專(zhuān)利名稱(chēng)：用于檢測(cè)含致癌基因C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA的LSPR傳感芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于腫瘤細(xì)胞中質(zhì)粒DNA含量的檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于檢測(cè)含致癌 基因C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA的傳感芯片及其方法。
背景技術(shù)：
C-myc是一種原癌基因，在調(diào)節(jié)DNA合成、細(xì)胞凋亡、分化及細(xì)胞周期的進(jìn)程中起 重要作用。由C-myc基因編碼的C-myc重組蛋白不僅在細(xì)胞生命活動(dòng)如細(xì)胞增殖、細(xì)胞分 化和細(xì)胞周期中有極其重要的作用，而且還密切地參與了細(xì)胞腫瘤的轉(zhuǎn)化。C-myc重組蛋白 的表達(dá)與很多癌組織和細(xì)胞腫瘤的啟動(dòng)及癌性程度密切相關(guān)。目前針對(duì)質(zhì)粒DNA的檢測(cè)方法分別有水平瓊脂糖凝膠電泳法和傳統(tǒng)的染色體免 疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)方法，并沒(méi)有專(zhuān)門(mén)針對(duì)含致癌基因 C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA的檢測(cè)方法。上述方法操作繁瑣、精度低，僅能做到定性或半定 量，且抗干擾性、選擇性不足，使其應(yīng)用受到限制。因此需要尋找一種能夠快速定量地檢測(cè) 含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA的方法。本發(fā)明提供了一種基于金納米粒子的局域表面等離 子體共振(LSPR)光譜技術(shù)的生物傳感檢測(cè)芯片及其方法，能簡(jiǎn)便、快速、定量地檢測(cè)癌變 組織中含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA的含量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了一種含致癌基因C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA檢 測(cè)用的Lsra傳感芯片及其方法，其特征在于利用基于金納米粒子表面產(chǎn)生的局域表面等 離子體共振光譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)快速、簡(jiǎn)便、定量地檢測(cè)癌變組織中含C-myc堿基序列的質(zhì)粒DNA 的含量，即所述LSra傳感芯片的檢測(cè)方法是通過(guò)固定于傳感芯片上的C-myc單克隆抗體與 含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA的免疫反應(yīng)結(jié)合，引起芯片上金納米粒子表面產(chǎn)生局域表面 等離子體共振光譜吸收峰的位移，與含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA的含量成線性響應(yīng)關(guān)系 而達(dá)到檢測(cè)目的。為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案采用磁控濺射鍍膜法，在聚苯乙烯塑料、硅氧化物玻璃表面鍍上一層金膜(30 300nm)，通過(guò)控制鍍膜真空度< 1. OX 10_3Pa，鍍膜速度幻.0 A/s，使所述金膜表面平整光滑， 形成金平板電極。然后將Piranha溶液(注=Piranha溶液為濃硫酸雙氧水=7 3的溶 液)滴加在金平板電極金膜表面浸潤(rùn)5 30s，取出用二次蒸餾水反復(fù)沖洗3次處理后，將 上述電極依次浸泡在無(wú)水乙醇和二次蒸餾水中超聲5 600s。然后將上述電極浸入10 200mmol/L的1，4_ 二硫蘇糖醇(DTT)/乙醇溶液中，放置1 Mh，可在金膜表面組裝上一 層DTT單分子膜層。分別用無(wú)水乙醇、二次蒸餾水反復(fù)沖洗后，將上述電極浸入納米金溶膠 溶液(粒徑大小為5 50nm)中放置1 Mh，這樣金納米粒子可通過(guò)Au-S鍵固定在金平 板電極金膜表面形成金納米粒子層，用二次蒸餾水反復(fù)沖洗干凈，并保存于二次蒸餾水中
