專利名稱：一種測(cè)定小漿果orac的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一種測(cè)定小漿果總抗氧化能力的方法，提供了一種適用于小漿果總抗氧化能力測(cè)定的ORAC檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于活性檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
小漿果，包括草莓、藍(lán)莓、樹莓、黑莓等，以其獨(dú)特的風(fēng)味及營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值風(fēng)靡世界，是“超級(jí)水果”。小漿果富含維生素和花青素等多酚類活性物質(zhì)成分，具有抗氧化清除氧自由基的功能，是集營(yíng)養(yǎng)保健于一身的第三代保健果品。研究證明老化和多種疾病與氧自由基有關(guān)，因此與健康關(guān)系密切的食品，包括小漿果的抗氧化能力測(cè)定，引起了人們廣泛關(guān)注。ORAC (Oxgen Radical Absorbance Capacity)指氧自由基吸收能力，ORAC 分析方法利用熒光強(qiáng)度檢測(cè)的高靈敏性，根據(jù)自由基破壞熒光探針，使熒光強(qiáng)度產(chǎn)生變化原理，以偶氮類化合物AAPH為自由基來源，采用抗氧化劑作用下的熒光衰退曲線下面積與熒光自然衰退曲線下面積的差，作為衡量抗氧化劑的抗氧化能力指標(biāo)，結(jié)果以抗氧化劑維生素E 水溶性類似物Trolox為定量標(biāo)準(zhǔn)，使用熒光微孔板分析儀進(jìn)行分析。ORAC分析方法受到美國(guó)農(nóng)業(yè)部(USDA)、美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院(NIH)、美國(guó)宇航局(NASA)及美國(guó)哈佛大學(xué)(Harvard University)等眾多科技研究機(jī)構(gòu)的認(rèn)可。同時(shí)在產(chǎn)品研發(fā)、生產(chǎn)、銷售的工業(yè)領(lǐng)域中，ORAC 分析方法作為衡量產(chǎn)品抗氧化能力的標(biāo)準(zhǔn)分析方法已受到業(yè)內(nèi)的廣泛認(rèn)同，并成為各進(jìn)出口企業(yè)實(shí)行國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)量控制的依據(jù)。ORAC值成為食品中抗氧化物含量的國(guó)際通用標(biāo)準(zhǔn)單位，國(guó)際市場(chǎng)上熱銷的“超級(jí)水果”產(chǎn)品都標(biāo)注了 ORAC值。我國(guó)抗氧化能力測(cè)試研究方法很多，不同的方法評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)不一致，有些針對(duì)親水過氧基，有些針對(duì)親脂過氧基進(jìn)行分析。我們所用ORAC分析方法是測(cè)試全套總抗氧化能力的高效快速方法，相對(duì)其他抗氧化分析方法，ORAC可針對(duì)親水過氧基、親脂過氧基、氫氧基、過氧亞硝基和單線態(tài)氧五種自由基進(jìn)行分析，提供全套總抗氧化能力測(cè)試，解決了動(dòng)力學(xué)滯后時(shí)間測(cè)量問題，保證結(jié)果的穩(wěn)定準(zhǔn)確，可重復(fù)性強(qiáng)，并且可以大大減少測(cè)定所用樣品量，使用微孔板測(cè)定實(shí)現(xiàn)高通量的衡量檢測(cè)。ORAC分析方法的研究在國(guó)內(nèi)還處于起步階段， 針對(duì)小漿果的總抗氧化能力也沒有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法和統(tǒng)一的評(píng)價(jià)依據(jù)，本發(fā)明提供了一種適用于小漿果總抗氧化能力測(cè)定的ORAC檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，以Trolox為定量標(biāo)準(zhǔn)，用國(guó)際通用的ORAC值來評(píng)價(jià)小漿果總抗氧化能力，便于推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明主要是提供一種適用于小漿果總抗氧化能力測(cè)定的ORAC檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。技術(shù)方案本發(fā)明主要是提供一種適用于小漿果總抗氧化能力測(cè)定的ORAC檢測(cè)試劑盒，由以下成分組成
