 1996,61 238-245 ；Hsu et al, Br J Cancer, 2000，82 :1480-1484 ;Hsu et al, Cancer, 2000,89 1004-1011 ；Yang et al, Clin Cancer Res, 2000,6 1024-1030 ；Hsu et al, Cancer, 2001,92 :1753-1758 ；Hsu et al, Int J Cancer, 2001,91 :650-653 ；Chung et al, Cancer, 2002,95 :1840-1847 ；Hsueh et al, Cancer, 2002,95 :775-783 ；Fu and Yang, Anti Cancer Res,2004,24 :1489-1494 ；Yang, Curr Cancer Drug Targets, 2004,4 :591-596 ；Yang, Drug NewsPerspect,2005,18 :432-436 ；Hsu et al, J Clin Oncol，2006，24 :3780-3788)。遺憾的是，過(guò)去roPK Fa/GSK-3 a的癌癥研究，主要都是針對(duì)上述的癌細(xì)胞本身或癌前期細(xì)胞。故此訊息傳導(dǎo)分子對(duì)癌癥的影響，仍需要持續(xù)的研究才能確認(rèn)。

發(fā)明內(nèi)容
與先前roPK FA/GSK-3 a針對(duì)癌癥的主要研究相比，即上述著重于傳統(tǒng)癌細(xì)胞的研究，本發(fā)明主要為檢測(cè)這個(gè)TOPK訊息傳導(dǎo)分子，特別是在骨髓衍生干/源祖細(xì)胞(BMDSC)內(nèi)，骨髓衍生干/源祖細(xì)胞是能夠自動(dòng)尋向至發(fā)展中的腫瘤基質(zhì)內(nèi)并快速增加，就如前述中過(guò)度愈合的傷口一樣。根據(jù)此方法，骨髓衍生干/源祖細(xì)胞中roPKFA/GSK_3a的異常表達(dá)(expression)，對(duì)于監(jiān)控疾病狀態(tài)與治療反應(yīng)，以及確認(rèn)各器官相關(guān)的腫瘤為可治愈或不可治愈，扮演決定性與指導(dǎo)性的角色。如果癌癥病患具有roPKFA/GSK_3a異常表達(dá)的骨髓衍生干/源祖細(xì)胞，則不論病因?yàn)楹?，都不易治愈。因此，本發(fā)明將有roPKFA/GSK_3a異常表現(xiàn)的骨髓衍生干/源祖細(xì)胞統(tǒng)稱為“致死細(xì)胞”。與針對(duì)癌細(xì)胞的研究相比，本發(fā)明提供偵測(cè)致死細(xì)胞的方法與材料，檢測(cè)此具有攻擊性的細(xì)胞對(duì)于預(yù)防癌癥、治療以及使用具廣泛的應(yīng)用。例如，罹患早期癌癥的病患若無(wú)致死細(xì)胞，則可通過(guò)局部切除治愈。相反的，即使是罹患早期癌癥的病患，體內(nèi)有致死細(xì)胞，則手術(shù)亦無(wú)法治愈。因此，本發(fā)明提供監(jiān)控治療反應(yīng)的方法與材料，以協(xié)助醫(yī)師更積極與適當(dāng)?shù)淖龀鲋委煕Q定。此處致死細(xì)胞為可應(yīng)用于全身的預(yù)測(cè)因子，對(duì)于非常早期的系統(tǒng)性失調(diào)包括造血、止血、體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，以及與免疫系統(tǒng)相關(guān)的系統(tǒng)性免疫抑制、感染、阻塞、血栓以及由骨髓缺陷引發(fā)多重器官衰竭等非常有用。具體而言，致死細(xì)胞于監(jiān)控不同種類的癌癥病患狀態(tài)與治療反應(yīng)是可信賴的預(yù)測(cè)因子。另一方面，PDPKFA/GSK-3a或許不需為最具效果且理想的藥物篩選標(biāo)的，然而，將此訊息傳導(dǎo)分子作為一種新的探針，可偵測(cè)并離析出監(jiān)控治療反應(yīng)與癌癥進(jìn)展的致死細(xì)胞。因此本發(fā)明所闡述的致死細(xì)胞一但被分離出來(lái)，可以進(jìn)一步以蛋白質(zhì)體學(xué)及基因體學(xué)的方法，發(fā)展更多可用來(lái)篩選與評(píng)估治療性藥物，為各類型的癌癥患者提供更多更有效且更完整的預(yù)防與治療方法。