專利名稱：一種大腸癌預(yù)后預(yù)測模型的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種以SPARCL1與P53作為標(biāo)志物的大腸癌預(yù)后預(yù)測模型的建立方法。
背景技術(shù)：
大腸癌是一種常見的惡性腫瘤，在我國和西方發(fā)達國家其發(fā)病率及死亡率均居惡性腫瘤譜前列。2000年到2004年，在美國大腸癌的發(fā)病率在所有惡性腫瘤中居第三位，而死亡率亦高居第三位。在我國，隨著生活水平的提高和飲食習(xí)慣的改變，大腸癌的發(fā)病率也日漸增高，已躍居第4位，每年新發(fā)大腸癌病例達40萬例，上升速度接近5%，其中很多是30-40歲的中年人。上世紀(jì)90年代與70年代相比，我國大腸癌的發(fā)病率在城市上升了 31.95%，在農(nóng)村上升了 8.51%，死亡率位居惡性腫瘤死亡譜的第4或第5位?？梢灶A(yù)見，我國大腸癌的發(fā)病率與死亡率在今后很長一段時期內(nèi)還將繼續(xù)穩(wěn)步上升，成為我國最常見的、發(fā)病率上升最快的惡性腫瘤之一。近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療等傳統(tǒng)治療手段不斷發(fā)展，生物靶向治療新藥不斷研發(fā)，但大腸癌的5年生存率仍然只有63. 4%左右， 其改善速度明顯跟不上治療手段的進步。目前判斷大腸癌預(yù)后的方法，主要還是依靠傳統(tǒng)的分期方法，但臨床工作中的許多問題，已經(jīng)是用這些傳統(tǒng)的分期方法無法完全解釋的為什么同一分期大腸癌病人的生存情況常存在著較大差異？為什么初診時I期的病人后來卻發(fā)生了遠處轉(zhuǎn)移？因此，極其重要的一點就是尋找到更多的大腸癌預(yù)后相關(guān)標(biāo)志物及模型，更準(zhǔn)確的預(yù)測大腸癌病人預(yù)后及對不同治療的敏感性，尋找干預(yù)阻斷的靶點，以施行不同的治療策略，最終實現(xiàn)對病人的個體化治療。P53是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最重要的抑癌基因，定位于人染色體17pl3，含有11個外顯子和10個內(nèi)含子。分為野生型和突變型兩種，野生型P53基因不僅作為抑癌基因發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，還參與轉(zhuǎn)錄、DNA損傷與修復(fù)、細(xì)胞周期凋控、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖及細(xì)胞分化等多個過程，具有“分子警察”的功能。突變型P53蛋白不易水解，有較長的半衰期，在惡性腫瘤細(xì)胞中堆積，突變型P53蛋白可與野生型P53蛋白結(jié)合而使其負(fù)調(diào)控細(xì)胞生長的作用喪失。突變型P53蛋白的過度表達與P53基因突變緊密相關(guān)。既往研究P53與影響患者的分期、多藥耐藥、對化療或放療的反應(yīng)以及術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等情況相關(guān)。SPARCL1屬于介導(dǎo)細(xì)胞基質(zhì)相互作用的粘附分子。SPARCL1最早在1993年&虹￡11111 等人在非小細(xì)胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，命名為MAST9。SPARCL1蛋白屬于SPARC家族，與SPARC (secreted protein acidic and rich in cysteine) ·歹ij* 62% 白勺|l]iJI1^。胃胃者！^!* cysteine rich follistatin-like (FS)結(jié)構(gòu)域禾口extracellular calcium binding (EC) 結(jié)構(gòu)域，但SPARCL1的N端遠較SPARC為長，它也因與SPARC這種在結(jié)構(gòu)上的高度同源性而得名SPARC-Iike 1。SPARCL1的功能目前尚未完全明確。SPARCL1在非小細(xì)胞肺癌、轉(zhuǎn)移性前列腺癌、大腸癌、膀胱癌、胰腺導(dǎo)管癌中表達下調(diào)，但在肝癌中表達上調(diào)。但SPARCL1在大腸癌中的表達及與大腸癌的預(yù)后等臨床特征的關(guān)系未見明確報道。