將上述電極浸入0. 1 lOOmmol/L的3_巰基丙酸中，靜置1 Mh，可在金納米 粒子層表面修飾上3-巰基丙酸單分子層；用二次蒸餾水反復(fù)沖洗后，滴加1 200mmol/ L DMAP-EDC的乙醇溶液(注DMAP為4- 二甲氨基吡啶，EDC為1-乙基_ (3- 二甲基氨基 丙基)碳二亞胺)于電極上活化1 30min，再分別用乙醇、二次蒸餾水反復(fù)沖洗干凈。經(jīng) 過(guò)DMAP-EDC活化，在上述電極上滴加0 2. 6 μ g/mL C-myc單克隆抗體水溶液，反應(yīng)3 600min后，使3-巰基丙酸與C-myc單克隆抗體鍵合，C-myc單克隆抗體的吸附量范圍為 0. 01 0. 4g-mr1 ·πιπΓ2 ；再用二次蒸餾水沖洗干凈，保存于4°C環(huán)境中備用，即得C-myc單 克隆抗體修飾的Lsra傳感芯片。當(dāng)入射光照射傳感芯片，入射光子頻率與金納米粒子上的自由電子的集體振動(dòng) 發(fā)生共振時(shí)，導(dǎo)致金納米粒子表面的局部電場(chǎng)被增強(qiáng)，反射光能量增強(qiáng)，從而展現(xiàn)出強(qiáng)烈 的表面等離子體吸收，其局域表面等離子體共振光譜的吸收峰范圍在200 700nm之 間。當(dāng)C-myc單克隆抗體與含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA結(jié)合后，等離子體共振頻率變 小，共振吸收峰向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，該峰位移與待測(cè)含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA的含量在 9. OX IO"3 μ g/mL 1. 5 μ g/mL范圍內(nèi)成線性響應(yīng)關(guān)系，檢測(cè)下限達(dá)到9. Ong/mL，可實(shí)現(xiàn)在 線動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)、快速定量檢測(cè)含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA分子的目的。同時(shí)，所述LSTO傳 感芯片對(duì)癌變組織中含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA的含量能進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定，其回收率為 91. 11% 112. 00%，在癌癥疾病預(yù)測(cè)和治療等生物醫(yī)學(xué)方面具有非常重要的應(yīng)用前景和 經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本發(fā)明的有益效果是，該LSra傳感芯片與傳統(tǒng)的染色體免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)方法相比，靈敏度高，選擇性和重現(xiàn)性好，且具有組裝簡(jiǎn)便、定 量快速、可實(shí)現(xiàn)多通道檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。


圖ι是LSra傳感芯片敏感膜結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是基于金納米粒子的局域表面等離子體共振光譜檢測(cè)示意圖。圖3是傳感芯片的局域表面等離子共振吸收峰位移與含c-myc抗原片段的質(zhì)粒 DNA濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線圖，其在9. 0 X 10_3 μ g/mL 1. 5 μ g/mL范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖3 內(nèi)插圖)方程為Δ λ = 0. 00948+1. 38723C其中Δ λ表示為最大吸收峰位移值(nm)，C表示含Ciyc抗原片段的質(zhì)粒DNA的 濃度(μ g/mL)。上述關(guān)系曲線是在室溫25°C時(shí)繪制的。圖4是典型質(zhì)粒DNA的pCMV-myc片段堿基序列圖。圖5是典型金納米粒子的TEM圖。圖1、2中，1.厚度均勻的金膜，2. DTT自組裝單分子層，3.金納米粒子層，4.3-巰 基丙酸單分子層，5. C-myc單克隆抗體，6.含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