因此，本發(fā)明的目的之一為，提供一種可于受試者的骨髓衍生干/源祖細(xì)胞中偵測(cè)到TOPK FA/GSK-3 a表現(xiàn)的方法，該現(xiàn)象代表有致死細(xì)胞的存在，本方法包括取得受試者的生物性樣本；判斷該生物性樣本中骨髓衍生干/源祖細(xì)胞的I3DPK Fa/GSK-3 a的表達(dá)(expression)情形；其中骨髓衍生干/源祖細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)TOPK FA/GSK-3 a發(fā)現(xiàn)異常聚積，表示此骨髓衍生干/源祖細(xì)胞為致死細(xì)胞。于一實(shí)施例中，PDPK Fa/GSK-3 a蛋白質(zhì)表現(xiàn)通過(guò)使用對(duì)roPKFA/GSK_3a專一的抗體，以免疫試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定。生物性樣本為骨髓、血液、組織樣本、腫瘤，腹水或胸膜積水的一種或多種。另一目的，為提供一種于生物樣本中偵測(cè)致死細(xì)胞的診斷試劑盒(diagnostickit)，包括至少一評(píng)估樣本中roPKFA/GSK-3 a蛋白質(zhì)表現(xiàn)試劑，以及評(píng)估致死細(xì)胞存在的操作說(shuō)明，包裝于一容器中。更多偵測(cè)用試劑也可能包含于其中。又一目的為，提供一種監(jiān)測(cè)多種類癌癥病患的治療反應(yīng)與疾病狀態(tài)的方法，包括取得所述病患的生物性樣本；判斷該生物性樣本中I3DPK Fa/GSK-3 a表達(dá)，PDPKFA/GSK_3a于病患的細(xì)胞內(nèi)異常聚積狀況。一些實(shí)施例中，PDPK Fa/GSK-3 a蛋白質(zhì)的表現(xiàn)程度是通過(guò)使用對(duì)roPKFA/GSK_3a專一的抗體，以免疫試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定。生物性樣本可為骨髓、血液、組織樣本、腫瘤、腹水或胸膜積水。如果必要，如同Moioli等人(PLoS ONE, 3 e3922,2008)所述，這些細(xì)胞可通過(guò)特殊磁珠或流式細(xì)胞分選儀分離出來(lái)，用以偵測(cè) 高度表現(xiàn)roPK Fa/GSK-3 a的致死細(xì)胞。了解以下詳細(xì)說(shuō)明及圖式與實(shí)例后，本發(fā)明的目的及特征將全然顯而易見(jiàn)。


圖I是急性骨髓性白血病(AML)患者的骨髓衍生干/源祖細(xì)胞圖，其中圖IA是一急性骨髓性白血病患者在骨髓中發(fā)現(xiàn)有致死細(xì)胞的圖；圖IB是另一急性骨髓性白血病患者在骨髓中發(fā)現(xiàn)有致死細(xì)胞的圖；圖IC是在骨髓中沒(méi)有致死細(xì)胞的急性骨髓性白血病患者的圖；如果在骨髓中發(fā)現(xiàn)有致死細(xì)胞，易并發(fā)肺炎及/或骨髓移植失敗，如果沒(méi)有致死細(xì)胞，接受治療或骨髓移植后具有良好預(yù)后；圖2A是具有致死細(xì)胞的肺癌病患和沒(méi)有致死細(xì)胞的肺癌病患的未發(fā)病存活率對(duì)照?qǐng)D；圖2B是具有致死細(xì)胞的肺癌病患和沒(méi)有致死細(xì)胞的肺癌病患的整體存活率對(duì)照?qǐng)D；圖3A是早、晚期肺癌病患具有致死細(xì)胞的患者和沒(méi)有致死細(xì)胞的患者的未發(fā)病存活率對(duì)照?qǐng)D；圖3B是早、晚期肺癌病患具有致死細(xì)胞的患者和沒(méi)有致死細(xì)胞的患者的整體存活率對(duì)照?qǐng)D；圖3C是肺癌第一期病患具有致死細(xì)胞和沒(méi)有致死細(xì)胞的患者的未發(fā)病存活率對(duì)照?qǐng)D；圖3D是肺癌第一期病患具有致死細(xì)胞和沒(méi)有致死細(xì)胞的患者的整體存活率對(duì)照?qǐng)D；圖4A是罹患不同種類癌癥的具有致死細(xì)胞和沒(méi)有致死細(xì)胞的患者的未發(fā)病存活率對(duì)照?qǐng)D；圖4B是罹患不同種類癌癥的具有致死細(xì)胞和沒(méi)有致死細(xì)胞的患者的整體存活率對(duì)照?qǐng)D。