生物信息學(xué)是一門利用計算機對生命科學(xué)研究中的生物信息進行存儲、檢索和分析的新興交叉學(xué)科。其基本的研究過程為利用計算機存儲核酸或蛋白質(zhì)信息，研究科學(xué)的算法，編制相應(yīng)的軟件對其信息進行分析、比較和預(yù)測，從中發(fā)現(xiàn)規(guī)律。支持向量機 (support vector machine, SVM)是Vapnik等1995提出的一種新的分類技術(shù)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于面部識別、基因組學(xué)等多個領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種大腸癌預(yù)后預(yù)測模型的建立方法。即是一種通過免疫組化檢測、標(biāo)志物組合及支持向量機分析的聯(lián)合應(yīng)用來建立標(biāo)志物組合模型的方法。該方法通過以下步驟實現(xiàn)
1、免疫組化法檢測SPARCL1、P53蛋白在大腸癌組織中的表達水平組織蠟塊標(biāo)本收集一切片一烤箱過夜一脫蠟一水化一抗原修復(fù)一自然冷卻一洗片一甩干，置濕盒內(nèi)一滴加A試劑(Endogenous Peroxidase Blocking Solution內(nèi)源性過氧化酶阻斷劑)靜置 —洗片一滴加B試劑(Blocking Solution Non-Immune Serum非免疫動物血清)靜置 —滴加一抗，靜置一洗片一滴加 C 試劑(Biotinylated Second Antibody Goat anti Mouse IgG生物素標(biāo)記的二抗)，靜置一洗片一滴加D試劑(Enzyme Conjugate HRP-Mr印tavidin鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶)，靜置一洗片一DAB顯色一觀察顯色后淋洗一細(xì)胞核染色一淋洗一分化一自來水淋洗一返藍一脫水一吹干一封片；
2、半定量法將SPARCL1、P53蛋白的組織表達水平分級每例標(biāo)本隨機檢測5個高倍鏡視野，分別給陽性范圍和染色深度打分陽性范圍分為0-4級0 (<10%)，1 (10%-25%)， 2 (25%-50%)，3 (50%-75%)，4 (>75%)；染色深度分為0-3級0為陰性，1為淺黃色，2為棕黃色，3為深棕色。最后將前兩部分得分相加，最后結(jié)果分為0-7級；
3、SPARCLUP53蛋白表達水平經(jīng)支持向量機組合分析并驗證，最后建立判別模型支持向量機采用徑向基核函數(shù)(radial based kernel)，Gamma值設(shè)為0. 6，罰分函數(shù)(C)設(shè)為 19。特征向量的選取采用統(tǒng)計過濾結(jié)合模型依賴性篩選的方法。將SPARCL1與P53組合用于支持向量機模型的輸入，用十倍交叉驗證法評估模型的預(yù)測效果(三年生存/死亡)，選出建立支持向量機模型預(yù)測的約登指數(shù)(約登指數(shù)=[(靈敏度+特異度)/2+靈敏度]/2)最高的組合作為最終的模型，經(jīng)十倍交叉驗證的預(yù)測值作為最終的結(jié)果。本發(fā)明的另一個目的是提供所述模型在大腸癌病人術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)危險度預(yù)測實驗中的應(yīng)用。本發(fā)明以SPARCL1與P53組合作為標(biāo)志物構(gòu)建模型，用于大腸癌病人術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)危險度預(yù)測實驗。本發(fā)明結(jié)合免疫組化檢測、標(biāo)志物組合及支持向量機分析，聯(lián)合應(yīng)用于建立大腸癌預(yù)測模型。經(jīng)過研究，免疫組化檢測SPARCL1及P53在大腸癌患者手術(shù)已切除腫瘤組織中的表達情況，首次通過生物信息學(xué)組合這兩者的表達值，形成SPARCL1/P53組合模型，并證實發(fā)現(xiàn)該預(yù)后模型具有實驗輔助預(yù)測大腸癌患者預(yù)后的作用。由此首次發(fā)現(xiàn)， 通過免疫組化檢測、標(biāo)志物組合及支持向量機分析的聯(lián)合應(yīng)用來建立標(biāo)志物組合模型的方法。


