專利名稱：一種人類免疫缺陷病毒p24抗原酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明書(shū)屬生物制劑技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及ー種人類免疫缺陷病毒P24抗原酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒及制備方法。
背景技術(shù)：
HIV病毒的診斷對(duì)于HIV病毒的防治具有重要的作用，目前許多國(guó)家均采用測(cè)定病毒RNA的方法來(lái)縮短檢測(cè)窗ロ期，病毒RNA的檢測(cè)窗ロ期短，且在HIV感染的各階段均存在，因此這種方法也常被應(yīng)用于監(jiān)測(cè)病程進(jìn)展和判斷抗病毒治療效果。RNA測(cè)定法較P24檢測(cè)法成熟、靈敏度高，但因其操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、花費(fèi)高，且需要特殊昂貴的儀器，因此，在許多發(fā)展中國(guó)家中難以推廣應(yīng)用，有礙疾病的治療和控制。2004年，HIV病毒發(fā)現(xiàn)者之一、美國(guó)馬里蘭大學(xué)Dr. Gallo領(lǐng)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)室的ー篇高 靈敏度檢測(cè)P24抗原的研究論文引起了廣泛的關(guān)注P24抗原檢測(cè)方法的靈敏度得到了大幅提高。隨著其檢測(cè)靈敏度的不斷提高，P24抗原的檢測(cè)逐漸從主要用于在窗ロ期輔助早期診斷和進(jìn)ー步縮短窗ロ期，發(fā)展到用于病毒載量的測(cè)定。目前，P24抗原在以下幾方面都有重要應(yīng)用抗HIV-I不確定或“窗ロ期”的輔助診斷；抗111￥-1陽(yáng)性母親所生嬰兒早期的輔助鑒別診斷；第4代HIV-I抗原/抗體ELISA試劑檢測(cè)呈陽(yáng)性反應(yīng)，但抗HIV-I確認(rèn)陰性者的輔助診斷；監(jiān)測(cè)病程進(jìn)展和抗病毒治療效果。隨著P24抗原檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步，低成本的P24抗原檢測(cè)有望在一定程度上替代現(xiàn)有的昂貴的RNA測(cè)定法。但是目前普遍使用雙抗體夾心法檢測(cè)人類免疫缺陷病毒P24抗原，具有很好的特異性，但是單純利用物理吸附把單克隆抗體或者多克隆抗體吸附在酶標(biāo)板上會(huì)存在單抗使用量大，活性損失大，特別是批間精密度差等缺點(diǎn)，而將親和素包被在板上，再加入生物素化的抗體，則可以很好的解決這ー問(wèn)題，其不但可以減少批間差，而且可以在檢測(cè)過(guò)程中可ー步直接加入樣品血清和酶標(biāo)記抗體進(jìn)行反應(yīng)，形成固相親和素-生物素化抗體-人類免疫缺陷病毒P24抗原-酶標(biāo)抗P24抗原抗體復(fù)合物，然后加入底物緩沖液甲和こ進(jìn)行反應(yīng)，就可以定量或者定性分析血清中的人類免疫缺陷病毒P24抗原。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于解決傳統(tǒng)酶標(biāo)板批間差不足的問(wèn)題，設(shè)計(jì)并建立了 P24抗原的檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明提供了 “ー種人類免疫缺陷病毒P24抗原酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒”，該試劑盒是包括親和素預(yù)先包被后加入生物素化抗人類免疫缺陷病毒P24抗體的酶標(biāo)板包被反應(yīng)條、酶標(biāo)記抗P24抗原抗體、陽(yáng)性對(duì)照液一支、陰性對(duì)照液一支、20倍濃洗滌液I瓶、底物緩沖液甲I瓶、底物緩沖液こI瓶及終止液I瓶組成。I.抗體制備(I)利用P24抗原基因片段通過(guò)原核表達(dá)或者真核表達(dá)制備抗原；(2)制備抗體的制備和純化