具體實(shí)施例方式為清楚揭露，而非限定，本發(fā)明詳細(xì)描述細(xì)分為以下次段落。A.定義除非有其它定義，在此所用的技術(shù)及科學(xué)詞匯，如為本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有一般人了解具有相同意義。在此指稱的所有專利、申請(qǐng)案、公開(kāi)申請(qǐng)案及其它應(yīng)用，以及基因庫(kù)登錄號(hào)皆以參考文獻(xiàn)整合。本章節(jié)提出的定義與其它專利、申請(qǐng)案、公開(kāi)申請(qǐng)案及其它在此引用的參考文獻(xiàn)提出的定義相反或不一致，以本章節(jié)提出的定義為主。如本發(fā)明所使用，“一”是指“至少一個(gè)”或“一個(gè)或多個(gè)。如本發(fā)明所使用，術(shù)語(yǔ)“PDPK FA/GSK_3a ”指多受質(zhì)/多功能的脯氨酸指導(dǎo)的蛋白激酶Fa，亦為已知的肝糖合成酶激酶3 a (ffoodgett, EMBO J, 1990,9 :2431-2438 ；Yang,Curr Cancer Drug Targets，2004，4 :591-596)。此蛋白的基因庫(kù)登錄號(hào)為 AAD11986 (SEQID NO. I)及 AAH27984 (SEQ ID NO. 2)。如本發(fā)明所使用，術(shù)語(yǔ)”生物樣本”指來(lái)自一生物來(lái)源的任何樣本，包括但并未限制于骨髓、血液、組織樣本、腫瘤、腹水或胸膜積水。如本發(fā)明所使用，術(shù)語(yǔ)”抗體”指包括必要的變異區(qū)序列以專一性鍵結(jié)一抗原決定位的分離或重組結(jié)合試劑。因此，抗體是表現(xiàn)生物活性的任何型式的抗體或抗體片段，例如，結(jié)合特定的目標(biāo)抗原。因此，只要抗體表現(xiàn)所要求的生物活性，例如專一性結(jié)合roPKFa/GSK-3 a時(shí)，用于被廣泛認(rèn)知及特定地涵蓋單株抗體(包括全長(zhǎng)單株抗體)、多株抗體、人類抗體、擬人化抗體、嵌合抗體、奈米抗體、雙價(jià)抗體、多重專一抗體(例如雙特異抗體)及包括但不限定于scFv、Fab及Fab2的抗體片段。如本發(fā)明所使用，術(shù)語(yǔ)“專一性抗體”指專一抗 PDPK FA/GSK-3 a 抗體。如本發(fā)明所使用，術(shù)語(yǔ)“致死細(xì)胞”指細(xì)胞內(nèi)有roPKFA/GSK_3a異常聚積的骨髓衍生干/源祖細(xì)胞。如本發(fā)明所使用，術(shù)語(yǔ)“同時(shí)在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核表現(xiàn)聚積”指roPK Fa/GSK-3 a聚積于骨髓衍生干/源祖細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核或同時(shí)于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核內(nèi)表現(xiàn)聚積。如本發(fā)明所使用，術(shù)語(yǔ)“大量表現(xiàn)”、“大量聚積”指骨髓衍生干/源祖細(xì)胞內(nèi)有PDPKFa/GSK-3 a 異常聚積。如本發(fā)明所使用，術(shù)語(yǔ)“疾病狀態(tài)不佳”指帶有致死細(xì)胞的癌癥患者經(jīng)治療后其復(fù)發(fā)機(jī)率高于未帶有致死細(xì)胞的癌癥患者，或其存活率低于未帶有致死細(xì)胞的癌癥患者。如本發(fā)明所使用，術(shù)語(yǔ)“治療反應(yīng)不佳”指帶有致死細(xì)胞的癌癥患者經(jīng)治療后其復(fù)發(fā)機(jī)率高于未帶有致死細(xì)胞的癌癥患者，或其存活率低于未帶有致死細(xì)胞的癌癥患者。