圖1顯示了 SPARCL1/P53預(yù)后模型不同判別結(jié)果病人(所有分期)的生存曲線。圖2顯示了 II期及III期病人的生存曲線。圖3顯示了 SPARCL1/P53預(yù)后模型不同判別結(jié)果病人(II+III期)的生存曲線。圖4顯示了 SPARCL1/P53預(yù)后模型不同判別結(jié)果病人(II期)的生存曲線。圖5顯示了 SPARCL1/P53預(yù)后模型不同判別結(jié)果病人(III期)的生存曲線。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些具體實施僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1
步驟1 :SPARCL1、P53蛋白在大腸癌組織中的檢測
采取免疫組化方法，檢測病人手術(shù)已切除大腸癌組織中P53及SPARCL1的表達情況。選取的131 個大腸癌組織蠟塊來自于1999 年至2004 年浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院收治的大腸癌患者手術(shù)切除組織(I期23例，
期43例，期56例，期9例)，且診斷均經(jīng)術(shù)后病理證實，所有患者的臨床病理資料術(shù)后均以隨訪表形式登記，并每年通過信件或電話隨訪其生存及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等情況36個月以上，本研究實驗開始前再次隨訪核實。所有組織蠟塊標(biāo)本，均來自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院病理科存檔的組織蠟塊。組織在手術(shù)中取下后，立即置于4%福爾馬林中固定，固定充分后，經(jīng)取材、脫水、透明、 浸蠟、包埋后，切片HE染色病理確診，然后長期保存。免疫組化試劑盒包括即用型快捷免疫組化MaxVision 試劑盒(鼠/兔，邁新生物，catalog number: KIT-5010)、免疫組化SP超敏試劑盒(羊，邁新生物，catalog number: KIT-9709)及 DAB 顯色試劑盒(邁新生物，catalog number:DAB_0031)。所用的抗體包括P53抗體(鼠抗人P53單克隆抗體，中杉金橋，catalog number: ZM-0408，即用型)、SPARCL1 抗體(Polyclonal goat anti-human SPARC-Iike 1 antibody (R&D, catalog number: AF2728，稀釋度 1:160)。免疫組化過程組織蠟塊切成約4μπι厚切片，展片并貼片于多聚賴氨酸預(yù)處理的載玻片上一59°C烤箱過夜一二甲苯脫蠟(20minX3—梯度酒精水化(無水酒 5minX3 — 95%酒精5min — 75%酒精5min)—蒸溜水中水化一IXEDTA中，98°C加熱15 分鐘(抗原修復(fù))一自然冷卻至室溫一蒸餾水中洗片一TBS溶液(PH 7.4)洗片(5!^11)— 甩干，置于濕盒內(nèi)一滴加A試劑(內(nèi)源性過氧化酶阻斷劑)，靜置IOmin — TBS 洗片 3minX3次一滴加B試劑(非免疫動物血清)靜置15min —吸干多余液體，滴加一抗，靜置2小時一TBS 5minX3次一滴加C試劑(生物素標(biāo)記的二抗)，靜置15min — TBS 5minX2次一滴加D 試劑鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶)，靜置15min — TBS 3minX3次一滴加新鮮配制好的DAB顯色劑一約lmin，觀察顯色后置于自來水中淋洗一蘇木素浸泡IOmin —自來水淋洗一鹽酸酒精分化Is —自來水淋洗一56°C熱水中浸泡返藍一梯度酒精脫水(75%酒精5min — 95%酒精5min —無水酒精5minX 3)—吹干，中性樹脂封片。步驟2 :SPARCLU P53蛋白表達水平分級本實施例對步驟1的結(jié)果進行分級。每例標(biāo)本隨機檢測5個高倍鏡視野(X400倍)，采用半定量法，綜合考慮陽性細(xì)胞的范圍和染色深度。陽性范圍分為0-4級0 (<10%)，1 (10%-25%)，2 (25%_50%)，3 (50%-75%)，4 (>75%);染色深度分為0-3級0為陰性，1為淺黃色，2為棕黃色，3為深棕色。將前兩部分得分相加，最后結(jié)果分為0-7級。步驟3 :SPARCLU P53蛋白表達水平經(jīng)生物信息學(xué)組合形成模型