用上述重組抗原免疫豚鼠、兔子或者羊，得抗P24抗血清或免疫Balb/C小鼠得陽(yáng)性鼠脾細(xì)胞與骨髄瘤細(xì)胞融合成雜交瘤細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆建株，得腹水；抗血清或腹水用鹽析、離子交換層析、或者親和層析法進(jìn)行純化，得純抗P24抗體，其純度95%以上。(3)用親和素預(yù)先包被酶標(biāo)板，并加入生物素標(biāo)記的抗人類免疫缺陷病毒P24抗體進(jìn)行二次包被反應(yīng)，制成抗體預(yù)包被反應(yīng)條48-96孔；(4)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)與純化的抗人類免疫缺陷病毒P24抗體酶聯(lián)，制成酶標(biāo)抗體；(5)配制陽(yáng)性對(duì)照液、陰性對(duì)照液；(6)配制20倍濃縮洗液；(7)配制底物緩沖液甲； (8)配制底物緩沖液こ；(9)配制終止液。(10)分裝上述試劑盒除預(yù)報(bào)被板其余七種成分，按需要分裝在小瓶或尖底離心管中；(11)檢定試劑盒的特異性、靈敏度、精密性、穩(wěn)定性合格；(12)組裝成成品。2、本發(fā)明的試劑盒在使用時(shí)可以如下操作(I)取出已包被條孔或板，恢復(fù)至室溫。(2)配液將濃縮洗滌液(20X)用蒸餾水或去離子水稀釋備用(20倍濃洗滌液lml+19ml蒸餾水即為工作液)。(3)加樣每孔加待檢血清50ul，各板設(shè)陽(yáng)性對(duì)照一孔(50ul)，陰性對(duì)照一孔(50ul)，空白對(duì)照一孔(加蒸餾水50ul)，然后除空白對(duì)照孔外，各孔加酶標(biāo)記液50ul，(4)溫育用封板膜封板后置37°C溫育30分鐘。(5)洗滌小心揭掉封板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液充分洗滌5遍，扣干。(6)每孔加入顯色液A、B各I滴(50ul)，輕輕振蕩混勻，37°C避光顯色15分鐘(7)測(cè)定OD值每孔加終止液I滴(50ul)，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶免分析儀波長(zhǎng)于450nm處(建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè))，測(cè)定各孔OD值。(8)結(jié)果判定陰性對(duì)照(A值)*2. 5 =臨界值(cut off值)，陰性對(duì)照高于0. 05時(shí)按實(shí)際OD值算，陰性對(duì)照小于0. 05按0. 05計(jì)算，凡待檢標(biāo)本孔A值大于臨界值即為陽(yáng)性。本發(fā)明的試劑盒能非常專一地檢測(cè)患者血清中P24蛋白的濃度。它具有簡(jiǎn)便、靈敏和穩(wěn)定等特點(diǎn)。且本試劑盒操作簡(jiǎn)便快速，比PCR檢測(cè)法省時(shí)(PCR法最快需要6-8小時(shí)完成實(shí)驗(yàn))，經(jīng)臨床試用P24蛋白檢測(cè)陽(yáng)性與PCR檢測(cè)的HIV陽(yáng)性有很好的符合率，本試劑盒和PCR法相比，PCR需貴重的儀器設(shè)備，消耗性試劑昂貴，收費(fèi)價(jià)又高，而本試劑盒整個(gè)實(shí)驗(yàn)中無(wú)需貴重儀器設(shè)備，消耗性試劑便宜且收費(fèi)價(jià)低廉，能適用于各級(jí)醫(yī)院及臨床測(cè)試中心，也可用于流行病學(xué)普查。本發(fā)明的試劑盒，具有簡(jiǎn)便、靈敏、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，能檢出完整P24抗原，將可被普遍使用。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施兩例，進(jìn)ー步闡述本發(fā)明。