除非特別說(shuō)明，對(duì)熟悉所屬技術(shù)領(lǐng)域、本發(fā)明所使用的實(shí)例、生化及臨床病理學(xué)的常用技術(shù)，所有在此使用的術(shù)語(yǔ)具有與一般人知識(shí)相同的意義。B.用以偵測(cè)致死細(xì)胞的方法及診斷試劑盒一方面，有細(xì)胞內(nèi)roPKFA/GSK_3 a異常聚積的骨髓衍生干/源祖細(xì)胞提供一鑒別并偵測(cè)致死細(xì)胞的工具。于另一方面，于一生物性樣本中確認(rèn)致死細(xì)胞，對(duì)于監(jiān)測(cè)多種癌癥病患的治療反應(yīng)與疾病狀態(tài)非常有幫助。因此，本發(fā)明目的之一即提供一種偵測(cè)受試者具有致死細(xì)胞表現(xiàn)的方法，該方法包括由所述受試者獲得一生物樣本，測(cè)定所述樣本骨髓衍生干/源祖細(xì)胞內(nèi)PDPKFA/GSK-3 a表達(dá)程度，其中該受試者骨髓衍生干/源祖細(xì)胞內(nèi)H)PK FA/GSK-3 a發(fā)現(xiàn)異常聚 積，表示此骨髓衍生干/源祖細(xì)胞為“致死細(xì)胞”。在某些實(shí)施例中，PDPK Fa/GSK-3 a的表達(dá)通過(guò)分析TOPK FA/GSK_3 a蛋白含量而進(jìn)行測(cè)定，例如使用對(duì)roPK Fa/GSK-3 a專一抗體的免疫試驗(yàn)法。生物樣本可為骨髓、血液、組織樣本、腫瘤、腹水或胸膜積水。
本發(fā)明的另一目的是提供一種用以測(cè)定一生物樣本中致死細(xì)胞存在的診斷試劑盒(kit)，包括用以測(cè)定所述樣本骨髓衍生干/源祖細(xì)胞中roPK FA/GSK-3 a表現(xiàn)的一試齊U，以及一輔助性試劑，例如生理食鹽水、緩沖液等一般實(shí)驗(yàn)所需的試劑，用以輔助讓該抗骨髓衍生干/源祖細(xì)胞抗體與該抗I3DPK FA/GSK-3 a抗體與細(xì)胞結(jié)合。任何偵測(cè)roPK Fa/GSK-3 a于骨髓衍生干/源祖細(xì)胞中異常表達(dá)的適當(dāng)裝置皆可能被使用。該表現(xiàn)可通過(guò)評(píng)估生物樣本骨髓衍生干/源祖細(xì)胞中的蛋白質(zhì)含量而測(cè)定。例如，使用對(duì)roPK Fa/GSK-3 a專一抗體的免疫試驗(yàn)法。適當(dāng)方法包括但不限定于免疫組織化學(xué)分析、免疫細(xì)胞化學(xué)分析、以及流式細(xì)胞分析。利用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，一般利用脫水及固定方式來(lái)制備一細(xì)胞樣本，再與耦合基因產(chǎn)物專一的標(biāo)幟抗體進(jìn)行反應(yīng)，該標(biāo)幟物通常是視覺(jué)上可偵測(cè)的，例如酵素標(biāo)幟物、熒光標(biāo)幟物、冷光標(biāo)幟物及其類似物。根據(jù)一實(shí)施例，由受試者取得組織樣本，并且根據(jù)傳統(tǒng)組織固定技術(shù)，包埋該樣本再切片為3-5 ym，進(jìn)行固定及干燥。固定液可包括福爾馬林。用以固定切片的包埋液為石蠟。樣本可儲(chǔ)存于此條件下。去石蠟及再水合后，樣本與對(duì)roPKFA/GSK_3a專一抗體的免疫試劑接觸?？贵w包含多株或單株抗體?？贵w包括完整抗體或?qū)Ｒ恍越Y(jié)合roPKFA/GSK_3 a蛋白的抗體片段。適當(dāng)?shù)亩嘀昕寡寤蚱渌贵w可通過(guò)roPKF/GSK-3 a蛋白或該蛋白的合適片段寄主動(dòng)物進(jìn)行制備，并依據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域一般人所知的技術(shù)收集及純化抗血清。專一地與roPKFA/GSK_3 a反應(yīng)的單株或多株抗體，單株抗體較佳，可由本領(lǐng)域所熟知的方法制作。參閱=Harlow及Lane (1988)《抗體實(shí)驗(yàn)室操作手冊(cè)》，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，及Goding (1986)《單株抗體原理及應(yīng)用》，第二版，學(xué)術(shù)出版社，紐約。