一種草莓反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因及轉(zhuǎn)錄特性的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因，特別是涉及來源于草莓的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因及轉(zhuǎn)錄活性的分析。
【背景技術(shù)】
[0002]草莓是多年生常綠草本植物，在植物分類學(xué)上屬于薔薇科(Rosaceae)草莓屬(Fragaria)，是經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的小漿果，近年來國內(nèi)草莓栽培生產(chǎn)發(fā)展很快，目前中國草莓面積和產(chǎn)量均居世界第一。草莓屬于多年生草本植物，生產(chǎn)上采用無性繁殖。長期的無性繁殖導(dǎo)致草莓主栽品種產(chǎn)生和積累了較多的無性系變異。雖然科研人員能夠從草莓的無性系變異植株中選育出芽變品種(如從‘全明星’中選育出了‘新明星’，從‘女峰’中選育出了‘鬼怒甘’)，但是變異也導(dǎo)致草莓品種退化。優(yōu)良種苗是草莓優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)的基礎(chǔ)，草莓微繁殖苗在田間繁殖的匍匐莖苗比普通匍匐莖苗增產(chǎn)、果大、品質(zhì)好，所以在生產(chǎn)上被廣泛應(yīng)用。但是隨著草莓微繁殖苗在生產(chǎn)上的大量應(yīng)用，組織培養(yǎng)導(dǎo)致的體細(xì)胞無性系變異問題也越來越引起人們的關(guān)注。
[0003]盡管草莓組織培養(yǎng)已經(jīng)有30余年的歷史了，但是仍存在一些懸而未決的問題。Kinet和Parmentier發(fā)現(xiàn)草莓品種‘戈雷拉’的微繁殖苗出現(xiàn)“超花”(Hyper-flower)現(xiàn)象，即多花、畸形、小果，這種現(xiàn)象可以通過匍匐莖繁殖傳給子代。但至今對于“超花”現(xiàn)象沒有合理的解釋。常規(guī)的草莓微繁殖采用腋芽萌發(fā)的增殖途徑，不經(jīng)過愈傷組織階段，理論上產(chǎn)生遺傳變異的機(jī)率很低。但是隨著繼代次數(shù)的增加，產(chǎn)生變異的機(jī)率也可能增加。組織培養(yǎng)操作和(或)不正常的細(xì)胞分裂可能會(huì)激活反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件的轉(zhuǎn)座，而SA、ABA、MeJA、H202、乙稀等多種與脅迫相關(guān)的信號(hào)分子能夠刺激Tyl-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件的轉(zhuǎn)錄活性。因此，隨著草莓微繁殖苗繼代次數(shù)的增加，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件可能會(huì)被激活。目前，草莓離體再生植株技術(shù)(主要是葉片和花藥離體再生植株技術(shù))已比較成熟，草莓離體再生容易產(chǎn)生變異植株，如北京市農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)果樹研究所從草莓花藥培養(yǎng)植株后代中選育出‘寶花’、‘春選’等草莓新品種。草莓離體再生過程中產(chǎn)生的體細(xì)胞無性系變異是否與反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座有關(guān)，這也有待于探索。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種新的草莓反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因及轉(zhuǎn)錄特性分析。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:提供的草莓反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因，來自于栽培草莓‘全明星’，名稱為FaREII，是如下基因:
(I)基因全長5386 bp，以gag和pol基因排列，其中pol基因中包含GAG、PR、IN、RT和RH基因的特征基序，基因兩端包含有393 bp的長末端重復(fù)序列。
[0006](2)對本發(fā)明FaREII基因的進(jìn)一步研究表明，該基因在激素脅迫下具有轉(zhuǎn)錄活性?！靖綀D說明】
[0007]圖1:染色體步移技術(shù)獲得FaREII基因全長。
[0008]圖2:FaREII基因結(jié)構(gòu)。
[0009]圖3: FaREII基因聚類圖。
[0010]圖4: pol基因的特征基序。
[0011]圖5:NothernBlot雜交圖。
【具體實(shí)施方式】
[0012]以下實(shí)施例中所述的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0013]實(shí)施例1:獲得FaREII基因全長。