4Trolox存儲(chǔ)液熒光素鈉存儲(chǔ)液 AAPH溶液
40mM 40μΜ 60mM 75mM
pH7.4磷酸緩沖液
熒光微孔反應(yīng)板包裝盒
黑底96孔板
一個(gè)塑料或硬紙等材料做成的盒子ORAC檢測(cè)試劑盒所用抗氧化標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為一種抗氧化劑維生素E水溶性類似物 Trolox (6-hydroxy-2,5，7，8-tetramethyIchromate-2-carboxylie acid，6_ 輕基-2,5,7, 8-四甲基鉻酸鹽-2-羧酸)，存儲(chǔ)濃度為40mM ；所用熒光物質(zhì)為熒光素鈉(Fluorescein disodium, disodium2- (3-oxo-6-oxidoxanthen-9-yl) benzoate，水合焚光月安內(nèi)鹽)，存fi者濃度為40 μ M，棕色瓶避光保存；所用自由基產(chǎn)生劑為AAPH(2，2' -azobis (2-methylpropi onamide) -dihydrochloride, 2,2’ -偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽)，一種偶氮類化合物，濃度為60mM ；所用緩沖液為75mM的pH7. 4磷酸緩沖液，所有存儲(chǔ)試劑與樣品的稀釋均用此緩沖液。反應(yīng)在熒光微孔板，即黑底96孔板中進(jìn)行，以熒光微孔板分析儀讀取數(shù)據(jù)，分析結(jié)果；所用包裝盒為一個(gè)塑料或硬紙等材料做成的盒子，整個(gè)小漿果ORAC檢測(cè)試劑盒 2-8 °C保存。一種小漿果總抗氧化能力ORAC檢測(cè)方法，包括了以下步驟1)小漿果樣品前處理小漿果樣品采用醇提取法處理，提取液用試劑盒提供的緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)得到樣品液。2)用試劑盒的試劑進(jìn)行檢測(cè)將樣品液或Trolox標(biāo)準(zhǔn)品液與熒光素鈉試劑混合， 37°C反應(yīng)15分鐘后，加入AAPH溶液，立即測(cè)定熒光強(qiáng)度。3)分析檢測(cè)結(jié)果采用抗氧化樣品作用下的熒光衰退曲線下面積與熒光自然衰退曲線下面積的差，作為衡量抗氧化樣品的抗氧化能力指標(biāo)，以Trolox為定量標(biāo)準(zhǔn)，從而測(cè)算出小漿果總抗氧化能力大小。所用小漿果樣品的醇提取液，為準(zhǔn)確稱量的5克小漿果樣品，加入50毫升的80% 甲醇(或70%乙醇)，勻漿機(jī)攪勻，37°C搖床120rpm提取M小時(shí)，3000rpm離心過濾，4°C 保存的提取液；所用測(cè)試的樣品液，為用試劑盒提供的緩沖液二倍稀釋法配置的1、0.5、 0. 25,0. 125當(dāng)量梯度樣品溶液；所用Trolox標(biāo)準(zhǔn)品液，為用試劑盒提供的緩沖液稀釋配置成的0、2、4、8、12、16 μ M標(biāo)準(zhǔn)品梯度溶液；所用熒光素鈉試劑，為用試劑盒提供的緩沖液稀釋成的0. 4 μ M反應(yīng)液；所用空白對(duì)照，為試劑盒提供的磷酸緩沖液。100 μ L樣品與50 μ L熒光素鈉混合均勻，反應(yīng)溫度控制在37°C，反應(yīng)時(shí)間控制在 15分鐘；加入50 μ L的AAPH溶液需快速準(zhǔn)確，宜用八道或十二道的多孔道移液器加樣，整個(gè)反應(yīng)體系200 μ L在黑底的96孔板內(nèi)進(jìn)行；熒光強(qiáng)度由熒光微孔板分析儀讀取，在加入 AAPH溶液后立即測(cè)定，熒光檢測(cè)范圍為激發(fā)波長(zhǎng)485nm、發(fā)射波長(zhǎng)538nm，測(cè)定溫度控制在 37°C，測(cè)定時(shí)間持續(xù)100分鐘，依次測(cè)定每個(gè)加樣微孔，隔一分鐘測(cè)定一次。