LSPR傳感芯片的組裝制備1)采用磁控濺射鍍膜法在聚苯乙烯塑料、硅氧化物玻璃基質(zhì)表面鍍上一層IOOnm 的金膜，通過(guò)控制鍍膜真空度為1. O X IO-4Pa,鍍膜速度為1.0 A/s,使所述金膜表面平整光 滑，形成金平板電極；2)將Piranha溶液(注=Piranha溶液為濃硫酸雙氧水=7 3的溶液)滴加 在金平板電極表面浸潤(rùn)15s，取出后用二次蒸餾水反復(fù)沖洗3次；3)將上述電極依次浸泡在無(wú)水乙醇和二次蒸餾水中超聲60s ；4)將上述電極浸入50mmol/L的DTT溶液中，放置10h，形成DTT單分子層，用無(wú)水 乙醇反復(fù)沖洗3次以去除表面游離的DTT，再用二次蒸餾水反復(fù)沖洗干凈；5)將上述電極浸入粒徑為10. 5nm的納米金溶膠中，放置Mh，取出后用二次蒸餾 水反復(fù)沖洗干凈，這樣金納米粒子通過(guò)Au-S鍵固定在金平板電極金膜表面形成金納米粒 子層，然后保存于二次蒸餾水中備用；6)將上述電極浸入lOmmol/L的3-巰基丙酸中，靜置他，在金納米粒子上形成
3-巰基丙酸單分子層，然后用二次蒸餾水沖洗干凈；7)用二次蒸餾水反復(fù)沖洗后，滴加lOOmmol/LDMAP-EDC的乙醇溶液(注DMAP為
4-二甲氨基吡啶，EDC為1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺)于電極上活化lOmin， 再分別用乙醇、二次蒸餾水反復(fù)沖洗干凈；8)在上述電極上滴加2. 4μ g/mL C_myC單克隆抗體水溶液，反應(yīng)60min后，再用二 次蒸餾水沖洗干凈，保存于4°C環(huán)境中備用，即制得用于檢測(cè)含致癌基因C-myc抗原片段的 質(zhì)粒DNA的C-myc單克隆抗體修飾的LSI3R傳感芯片。實(shí)施例2含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定1)所用試劑(二次蒸餾水、PBS緩沖溶液)經(jīng)滅菌處理后均保存于4°C環(huán)境中備 用；2)取1 μ L質(zhì)粒DNA置于1. 5mL小試管中，以PBS為緩沖溶液，分別稀釋1 100000 倍，配制成0 1. 5 μ g/mL的一系列溶液備用；3)采用上述C-myc單克隆抗體修飾的LSI3R傳感芯片分別測(cè)試各濃度的質(zhì)粒DNA 樣品，通過(guò)C-myc單克隆抗體與含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA的免疫反應(yīng)結(jié)合，引起芯片上 金納米粒子局域表面等離子體共振光譜吸收峰紅移，該峰位移與質(zhì)粒DNA含量成線性響應(yīng) 關(guān)系；以質(zhì)粒DNA的濃度C( μ g/mL)為橫坐標(biāo)，最大吸收峰位移值Δ λ (nm)為縱坐標(biāo)，繪制 測(cè)定質(zhì)粒DNA樣品濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖3內(nèi)插圖)，通過(guò)質(zhì)粒DNA對(duì)應(yīng)濃度的LSI3R吸收 峰位移信號(hào)，即可測(cè)定出癌變組織樣品中的含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA的含量；4)測(cè)試完后，用0. lmol/L HCl溶液洗脫回復(fù)，再分別用PBS緩沖溶液、二次蒸餾水 沖洗干凈，可保存于4°C環(huán)境中備用。實(shí)施例3大腸桿菌中含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA濃度的測(cè)定本實(shí)施例采用堿裂解法提取大腸桿菌中含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA，具體操作 方法如下1、取含質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞于aiil LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，取1.5ml菌體于Ep管，以4000rpm離心3min，棄上清液。2、力口 0. Iml 溶液 I (1 %葡萄糖，50mM/L EDTA ρΗ8· 0,25mM/L Tris-HCl ρΗ8· 0)充 分混合。加入0. 2ml溶液II (0. 2mM/L NaOH, 1 % SDS)，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5min。加入 0. 15ml預(yù)冷溶液III (5mol/L KAc, ρΗ4· 8)，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5min。3、以IOOOrpm離心20min，取上清液于另一新Ep管，再加入等體積的異戊醇，混勻 后于0°C靜置lOmin，再以IOOOrpm離心20min，棄上清，用70 %乙醇0. 5ml洗滌一次，抽干 所有液體，待沉淀干燥后，溶于0. 05mlTE緩沖液中。4、將上述處理好的質(zhì)粒DNA待測(cè)液滴在傳感芯片表面反應(yīng)Imin后用二次蒸餾水 沖洗。再次記錄讀數(shù)。