[0014]前期我們根據(jù)其它植物中反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT基因的保守基序設(shè)計(jì)簡并引物，利用PCR和RT-PCR技術(shù)，從草莓栽培品種‘全明星’中克隆到二個(gè)RT基因，通過染色體步移技術(shù)獲得了一個(gè)Tyl-copia組反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子FaRE I，并已在NCBI上公布，Genbank登錄號(hào)為FJ871121。為了系統(tǒng)地研究反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與草莓離體再生過程中產(chǎn)生的體細(xì)胞無性系變異的關(guān)系，我們對別一個(gè)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的全序列也進(jìn)行了研究。根據(jù)GenomeWa IkerUniversal Kit(Clontech)原理和方法進(jìn)行染色體步移，將高質(zhì)量草莓基因組DNA用4種限制性內(nèi)切酶Dra I，Stu I，EcoR V,Pvu II進(jìn)行酶切，基于草莓反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT基因序列，將酶切產(chǎn)物加上接頭構(gòu)建了4個(gè)用于步移的基因組文庫。分別以Dra 1、Stu 1.EcoR V和PvuII 4種文庫為模板，以接頭引物APl和RT基因序列的外側(cè)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件下游染色體步移的第一步的第一輪PCR;以稀釋500倍的第一輪PCR產(chǎn)物為模板，用接頭巢式引物AP2和RT基因序列的巢式引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，結(jié)果不同文庫之間擴(kuò)增產(chǎn)物的有無，片段大小以及產(chǎn)物的多少差別較大，選擇條帶清晰，片段較大的回收、連接、轉(zhuǎn)化，菌落PCR鑒定陽性克隆后，穿刺菌測序。
[0015]基因全序列的獲得經(jīng)過了3步Y(jié)上游步移，特異片段分別為1478、2058和2612 bp,I步3'下游步移，得到特異片段為2190 bP<34步步移拼接后得到最長片段7199 bp。在此區(qū)間包含了兩個(gè)完整的LTRs序列，分別以TG起始CA結(jié)束，因此獲得了一條完整的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件的全長序列，長度為5386 bp，命名為FaREII (Fragaria X ananassaretrotransposon)如圖1所示。
[0016]實(shí)施例2= FaREII反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列分析。
[0017]對獲得的FaRE11反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，通過同源搜索和多重比對進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)解析和特征序列查詢，發(fā)現(xiàn)FaREII序列具有典型的Tyl-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件的基因結(jié)構(gòu)特征，序列的兩端是正向重復(fù)LTR序列，緊鄰5'端LTR序列的是PBS位點(diǎn)，在3'端LTR上游是PPT位點(diǎn)，PBS和PPT位點(diǎn)之間是GAG-POL編碼區(qū)，編碼的蛋白按GAG-PR-1NT-RT-RNaseH順序排列，是典型的Tyl-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因結(jié)構(gòu)(圖2)。通過FaREII與其它Tyl-copia類和Ty3_gypsy類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件的聚類分析來看(圖3)，F(xiàn)aREII也聚到了Tyl-copia類，再次說明FaREII是Tyl-copia類的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。
[0018]實(shí)施例3:pol基因的特征基序分析。