而且，重組蛋白可由本領(lǐng)域所知的方法制作，包括但不限定美國(guó)專利號(hào)4，816，567所述方法，或由商業(yè)上獲得。抗體直接或間接地帶有一合適偵測(cè)標(biāo)幟物。偵測(cè)標(biāo)幟物可結(jié)合至二級(jí)抗體，如與一級(jí)抗體結(jié)合的羊抗兔IgG。標(biāo)幟多多肽及抗體通常藉共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合一提供偵測(cè)信號(hào)的物質(zhì)。合適的標(biāo)幟物包括但不限定于放射性核酸、酵素、受質(zhì)、輔助因子、抑制劑、熒光試劑、冷光試劑、磁性粒子及類似物。任何合適的方法可由一受試者獲得一生物樣本。生物樣本可為骨髓、血液、組織樣本、腫瘤、腹水或胸膜積水。監(jiān)測(cè)多種癌癥病患的治療反應(yīng)與疾病狀態(tài)的套組(kit)包括至少一容器，包含一用以測(cè)定骨髓衍生干/源祖細(xì)胞中的roPK Fa/GSK-3 a表現(xiàn)試劑，及評(píng)估一生物樣本中的骨髓衍生干/源祖細(xì)胞是否為致死細(xì)胞的印刷操作說(shuō)明。如本發(fā)明所使用，術(shù)語(yǔ)“試劑”指任何完成本發(fā)明提供方法的化合物、組合物或生物試劑(即樣本、液體、或細(xì)胞“劑量”、抗體等)，包括但不限定于用于roPK Fa/GSK-3 a的抗體、緩沖液、及分析用載體。C.實(shí)施例除了其它在特定實(shí)施例指出，所有免疫組織化學(xué)分析、免疫表現(xiàn)型分析、免疫細(xì)胞化學(xué)分析及統(tǒng)計(jì)分析以下列方法進(jìn)行。專一抗roPKFA/GSK_3 a抗體的生產(chǎn)、鑒定及特征。
對(duì)應(yīng)于TOPK Fa/GSK-3 a氨基酸序列471-483的羧基終端區(qū)域的肽QSTDATPTLTNSS由肽合成儀合成(型號(hào)9050，Milligen, Bedford,馬里蘭州)。根據(jù)Reichlin(1980)描述的過(guò)程，為了便于將肽耦合到牛血清蛋白，利用戊二醛作為交互連接器，將半胱氨酸殘基加至NH2端。經(jīng)過(guò)親和純化，產(chǎn)物可被roPKFA/GSK-3 a的氨基酸471-483的C端肽阻斷，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證明此抗PDPK Fa/GSK-3 a抗體具有免疫的專一性，因此后續(xù)的實(shí)驗(yàn)將以此抗體作為檢測(cè)材料。免疫組織化學(xué)分析 以福爾馬林固定、石蠟包埋含有最多腫瘤細(xì)胞的腫瘤的組織切片(5i!m)于二甲苯中脫蠟，接著于濃度漸減的乙醇中水合。內(nèi)生性過(guò)氧化酶以3%過(guò)氧化氫阻斷(blocking)，再以牛血清蛋白阻斷5分鐘。再將玻片培養(yǎng)于0.05M Tris緩沖液(pH 7.4)稀釋的抗roPKFA/GSK-3a抗體(2 y g/mL)中，于4°C作用16小時(shí)，再與超級(jí)增強(qiáng)劑(superenhancer, Super Sensitive Non-Biotin Detection System, BioGenex, San Ramon, CA)于室溫培養(yǎng)20分鐘，并以polymer-HRP(Super Sensitive )標(biāo)幟物培養(yǎng)30分鐘。免疫染色法系以DAB (3-3，diaminobenzidine tetrahydrochloride)呈色，呈現(xiàn)紅掠色。在抑制酵素反應(yīng)后，將玻片在室溫下培養(yǎng)于DS-enhancer (Zymed, San Francisco, CA) 5分鐘，以防止兩種染色間交互作用。再將玻片于室溫下培養(yǎng)于⑶34抗體中I小時(shí)。清洗后，將玻片在室溫下培養(yǎng)于抗小鼠堿性磷酸酶30分鐘。使用BCIP/NBT溶液以顯現(xiàn)鍵結(jié)的抗體，結(jié)果呈現(xiàn)藍(lán)色。以甲基綠溶液對(duì)比染色切片，結(jié)果呈現(xiàn)綠色。WI3DPK FA/GSK-3a及⑶34共同染色的細(xì)胞呈紫黑色。