實(shí)驗(yàn)所得的各微孔反應(yīng)的熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)通過軟件輸出到Excel中進(jìn)一步處理，采用積分法或用統(tǒng)計(jì)軟件GraphPad Prism計(jì)算熒光衰退曲線下面積AUC，小漿果樣品作用下的熒光衰退曲線下面積(AUC#S)與無小漿果樣品存在時(shí)自由基作用的熒光自然衰退曲線下面積(AUCse)之差netAUC，即小漿果樣品的抗氧化保護(hù)面積；氧自由基清除能力ORAC 值，即總抗氧化能力指數(shù)，由樣品梯度濃度-netAUC曲線與Trolox標(biāo)準(zhǔn)品梯度濃度-netAUC 曲線的斜率比得出，ORAC值以 ο οχ當(dāng)量表達(dá)，ymol Trolox/mg小漿果樣品。有益效果本發(fā)明提供的一種適用于小漿果總抗氧化能力測(cè)定的ORAC檢測(cè)試劑盒，所用的ORAC分析方法是測(cè)試全套總抗氧化能力的高效快速方法，根據(jù)自由基破壞熒光探針，使熒光強(qiáng)度產(chǎn)生變化原理，以偶氮類化合物AAPH為自由基來源，采用抗氧化劑作用下的熒光衰退曲線下面積與熒光自然衰退曲線下面積的差，作為衡量抗氧化劑的抗氧化能力指標(biāo)，結(jié)果以抗氧化劑維生素E水溶性類似物Trolox為定量標(biāo)準(zhǔn)，使用熒光微孔板分析儀進(jìn)行分析。小漿果ORAC檢測(cè)試劑盒可針對(duì)親水過氧基、親脂過氧基、氫氧基、過氧亞硝基和單線態(tài)氧五種自由基進(jìn)行分析，提供小漿果的全套總抗氧化能力測(cè)試，解決了動(dòng)力學(xué)滯后時(shí)間測(cè)量問題，保證結(jié)果的穩(wěn)定準(zhǔn)確，可重復(fù)性強(qiáng)，并且可以大大減少測(cè)定所用樣品量， 使用微孔板測(cè)定實(shí)現(xiàn)高通量的衡量檢測(cè)。本發(fā)明使用國(guó)際通用的ORAC值來評(píng)價(jià)小漿果的總抗氧化能力，便于推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明實(shí)施例1稱取新鮮草莓5. 062克，加入80%甲醇溶液，于下震蕩提取M小時(shí)，即為樣品液。吸取樣品液5微升用磷酸緩沖液稀釋到1毫升，即200倍稀釋液。按二倍稀釋法分別稀釋成400、800、1600倍稀釋液。在96孔微孔板上先加入100微升樣品液(200、400、800、 1600倍稀釋液)，再用十二道的多孔道移液器加入50微升0. 4微摩爾每升的熒光素鈉試劑混合，37。C反應(yīng)15分鐘后，用十二道的多孔道移液器加入50微升60毫摩爾每升的AAPH溶液，用熒光微孔板分析儀立即測(cè)定熒光強(qiáng)度。Trolox標(biāo)準(zhǔn)品液的處理步驟同上，不同的是標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋濃度分別為0、2、4、8、12、16微摩爾每升。實(shí)施例2稱取新鮮藍(lán)莓5. 113克，加入70%乙醇溶液，于下震蕩提取M小時(shí)，制得樣品液。吸取樣品液5微升用磷酸緩沖液稀釋到1毫升，即200倍稀釋液。再按二倍稀釋法稀釋成400、800、1600、3200、6400倍稀釋液。選用800,1600,3200,6400倍稀釋液為加樣液， 在96孔微孔板上分別加入100微升樣品液，再用十二道的多孔道移液器加入50微升熒光素鈉試劑混合，37°C反應(yīng)15分鐘后，用十二道的多孔道移液器加入50微升AAPH溶液，立即測(cè)定熒光強(qiáng)度。Trolox標(biāo)準(zhǔn)品液的處理步驟同上，不同的是標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋濃度分別為0、2、 4、8、12、16微摩爾每升。
權(quán)利要求
1.一種適用于小漿果總抗氧化能力測(cè)定的ORAC檢測(cè)試劑盒，由以下成分組成DTrolox 存儲(chǔ)液 40mM2)熒光素鈉存儲(chǔ)液40μ M3)AAPH 溶液60mM4)pH7.4磷酸緩沖液75mM5)熒光微孔反應(yīng)板黑底96孔板6)包裝盒一個(gè)塑料或硬紙等材料做成的盒子