[0019]植物反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的pol基因不僅是反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的基本結(jié)構(gòu)域，而且現(xiàn)有的研究表明大多數(shù)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件的pol基因都有自己的保守基序，保守基序的變異能反映反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的親緣進(jìn)化關(guān)系。在GAG區(qū)域含有C-C-H-C核酸結(jié)合域的保守序列，也包含PR區(qū)域的D(T/S)G特征序列；在INT區(qū)域，具有鋅指結(jié)構(gòu)域的H-H-C-C基序;在RT區(qū)域含有基序YVDDML; RNaseH區(qū)域的基序I (KHI (F)D(E))和基序Π (A(S)DX2TK)13這些保守的基序在FaREII的pol基因中都存在(圖4)。
[0020]實(shí)施例4 = FaREII反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄活性分析。
[0021 ] 在FaRE II反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件RT區(qū)域設(shè)計(jì)特異引物，采取NAA、2，4_D、ABA激素處理的方式，進(jìn)行RT-PCR，用擴(kuò)增片段的回收產(chǎn)物標(biāo)記探針，進(jìn)行Northern雜交，結(jié)果表明，在三種激素處理的脅迫條件下都獲得了雜交信號(hào)(圖5 )，充分說明FaRE11反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在NAA、2，4-D、ABA三種激素處理的脅迫條件下具有轉(zhuǎn)錄活性。
[0022]
FaREII全基因序列如下
TGAGACAGAAAACTTAGAGAGTCAAGAGTGATAGAGAGATAAGAGATCTTAAGCAGGGAGTATTCTTGGGGAT
TAAATATTCATAGGGATTTCAATAAGTACTTGTAATCAAGTTGTTATTCTCCATAGTGCTAGTGATTCTCTCAAGAG
AGATCACAAAGTGGACGTAGACTAATTATAGCTGAACCACTATAATTCCGCTATGTTTGTTTCTATGCTCATTTTGC
TTATATCGTAAAGTCTGAGTAAAGATCCTAGGGACTTAACCACTATAGTTGGCTCTTCGACAATTTCCTGTTTTCGT
TTTAGAATTTGAGTTGTTTCTGTTTGAGACGTGTTAGGACTTAGGACTTGTTAAATGTTCATAATGTGTTATGAAAT
GAAAAGAATTCA
GGTATCACTAAGTGGACGTAGGTCAAAGTTAGACCGAACCACTATAAAACTGCTGTGTGTTTTTTCTGTTTTC
TGCATTCATCTTATATTGTTGTGCATATTGCTAAGTCCTAAGTAAAGATCTTAAAGGCGCTTACCACAATAAG
TGGTATCAGAGCCTGGTT
TAGGGTTTTCGCAATGGCAAACAGCAAGGAAGGAGTTGAAAACGTGA
GACTGTCTATCAAGCAATTTAATGGCAAGGACAACTTCACGTTTTGGCAGAGGAAGATGAAGAACATCCCGAT
CCAGCAGAAAGTTCATGTAGCCTTAAAAGAAAAGCCTACAACCATGAAGGATGAGGATTGGGAGGAGAAGTGTGAGA
TAGCAAAGAGCTCCATTGAGCTACATCTAGCGGATAATGTCCTACTTCACATCGGAGAGAAGATGACAGCAAAGGAG
GAATGGGACAAGCTAGAAAGCACCTATATGGGTAAAACCATTAGCAACAAGTTGCTCTTGAAGGAACAGCTCTTTAG
TCTCAAGATGGAGGAAGGGAGATGATCTTCATGATCATATATCCAAGTTTTCAGAACTGTATAATAAACTTGGAGAA
GGGTTGGATCAAAGATGGGATGATGAAGACACAGCTATGATGCTATTACAGTCGCTGCCACCATCATTCAAGCACTT
CAAAACCACCATGATATTCAACAATGAGACCATCACACTTGCCAAAGTGTGTGAAAATCTGGAACAGTATGTCAAGA
TGCAGAGAGAAGAAGATAACTCTCAACCAAGAGGACTTTATGTCAAAGGCAAGGAGAGAGGAAGGTCTAAGAGTAGA
GGTGGATTTGAAGAAAGTGGCAGGTCTAAATCCAAGGGAAAAGGCAAGGAAAAGAAGAATGGTT
GCTTCGTGTGTGGTTCACCAGACCACTGGAAAAGAAACTGCAAACAATGGAAGGAGAAGAAGACGCAG
ATGCTTGGAGAACACTCTCAGTCAGCCAATGTCGTTATTGGAGATAATAGCGATGATGGAGAGCTTCTCGCAA
TCTCAACCAGCTCCGGCACGCCTAGACATTGGACCTTGG
ACACGGCCTGCACATTCCATGTGTGTGCA
CACAGAGATCGGTTCGACACATATGAGGAGAGGGACACCGGATCAGTTTTGATGGGGAACGATTCGCCAAGCA