免疫細(xì)胞化學(xué)分析于室溫、700rpm下將細(xì)胞離心(Kubota 5200，日本)3分鐘，使細(xì)胞貼附在涂覆聚離氨酸(聚賴氨酸，polylysine)的玻片上。染色前，細(xì)胞聚落(cytospots)以3. 7%三聚甲醛固定15分鐘，并以0.2% TritonX-100處理90秒。內(nèi)生性過(guò)氧酵素(內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，endogenous peroxidase)將被3%過(guò)氧化氫阻斷，再以胎牛蛋白(牛血清白蛋白，bovine serum albumin)阻斷10分鐘。將玻片培養(yǎng)于4°C、稀釋于0. 05M Tris緩沖液(pH7. 4)的抗 PDPK Fa/GSK-3 a 抗體(2 u g/mL)中 16 小時(shí),再與超級(jí)增強(qiáng)劑(super enhancer,Super Sensitive Non-Biotin Detection System, BioGenex, San Ramon, CA)于室溫培養(yǎng)20分鐘，另以polymer-HRP (Super Sensitive )標(biāo)幟物培養(yǎng)30分鐘。免疫染色以DAB (3，3’ diaminobenzidine tetrahydrochloride)呈色,為紅棕色。抑制酶反應(yīng)后，將玻片于室溫下培養(yǎng)于DS-enhancer (Zymed, San Francisco, CA) 5分鐘，以防止兩種染色間交互作用。再將玻片于室溫下培養(yǎng)于⑶34、vimentin、⑶68或a-SMA抗體中I小時(shí)。清洗后，將玻片在室溫下培養(yǎng)于抗小鼠堿性磷酸酶30分鐘。使用BCIP/NBT溶液以顯現(xiàn)鍵結(jié)的抗體，呈現(xiàn)藍(lán)色。以甲基綠溶液對(duì)比染色玻片，呈現(xiàn)綠色。以roPKFA/GSK-3 a及⑶34共同染色的細(xì)胞呈紫黑色。統(tǒng)計(jì)分析本發(fā)明的統(tǒng)計(jì)分析中，樣本區(qū)分為具有與不具有致死細(xì)胞存在兩個(gè)組別。整體存活率系從診斷日至死亡日或后續(xù)治療日止進(jìn)行計(jì)算。未發(fā)病存活率系從診斷日至復(fù)發(fā)日、轉(zhuǎn)移日、死亡日或后續(xù)治療日止進(jìn)行計(jì)算。Kaplan-Meier方法系用以測(cè)定存活機(jī)率，而對(duì)數(shù)級(jí)距試驗(yàn)系用以比較組間存活曲線。影響系以Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行分析。羅吉斯回歸系用以計(jì)算治療反應(yīng)中出現(xiàn)致死細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)。P < 0. 05被認(rèn)為具統(tǒng)計(jì)上地顯著意義。本研究由臺(tái)灣國(guó)家科學(xué)委員會(huì)核準(zhǔn)研究計(jì)劃及經(jīng)費(fèi)并在知情同意書(shū)及該機(jī)構(gòu)監(jiān)督倫理委員會(huì)核準(zhǔn)下執(zhí)行。以下實(shí)施例用以說(shuō)明但非限定本發(fā)明。
實(shí)施例I、急性骨髓性白血病患(Acute myelogenous leukemia ;AML)骨髓衍生干/源祖細(xì)胞內(nèi)的roPK Fa/GSK-3 a異常表達(dá)與積極治療后仍預(yù)后不良的關(guān)聯(lián)性PDPK FA/GSK-3 a的異常表達(dá)經(jīng)常于AML的骨髓中發(fā)現(xiàn)，透過(guò)免疫表現(xiàn)分析顯示，僅有少數(shù)具有I3DPK FA/GSK-3 a異常聚積的⑶34+造血干/前驅(qū)細(xì)胞及⑶34—間質(zhì)干/前驅(qū)細(xì)胞統(tǒng)稱為骨髓衍生干/源祖細(xì)胞(Moioli et al. PLoS ONE, 2008, 3 e3922)(圖IA與B)，會(huì)在不良預(yù)后的AML病患骨髓中經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)，而超過(guò)75%這種類型的病患甚至在接受積極治療后仍死亡。