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種小漿果ORAC檢測(cè)試劑盒，其特征在于所用抗氧化標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為 Trolox (6-hydroxy-2, 5, 7,8-tetramethyIchromate-2-carboxylie acid, 6- ^5 ~2, 5，7，8-四甲基鉻酸鹽-2-羧酸)，一種抗氧化劑維生素E水溶性類似物，存儲(chǔ)濃度為40mM。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種小漿果ORAC檢測(cè)試劑盒，其特征在于所用熒光物質(zhì)為熒光素鈉(Fluorescein disodium，disodium 2_ (3-oxo-6-oxidoxanthen_9-yl) benzoate，水合熒光胺二鈉鹽)，存儲(chǔ)濃度為40 μ M，棕色瓶避光保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種小漿果ORAC檢測(cè)試劑盒，其特征在于所用自由基產(chǎn)生劑為 AAPH(2,2' -azobis (2-methylpropionamide) -dihydrochloride, 2,2' _ 偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽)，一種偶氮類化合物，濃度為60mM。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種小漿果ORAC檢測(cè)試劑盒，其特征在于所用緩沖液為75mM 的PH7. 4磷酸緩沖液，所有存儲(chǔ)試劑與樣品的稀釋均用此緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種小漿果ORAC檢測(cè)試劑盒，其特征在于反應(yīng)在熒光微孔板，即黑底96孔板中進(jìn)行，以熒光微孔板分析儀讀取數(shù)據(jù)，分析結(jié)果。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種小漿果ORAC檢測(cè)試劑盒，其特征在于所用包裝盒為一個(gè)塑料或硬紙等材料做成的盒子，整個(gè)小漿果ORAC檢測(cè)試劑盒2-8 °C保存。
8.一種小漿果總抗氧化能力ORAC檢測(cè)方法，包括了以下步驟1)小漿果樣品前處理小漿果樣品采用醇提取法處理，提取液用試劑盒提供的緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)得到樣品液。2)用試劑盒的試劑進(jìn)行檢測(cè)將樣品液或Trolox標(biāo)準(zhǔn)品液與熒光素鈉試劑混合，37°C 反應(yīng)15分鐘后，加入AAPH溶液，立即測(cè)定熒光強(qiáng)度。3)分析檢測(cè)結(jié)果采用抗氧化樣品作用下的熒光衰退曲線下面積與熒光自然衰退曲線下面積的差，作為衡量抗氧化樣品的抗氧化能力指標(biāo)，以Trolox為定量標(biāo)準(zhǔn)，從而測(cè)算出小漿果總抗氧化能力大小。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述小漿果總抗氧化能力ORAC檢測(cè)方法，其特征在于所用小漿果樣品的醇提取液，為準(zhǔn)確稱量的5克小漿果樣品，加入50毫升的80%甲醇(或70%乙醇)， 勻漿機(jī)攪勻，37°C搖床120rpm提取M小時(shí)，3000rpm離心過濾，4°C保存的提取液；所用測(cè)試的樣品液，為用試劑盒提供的緩沖液二倍稀釋法配置的1、0.5、0. 25,0. 125當(dāng)量梯度樣品溶液；所用 ο οχ標(biāo)準(zhǔn)品液，為用試劑盒提供的緩沖液稀釋配置成的0、2、4、8、12、16 μ M 標(biāo)準(zhǔn)品梯度溶液；所用熒光素鈉試劑，為用試劑盒提供的緩沖液稀釋成的0. 4 μ M反應(yīng)液； 所用空白對(duì)照，為試劑盒提供的磷酸緩沖液。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述小漿果總抗氧化能力ORAC檢測(cè)方法，其特征在于100yL樣品與50 μ L熒光素鈉混合均勻，反應(yīng)溫度控制在37°C，反應(yīng)時(shí)間控制在15分鐘；加入50 μ L的AAPH溶液需快速準(zhǔn)確，宜用八道或十二道的多孔道移液器加樣，整個(gè)反應(yīng)體系200 μ L在黑底的96孔板內(nèi)進(jìn)行；熒光強(qiáng)度由熒光微孔板分析儀讀取，在加入AAPH溶液后立即測(cè)定， 熒光檢測(cè)范圍為激發(fā)波長(zhǎng)485nm、發(fā)射波長(zhǎng)538nm，測(cè)定溫度控制在37°C，測(cè)定時(shí)間持續(xù)100 分鐘，依次測(cè)定每個(gè)加樣微孔，隔一分鐘測(cè)定一次。