每個(gè)吸收峰響應(yīng)值(Δ λ，nm)可由下式得出Δ λ = λ 1-λ2，把 Δ λ代入到圖3的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，即可算出待測(cè)液中含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA的濃 度值，檢測(cè)結(jié)果表明該傳感芯片檢測(cè)技術(shù)可以用于質(zhì)粒DNA含量快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)。實(shí)施例4回收率的測(cè)定本實(shí)施例測(cè)定質(zhì)粒DNA傳感芯片對(duì)響應(yīng)不同濃度質(zhì)粒DNA溶液的回收率，并與傳 統(tǒng)生物學(xué)上的染色體免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)方法進(jìn)行比較。 在已知濃度溶液中加入已知量的含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA樣品溶液(300ng/mL、500ng/ mL和1800ng/mL)，然后測(cè)定各樣品的吸收峰，計(jì)算位移值Δ λ，對(duì)照工作曲線找出濃度，比 較測(cè)得的加入量和實(shí)際加入量，獲得的回收率分別為93. 33%U06. 00%和101. 67%，平均 回收率為100. 33%，而ChIP方法僅能做出定性檢測(cè)，說(shuō)明本發(fā)明方法優(yōu)于ChIP法，且回收 率好，在含致癌基因C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA檢測(cè)方面具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。實(shí)施例5重現(xiàn)性的測(cè)定在上述的傳感芯片上，固定C-myc單克隆抗體的傳感膜對(duì)響應(yīng)不同濃度的質(zhì)粒 DNA溶液的出峰位置的重現(xiàn)性，本實(shí)施例測(cè)定LSra傳感芯片對(duì)響應(yīng)不同濃度含c-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA溶液 的吸收峰位置的重現(xiàn)性，對(duì)0.6 μ g/mL和1.5yg/mL樣品重復(fù)測(cè)定12次，通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)的分 析處理，獲得的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3. 70%和1.08%，說(shuō)明該方法有著良好的重現(xiàn)性，確 保了所測(cè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)含致癌基因C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA(6)的LSTO傳感芯片，其特征 在于利用金納米粒子表面產(chǎn)生的局域表面等離子體共振(LSPR)光譜對(duì)含C-myc抗原片段 的質(zhì)粒DNA(6)的含量進(jìn)行測(cè)定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的LSI^R傳感芯片，其特征在于所述LSI^R傳感芯片的制備過(guò)程 如下1)采用磁控濺射鍍膜法，在聚苯乙烯塑料、硅氧化物玻璃基質(zhì)表面鍍上一層金膜(1)， 通過(guò)控制鍍膜真空度彡1.0\10_^!，鍍膜速度幻.0人/5，使所述金膜(1)表面平整光滑，形 成金平板電極；2)將Piranha溶液(注=Piranha溶液為濃硫酸雙氧水=7 3的溶液)滴加在金 平板電極金膜(1)表面浸潤(rùn)5 30s，取出后用二次蒸餾水反復(fù)沖洗3次；3)將上述電極依次浸泡在無(wú)水乙醇和二次蒸餾水中超聲5 600s；4)將上述電極浸入10 200mmol/L的1，4-二硫蘇糖醇(DTT)/乙醇溶液中，放置1 Mh，形成DTT單分子層O)，用無(wú)水乙醇反復(fù)沖洗3次以去除表面游離的DTT，再用二次蒸 餾水反復(fù)沖洗干凈；5)將上述電極浸入納米金溶膠溶液中，放置1 Mh，取出后用二次蒸餾水反復(fù)沖洗干 凈，這樣金納米粒子通過(guò)Au-S鍵固定在金平板電極金膜(1)表面形成金納米粒子層(3)，然 后保存于二次蒸餾水中備用；6)將上述電極浸入0.1 lOOmmol/L的3-巰基丙酸中，靜置1 Mh，在金納米粒子 層( 上形成3-巰基丙酸單分子層；7)用二次蒸餾水反復(fù)沖洗后，滴加1 200mmol/LDMAP-EDC的乙醇溶液(注DMAP 為4-二甲氨基吡啶，EDC為1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺)于電極上活化1 30min，再分別用乙醇、二次蒸餾水反復(fù)沖洗干凈；8)在上述電極上滴加0 2.6 μ g/mL C-myc單克隆抗體水溶液，反應(yīng)3 600min后， 再用二次蒸餾水沖洗干凈，保存于4°C環(huán)境中備用，即得C-myc單克隆抗體(5)修飾的LSI5R 傳感芯片。