在清楚的對(duì)比下，超過(guò)80%在骨髓并未出現(xiàn)此種類型的骨髓衍生干/源祖細(xì)胞的AML病患(圖1C)在接受治療后痊愈。因此透過(guò)初始獨(dú)立世代研究發(fā)現(xiàn)，AML病患若帶有致死細(xì)胞，如圖IA與B，在治療后將較無(wú)起色。AML病患若無(wú)致死細(xì)胞，如圖1C，在治療后將使病情有較佳結(jié)果。實(shí)施例II、若肺癌患者帶有致死細(xì)胞，則疾病狀態(tài)不佳且對(duì)治療反應(yīng)不佳肺癌是世界癌癥死亡最常見(jiàn)原因。盡管近來(lái)治療進(jìn)步，肺癌患者的預(yù)后仍不甚滿意。大多數(shù)病患即使在腫瘤完全切除后仍會(huì)復(fù)發(fā)，且最后因疾病轉(zhuǎn)移而死亡。目前肺癌的腫瘤-淋巴結(jié)移轉(zhuǎn)分期系統(tǒng)(TNM, tumor-node-metastasis system)被廣泛運(yùn)用以預(yù)測(cè)預(yù)后狀況。然而，同一期肺癌不同病患間的預(yù)后，尤其是疾病早期是多樣化的，且目前尚未針對(duì)每一病患建立適當(dāng)?shù)膫€(gè)人化醫(yī)療治療計(jì)劃。因此，應(yīng)該找出更多影響腫瘤進(jìn)展與轉(zhuǎn)移的生物性功能之可信賴生物性標(biāo)幟，以于同期病患中鑒別出最可能有不良預(yù)后的次群組。156位肺癌病患，皆具有完整臨床病理數(shù)據(jù)以及可作為致死細(xì)胞研究的樣本。病患的臨床病理資料研究統(tǒng)整如表I。在156位肺癌病患中(100位男性與56位女性)，其年齡分布在23到82歲之間(平均62歲)，平均的腫瘤大小為3. 9±2. 3公分(平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差值；中位數(shù)為3公分)。其中有72位(46. 2% )病患有吸煙史。在組織學(xué)型態(tài)上，117位病患(75. 0% )為肺腺癌，36位病患(23. 1% )為鱗狀細(xì)胞癌，而3位病患(I. 9% )為大細(xì)胞肺癌。以分化的程度做分級(jí)，有42位病患(26.9%)為分化良好，65位病患(41.7%)為中等分化，以及49位病患(31. 4% )為分化不良。依據(jù)病理t的分期，分類為T(mén)l者有50位病患(32. 1% )，T2有59位病患(37. 8% )，T3有30位病患(19. 2% )以及T4有17位病患(10.9%)。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的程度上，29位病患(18.6% )在NI，21位病患(13.5%)在N2，而12位病患(7. 7% )在N3。94位病患(60. 3% )則無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。肺癌病患分為
I期、II期、III期以及IV期，分別有69位病患(44. 2%),23位病患(14. 7%),55位病患(35. 3% )以及9位病患(5. 8% )。156位肺癌患者五年未發(fā)病的存活率以及整體存活率，分別為36. 6%以及45. 3%0表I.肺癌病患特性
權(quán)利要求
1.一種偵測(cè)受試者中具有致死細(xì)胞的方法，其包括 提供一受試者之一生物性樣本；以及 檢測(cè)所述生物性樣本中骨髓衍生干/源祖細(xì)胞內(nèi)是否有roPK FA/GSK-3α的大量表現(xiàn)； 其中，若所述生物性樣本骨髓衍生干/源祖細(xì)胞內(nèi)具有roPK FA/GSK-3 α的大量表現(xiàn)，表示此骨髓衍生干/源祖細(xì)胞為致死細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述roPKFa/GSK-3 α的表現(xiàn)是通過(guò)評(píng)估TOPKFA/GSK-3 α的蛋白質(zhì)含量來(lái)判斷。