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述小漿果總抗氧化能力ORAC檢測(cè)方法，其特征在于熒光微孔反應(yīng)板加樣如圖所示123456789101112A標(biāo)0標(biāo)0樣Al樣Al樣AlB標(biāo)2標(biāo)2樣 A0. 5樣 A0. 5樣 A0. 5C標(biāo)4標(biāo)4樣 AO. 25樣 A0. 25樣 AO. 25D標(biāo)8標(biāo)8樣 AO. 125樣 AO. 125樣 AO. 125E標(biāo)12標(biāo)12樣Bl樣Bl樣BlF標(biāo)16標(biāo)16樣 B0. 5樣 B0. 5樣 B0. 5G空白1空白1樣 B0. 25樣 B0. 25樣 B0. 25H空白2空白2樣 B0. 125樣 B0. 125樣 B0. 125第1、2列A-F為0、2、4、8、12、16μΜΤι·Ο1ΟΧ的標(biāo)準(zhǔn)品梯度溶液，做兩次重復(fù)；第1、2列G為空白l，100yL樣品液由100 μ L磷酸緩沖液替代，做兩次重復(fù)； 第1、2列H為空白2，100 μ L樣品液和50 μ L的AAPH溶液都由磷酸緩沖液替代，做兩次重復(fù)；第3-5列A-D為樣品A的二倍稀釋梯度溶液，例如200、400、800、1600倍稀釋的草莓提取液，一般做三次重復(fù)；第3-5列E-F為樣品B的二倍稀釋梯度溶液，一般做三次重復(fù)； 第6-12列可依法加入其它樣品梯度溶液。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述小漿果總抗氧化能力ORAC檢測(cè)方法，其特征在于實(shí)驗(yàn)所得的各微孔反應(yīng)的熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)通過軟件輸出到Excel中進(jìn)一步處理，采用積分法或用統(tǒng)計(jì)軟件GraphPad Prism計(jì)算熒光衰退曲線下面積AUC，小漿果樣品作用下的熒光衰退曲線下面積(AUC#S)與無小漿果樣品存在時(shí)自由基作用的熒光自然衰退曲線下面積(AUCse)之差netAUC，即小漿果樣品的抗氧化保護(hù)面積；氧自由基清除能力ORAC值，即總抗氧化能力指數(shù)，由樣品梯度濃度-netAUC曲線與Trolox標(biāo)準(zhǔn)品梯度濃度-netAUC曲線的斜率比得出，ORAC值以Trolox當(dāng)量表達(dá)，μ mol Trolox/mg小漿果樣品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測(cè)定小漿果總抗氧化能力的方法，提供了一種適用于小漿果總抗氧化能力測(cè)定的ORAC檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于活性檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。該試劑盒包括抗氧化標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)Trolox存儲(chǔ)試劑、熒光物質(zhì)熒光素鈉存儲(chǔ)試劑、自由基產(chǎn)生劑AAPH試劑、磷酸緩沖液、及熒光微孔反應(yīng)板，由一個(gè)塑料或硬紙等材料做成的盒子包裝在一起組成。小漿果總抗氧化能力ORAC檢測(cè)方法，包括了以下步驟小漿果樣品前處理；用試劑盒的試劑進(jìn)行檢測(cè)；分析檢測(cè)結(jié)果。通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使用熒光微孔板分析儀檢測(cè)配合物熒光強(qiáng)度的變化，從而測(cè)算出小漿果總抗氧化能力大小。采用本發(fā)明可以提供小漿果全套總抗氧化能力測(cè)試，且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102269702SQ20111011432
公開日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2011年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月5日
發(fā)明者劉文旭, 李春陽, 王乃富, 閆征, 黃午陽 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院