本實驗數(shù)據(jù)采用浙江大學(xué)腫瘤研究所余捷凱設(shè)計的ZUCI-ProteinChip Data Analyze System軟件包分析。用支持向量機方法建立判別模型，用十倍交叉驗證法作為評估模型判別效果的方法。支持向量機采用徑向基核函數(shù)(radial based kernel)，Gamma值設(shè)為 0.6，罰分函數(shù)(C)設(shè)為19。特征向量的選取采用統(tǒng)計過濾結(jié)合模型依賴性篩選的方法。將 SPARCL1與P53組合用于支持向量機模型的輸入，用十倍交叉驗證法評估模型的預(yù)測效果 (三年生存/死亡)，選出建立支持向量機模型預(yù)測的約登指數(shù)(約登指數(shù)=[(靈敏度+特異度)/2+靈敏度]/2)最高的組合作為最終的模型，經(jīng)十倍交叉驗證的預(yù)測值作為最終的結(jié)果。根據(jù)SPARCL1/P53預(yù)測模型，可將病人分為兩組，分別為good prognosis (預(yù)測值=0) 禾口 bad prognosis (預(yù)測值=1)。實施例2
1. SPARCL1/P53模型對大腸癌病人(全部分期)的預(yù)后判斷作用圖1顯示了 SPARCL1/P53預(yù)后模型不同判別結(jié)果病人(所有分期)的生存曲線。 Kaplan- Meier法驗證顯示，SPARCL1/P53預(yù)測模型可將131例病人分為生存時間差異極大的兩組(Ρ<0· 001)，分別為 good prognosis (預(yù)測值=0)和 kid prognosis (預(yù)測值=1)，其中g(shù)ood prognosis組病人估計中位生存時間91. 676月，而bad prognosis組病人估計中位生存時間41. 928月。. SPARCL1/P53模型對大腸癌病人術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況的預(yù)測效果
在這些病人中，good prognosis組(預(yù)測值=0)術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移發(fā)生率為22. 34%，而kid prognosis組(預(yù)測值=1)術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移發(fā)生率為64. 86%，兩者比較P<0. 001。預(yù)后模型對術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測效果
有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移Prediction(0)7321Prediction(1)1324
Prediction 各標(biāo)志物組合模型對預(yù)后的預(yù)測值 (0=good prognosis,l=bad prognosis)。. SPARCL1/P53模型對II期及III期大腸癌病人的預(yù)后判斷作用
選取總131大腸癌病例中II期及III期共99例，結(jié)合比較傳統(tǒng)分期，觀察SPARCL1/P53 模型對II期及III期大腸癌病人生存情況的預(yù)測效果。圖2顯示了 II期及III期病人的生存曲線。Kaplan-Meier生存分析顯示，II期和III 期病人估計中位生存時間差異不大，分別為80. 566月VS 63. 038月(P=0. 039)。圖3顯示了 SPARCLl/ P53預(yù)后模型不同判別結(jié)果病人(II+III期)的生存曲線。 SPARCL1/P53模型將99例II及III期病人分為生存時間差異較大的兩組(P<0. 001)，分別為 good prognosis (予頁測值=0)禾口 bad prognosis (預(yù)測值=1)，其中 good prognosis 組病人估計中位生存時間為81. 658月，而kid prognosis組病人估計中位生存時間為43. 889月。