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述TOPKFa/GSK-3 α蛋白質(zhì)的含量是通過(guò)使用對(duì)PDPK FA/GSK-3 α專一抗體的免疫試驗(yàn)方法作確認(rèn)。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述roPKFa/GSK-3 α的大量表現(xiàn)是指TOPK Fa/GSK-3 α同時(shí)在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核發(fā)現(xiàn)聚積。
5.如權(quán)利要求I所述的方法,其中所述生物性樣本為骨髓、周邊血液、組織樣本、腫瘤，腹水或胸膜積水。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述骨髓衍生干/源祖細(xì)胞為造血干/源組細(xì)胞、間質(zhì)干/源組細(xì)胞中的一種或多種。
7.一種監(jiān)測(cè)癌癥病患疾病狀態(tài)與治療反應(yīng)的方法，其包括 提供一癌癥病患之一生物性樣本；以及 檢測(cè)所述生物性樣本中骨髓衍生干/源祖細(xì)胞內(nèi)是否有TOPK Fa/GSK-3 α的大量表現(xiàn)； 其中，若所述生物性樣本中的骨髓衍生干/源祖細(xì)胞內(nèi)具有roPKFA/GSK-3 α大量聚積，則可預(yù)測(cè)所述癌癥病患的疾病狀態(tài)與治療反應(yīng)不佳。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述治療反應(yīng)為手術(shù)，化學(xué)治療，放射線治療，荷爾蒙療法或其類似方法中的一種或多種。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述癌癥病患為膀胱癌、乳癌、腦癌、膽管癌、子宮頸癌、大腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、食道癌、胃癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、口腔癌、卵巢癌、胰臟癌、攝護(hù)腺癌與腎臟癌、血癌或淋巴癌中的一種或多種。
10.一種用于生物樣本中偵測(cè)致死細(xì)胞的套組，包括 抗骨髓衍生干/源祖細(xì)胞抗體； 抗PDPK FA/GSK-3 α抗體；以及 輔助性試劑，用以輔助所述抗骨髓衍生干/源祖細(xì)胞抗體與所述抗roPKFA/GSK-3 α抗體與細(xì)胞結(jié)合。
11.一種方法，用來(lái)篩選一測(cè)試化合物作為以致死細(xì)胞為目標(biāo)的潛力藥物，所述方法包括 使所述測(cè)試化合物與致死細(xì)胞接觸；以及 確定所述檢體中I3DPK FA/GSK-3 α的表現(xiàn)； 其中所述檢體中，異常細(xì)胞內(nèi)roPK FA/GSK-3 α的聚積降低，指出所述測(cè)試化合物是以致死細(xì)胞為目標(biāo)的潛力藥物。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，所述測(cè)試化合物包括一種天然產(chǎn)物的提取物。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，所述測(cè)試化合物包括一組合化學(xué)庫(kù)里的一成員。
全文摘要
本發(fā)明為提供一種檢測(cè)致死細(xì)胞存在的方法與材料，該檢測(cè)方法可確認(rèn)各類癌癥病患中致死細(xì)胞的存在，并確認(rèn)該病患的疾病狀態(tài)與治療的反應(yīng)。
文檔編號(hào)G01N33/573GK102625849SQ201080038981
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2010年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月2日
發(fā)明者楊孝德 申請(qǐng)人:楊孝德