GAATCATGGGAATCGGCACAGTAAAGATCACCATGTATGATGGAGTTGTCAGAACATTGGGAAGGGTCAGACATGTT
CCACACTTGAGCAGAAATCTGATTTCTCTAAGTCTGTTGGATAGAGAAGGATTGTGGCATAAAGGTAACAACGGAAT
GCTCAAGGTTGGAAAGGGTCAGCTGGTCTACATGAAGGGTGTATTGCAACTAGATAACATGTATAAACTTACGGGTT
CTACAGTAGTAGGTGGAGCAGCAGTTTGTACAGAAGAAGACAAGACTGA
GCTTTGGCACAAAAGGCTGGGACACATGAGTCAAAGAGGGCTGCAAGAATTACACAAGAAGAATCAGCTGGAA y
XVVVV0VV30V3XXV00VVXXVVV00XXXV0XVXV0XX03X300XXXX0X0XX0XXV0V00X00VV33V33X3VV3X
VX00XXXV3XVV30V30V000VV0X33XVXV0VV3XXV0VV0VV3XX3VXX000V3XX0XXXX00V0VXX3XX00VV
0X00VV330XX3X0V0VV0VV300VVXX030X00V0XX3V3X33X33V30V00X00X0XX0V0X30XX30V3V
3X0X0V3X30XX3V00XX30XXV30
VVXXX0VV0V0V30X3XXX03330VV33VVXXX0XXV0V30V30XVV3V0XVVV3V3V3XX00VV0V00X00XXV3X
VXV0V00X30VV0VX000XXV0V0V3XVV0V3V3XVX303XX0XV0XXV3V30VV03VV0VV30XV3XXX0X00V3X
VV0VVV300XX3V3XXV330X0VVV330V3V0X0X0VV0X0VX00X0300VV0VV33V3XXV000XXX0V3X0VV30
0X3000XVV0XX00XXXVX300V00VVV3XX300V003VVXXV300XVXVX0V0V300V0V3VX3VX3XVX3X30V3
V3X0V30VV3XX3X3V0300VV00X30V0X0X33V00V00V00X0X33V3XXXX0XVXX00V3VV3V33X00V00VV
VVXV0VXX3V0V00V30XXXXV0X3X3V0VX0XXXX00X30XX0X0XV30VVVV000V3VVVV0V0V0XXX0XVXXV
V00XX30V30VVX3V00V0VV0XX3VX00VVXXXXV00X0VVVX0V30VV000XXV33V3VVVX00033XVVV3X0X
VXVX0VV33X3X03X030V0XXV30VV3X30VXXXV0V33V0VV3V30XVXV0XVV30XVX0XV3X3X0X000VX0V
30X0VV3VXVXV33XX0XVV0VV0XV0X0XV0XXVVV0VVV0V3XVVV3XV3300VVV30V3V30X0V0XX0VVXXX
3V3V30X30VXXV3333VX3XXX0XXX0VV330V00XV00XV3VV3XX303VV0XX3VX00VV0XV3XV3VX0VVVV
0VV3V3X0X300XVXVVVVV00VV030VV0VXV000V0VVVXVVV0XXV000XX33VV0VV0V3V30X30V00VXXX
V00VV0XV3V03XXVV0X30V00VXX0VV0VV0VVXX3VV0VV3XXVVVV00X0XV0V000V30XV30XXVVX30XV
3V0XV0VX0XVX0XXXX3VX3VX3XXV3XXVV0000XV0VV03XXVX0XV33VX3VX3X0X0X30X3V0XVXVX3X0
XV0VV3V3VX300VXVVVV0X30XV3VXV3V3V03XXX030VVXVX00X0V300VV3303XVV30VVXX3V00XVXV
XXX3X0VV0VVVXXV03X0XXX0VX3XVVVV0VVV000V3VVV0XX0XXXX000V0V330V303X0XVXVXXXV3V0
VV0VV03X33V0000XV3XX3XXX030X3V0VVVX0XV00XV0V3VV0XXV0V00XVXV0XVX0V3330V300XVX3
X0XV0XXVXX00VVXVV3XX3V3V3VVV3X03X0033X3X3XXXXV0V03V0XVX3V00X0V00VV0VVV0V303XX
VX0000VVV300X0VXXX03V30VVV3VX0VVVXVX30XV0XV0XV0XV3VXVV00VV0VVV0VV00VXXX0X000X
0VV30X300XX0XX3VVVV0VVV0VVV333VVVX33XX0VXXVV000X0X033XXV00VVXV30XXX3XVV00
XV0V0VV0X300XVX30X00XXV00XX00VV000VVV0V3030VVV0VXVX30VV0VV0XVXX3VX3VV3
3XV0VV0VV3X0VVXV33V0X3X30VV3X0V0X0VV0VV0VV0V33VV03XXV00XVX0030V3VXV0VVV0VV33X
VV00V0VVV33VVV3V0XX3V30VXV3X0V0VV0VVX0V330V0XX3V30VV3V333VV333X33XVV0V3X0000V