圖4顯示了 SPARCL1/P53預(yù)后模型不同判別結(jié)果病人(II期)的生存曲線。 在43例II期大腸癌病人中，SPARCL1/P53模型亦可將病人分為生存時間差異較大的兩組 (P<0. 001)，分別為 good prognosis (預(yù)測值=O^Pbad prognosis (預(yù)測值=1 )，其中 good prognosis組病人估計中位生存時間為88. 65月，而kid prognosis組病人估計中位生存時間為50. 509月。 圖5顯示了 SPARCL1/P53預(yù)后模型不同判別結(jié)果病人(III期)的生存曲線。在 56例III期大腸癌病人中，SPARCL1/P53預(yù)后模型亦可將病人分為生存時間差異較大的兩組 (P<0. 001)，分別為 good prognosis (預(yù)測值=O^Pbad prognosis (預(yù)測值=1 )，其中 good prognosis組病人估計中位生存時間為75. 74月，而kid prognosis組病人估計中位生存時間為36. 167月。
權(quán)利要求
1.一種大腸癌預(yù)后預(yù)測模型的建立方法，其特征在于，通過以下步驟實現(xiàn)(1)免疫組化法檢測SPARCL1、P53蛋白在大腸癌組織中的表達水平收集組織蠟塊標(biāo)本一切片一烤箱過夜一脫蠟一水化一抗原修復(fù)一自然冷卻一洗片一甩干，置濕盒內(nèi)一滴加內(nèi)源性過氧化酶阻斷劑，靜置一洗片一滴加非免疫動物血清，靜置一滴加一抗，靜置一洗片 —滴加生物素標(biāo)記的二抗，靜置一洗片一滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶，靜置 —洗片一DAB顯色一觀察顯色后淋洗一細(xì)胞核染色一淋洗一分化一自來水淋洗一返藍一脫水一吹干一封片；(2)半定量法將SPARCL1、P53蛋白的組織表達水平分級每例標(biāo)本隨機檢測5個高倍鏡視野，分別給陽性范圍和染色深度打分陽性范圍分為0-4級<10%為0級，10%-25%為 1級，25%-50%為2級，50%-75%為3級，>75%4級；染色深度分為0_3級0為陰性，1為淺黃色，2為棕黃色，3為深棕色；最后將前兩部分得分相加，最后結(jié)果分為0-7級；(3)SPARCLU P53蛋白表達水平經(jīng)支持向量機組合分析并驗證，建立判別模型支持向量機采用徑向基核函數(shù)，Gamma值設(shè)為0. 6，罰分函數(shù)(C)設(shè)為19，特征向量的選取采用統(tǒng)計過濾結(jié)合模型依賴性篩選的方法，將SPARCL1與P53組合用于支持向量機模型的輸入，用十倍交叉驗證法評估模型的預(yù)測效果，三年生存/死亡，選出建立支持向量機模型預(yù)測的約登指數(shù)約登指數(shù)=[(靈敏度+特異度)/2+靈敏度]/2)，最高的組合作為最終的模型，經(jīng)十倍交叉驗證的預(yù)測值作為最終的結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法建立的模型在大腸癌病人術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)危險度預(yù)測實驗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種大腸癌預(yù)后預(yù)測模型的建立方法，通過免疫組化法檢測SPARCL1、P53蛋白在大腸癌組織中的表達水平；半定量法將SPARCL1、P53蛋白的組織表達水平分級；SPARCL1、P53蛋白表達水平經(jīng)支持向量機組合分析并驗證，最后建立判別模型。本發(fā)明結(jié)合免疫組化檢測、標(biāo)志物組合及支持向量機分析，聯(lián)合應(yīng)用于建立大腸癌預(yù)測模型。研究表明，本發(fā)明以SPARCL1與P53組合作為標(biāo)志物構(gòu)建模型具有實驗輔助預(yù)測大腸癌患者預(yù)后的作用。可在大腸癌病人術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)危險度預(yù)測實驗中的應(yīng)用。
文檔編號G01N33/68GK102183662SQ20111006946
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月22日
發(fā)明者余捷凱, 胡涵光, 葛維挺, 虞舒靜, 鄭樹 申請人:浙江大學(xué)