3.根據(jù)權(quán)利要求ι所述的Lsra傳感芯片，其特征在于所述LSra傳感芯片的檢測(cè)方法 是通過(guò)固定于傳感芯片上的C-myc單克隆抗體(5)與含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA(6)的 免疫反應(yīng)結(jié)合，引起芯片上金納米粒子層(3)表面產(chǎn)生局域表面等離子體共振光譜吸收峰 的位移，與含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA(6)的含量成線性響應(yīng)關(guān)系。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的Lsra傳感芯片，其特征在于在聚苯乙烯塑料、硅氧化物玻璃 基質(zhì)表面所鍍金膜(1)的厚度控制為30 300nm之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的Lsra傳感芯片，其特征在于所述金溶膠溶液中金納米粒子的 粒徑大小在5 50nm之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的LSra傳感芯片，其特征在于固定于LSra傳感芯片上的C-myc 單克隆抗體(5)的吸附量在0. 01 0. 4g · mL—1 · mm 2之間。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的LSI^R傳感芯片，其特征在于所述LSI^R傳感芯片上金納米粒 子層(3)表面所展現(xiàn)的局域表面等離子體共振光譜的吸收峰范圍在200 700nm之間。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的Lsra傳感芯片，其特征在于所述Lsra傳感芯片對(duì)癌變 組織中含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA(6)的含量能進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定，其回收率為91. 11% ·112. 00%，線性范圍為 9. 0Χ10_3μ g/mL 1. 5 μ g/mL，檢測(cè)下限達(dá)到 9. Ong/mL。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于局域表面等離子體共振(LSPR)光譜檢測(cè)含致癌基因C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA(6)的LSPR傳感芯片。本發(fā)明是在LSPR傳感芯片的金膜(1)表面組裝上一層DTT單分子層(2)，接上金納米粒子層(3)，在所述金納米粒子層(3)表面修飾上3-巰基丙酸單分子層(4)，然后通過(guò)DMAP-EDC活化，使所述的3-巰基丙酸單分子層(4)與C-myc單克隆抗體(5)結(jié)合，通過(guò)C-myc單克隆抗體(5)與含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA(6)的免疫反應(yīng)結(jié)合，引起金納米粒子表面產(chǎn)生局域表面等離子體共振吸收峰的位移，以此來(lái)檢測(cè)癌變組織中含C-myc抗原片段的質(zhì)粒DNA(6)的含量。本發(fā)明的效果和益處在于所述LSPR傳感芯片具有組裝簡(jiǎn)便、定量快速、可實(shí)現(xiàn)多通道檢測(cè)，且靈敏度高、選擇性和重現(xiàn)性好，優(yōu)于傳統(tǒng)的染色體免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation，ChIP)方法。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102081095SQ201110000088
公開(kāi)日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2011年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月4日
發(fā)明者何婧琳, 孫立賢, 張玲, 戴云林, 曹忠, 曾巨瀾, 王明星, 黃茜茜 申請(qǐng)人:長(zhǎng)沙理工大學(xué)