VV3V3333X0V30V00X00V3X3000VXX0V33V3X0V3VV30V30V30V0V33VV00V0XXVX30VX00V3XV0XV
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V0VV0VV0XV0XX0X3V03V0VV0V00VV0VVX0VXVVX30VV00VV3VV0XXV330XVX3V0VV0V0XV03XXXX0
XX0XV0V0V30V3XV0X00VVVVV0V0XVV3X0VXVXV000XVXXVVVXVXX00VVV3X0V00VVV0V3XXX3003X
VXXX0X030XVV0XX3V3X0VVV33VV00X30VV33VV0VVV0XV00VV333XXVXV3V30XVXX30X0V30X300X
XX0X0V0VVXX3VVX3XXVXXV0XX0X33VVVV00X3X00XVX00V00V0V30X0X0VV0XX3VVXXVX300VVV3X
X33V3XV03XVVXX00XXXXXX0XV30XV33VVXX303XVV0V3000XXXX0V0VV0X330X3000V30XVVXXXV0
V0XV30VV0VVV0VVV3V00XX3X3X3VV0V3VV0XVV0V0V0V303X0X003VVVV3VV30X3X3V0VV0VVXXVX
3VXXX3V3V0VV3V3XV300VV0XV00VV30X0X30V3VX33XX003XVVXV000V3VXV0X00V00XVV3V030VV
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【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種草莓反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因，其特征在于:如序列表所示，該基因命名為FaREII，DNA序列全長5386 bp，具有Tyl-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因特征序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種草莓反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因，其特征在于:所述Tyl-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因特征序列，以gag和pol基因排列。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種草莓反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因，其特征在于:所述的pol基因中包含GAG、PR、IN、RT和RH基因的特征基序，如圖4所示。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種草莓反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因，其特征在于:所述Tyl-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因特征序列，基因兩端包含393 bp的長末端重復(fù)序列。5.權(quán)利要求1所述草莓反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因在激素協(xié)迫下具有轉(zhuǎn)錄活性。6.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種草莓反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因，其特征在于:所述激素為NAA、2，4-D、ABA中的一種。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種草莓反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因序列及其轉(zhuǎn)錄特性分析結(jié)果。該基因DNA序列全長5386 bp，命名為<i>FaRE</i>II，具有Ty1-<i>copia</i>反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因特征序列，以<i>gag </i>和 <i>pol</i>基因排列，其中 <i>pol</i><i></i>基因中包含GAG、 PR、IN、RT和RH基因的特征基序，393 bp 的長末端重復(fù)序列位于基因兩端，是典型的Ty1-<i>copia</i>反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。通過Nothern Blot發(fā)現(xiàn)<i>FaRE</i>II在激素脅迫下發(fā)生轉(zhuǎn)錄。
【IPC分類】C12N15/11
【公開號(hào)】CN105713904
【申請?zhí)枴緾N201410555572
【發(fā)明人】何平, 李林光, 李慧峰, 王海波
【申請人】山東省果樹研究所