本實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例I制備人類免疫缺陷病毒P24抗原酶免檢測(cè)試劑盒的生產(chǎn)步驟I、生物素化抗體制備(I)純化包被抗體用重組抗原免疫豚鼠、兔子或者羊，得抗P24抗血清或免疫Balb/C小鼠得陽(yáng)性鼠脾細(xì)胞與骨髄瘤細(xì)胞融合成雜交瘤細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆建株，得腹水；抗血清或腹水用鹽析、離子交換層析、或者親和層析法進(jìn)行純化，得純抗P24抗體，其純度95%以上。效價(jià)大于10萬(wàn)。、(2)生物素偶聯(lián)抗P24抗體用常規(guī)方法將生物素(BNHS)溶于N，N_ ニ甲基酰胺(DMF)配成lmg/Ml，用0. Imol/L pH值為9. 0的NaHC03將純化的抗P24抗體稀釋成l_2mg/mL，按BNHS與抗體的容積比為I 8或重量比為I : 7左右混合，室溫?cái)嚢柘路磻?yīng)2-4h，裝入透析對(duì)0. 05mol/LpH值為
7.2的PBS，4°C透析過(guò)夜，結(jié)合物加等體積的甘油，小量分裝，_20°C —下保存?zhèn)溆谩?、酶標(biāo)記抗體制備(I)抗體制備基因重組的P24Ag免疫豚鼠、兔子或者羊得抗P24抗體或重組的P24Ag免疫Balb/C小鼠得腹水，抗血清或腹水用鹽析、離子交換層析、或者親和層析法進(jìn)行純化，得純抗P24抗體，其純度95%以上。效價(jià)大于10萬(wàn)。(2)酶標(biāo)記抗體制備抗P24抗體用過(guò)碘酸鈉法與辣根過(guò)氧化物偶聯(lián)。(3)酶標(biāo)記抗體濃度選定采用方陣滴定法選擇酶標(biāo)記抗體的工作濃度大于I : 2000。P24重組抗原從lOug/ml倍増稀釋，包被酶標(biāo)板，加梯度稀釋的酶標(biāo)抗體測(cè)定，以確定最適稀釋度。3、預(yù)包被抗體板的制備(I)包被用0. 05M的pH值為4. 5-5. O的檸檬酸緩沖液配制所需濃度的親和素包被液，將包被液加入固相載體酶標(biāo)上，置濕盒中加蓋，40C過(guò)夜甩干。⑵洗滌用生理鹽水洗滌三遍，以去除剩余親和素。(3)封閉Na2HP04. 12H202. 6g
NaH2P04. 12H200. 4g
20%Tween-202. 5mL
NaCl8.2g
BSAIOg
Proclin300ImL
重蒸水定容至IOOOmL
調(diào)整PH至7. 2，將封閉液300 U L加入微孔板各孔中，靜置5秒后甩干，上述操作重復(fù)三次，甩掉封閉液，拍干。(4) 二次反應(yīng)包被將生物素化的抗P24抗體用0. 02M的PBS稀釋至合適濃度，加110 ii L于微孔板各孔中，置濕盒中加蓋，40C過(guò)夜甩干。用0. 02M的PBS溶液洗滌三遍并抽濕干燥，放入有干燥劑鋁箔袋封存?zhèn)溆谩?、陽(yáng)性對(duì)照的制備HIV呈陽(yáng)性的患者血清。600C放置I個(gè)小時(shí)，除菌過(guò)濾，用本藥盒測(cè)定A值> 0. 3，備用，分裝。5、陰性對(duì)照的制備用本試劑盒測(cè)定正常人血清A值在0-0. 03，加千分之一的Proclin300，分裝備用。6、酶標(biāo)單抗配置用含10%小牛血清和90% 0. 15M的PBS稀釋Anti-p24_HRP，稀釋20倍，分裝。7、酶標(biāo)單抗稀釋液
BSA0.5g
Na2HP04. 12H202. 6g
NaH2P04. 2H200. 4g
NaCl8.2g
20%Tween-20100ml
Proclin300ImL調(diào)整pH 至 7. 28、底物液A
Na2HP04. 12H20I. 7g
檸檬酸.H200. 5g
3%H202200IX I
重蒸水100ml
調(diào)整pH 至 5. 09、底物液BNa2HP04. 12H20I. 7g檸檬酸 H200. 5g重蒸水IOOml調(diào)整pH 至 5. 0 后，加入 IOmlDMSO 含 60mgTMB 的溶液 25 U I10、終止液濃H2S04IOml 重蒸水80ml11、20X 洗滌液
Na2HP04.12H202. 6g
NaH2P04. 2H200. 4g
Tween-202. 5 u I
重蒸水50ml調(diào)整pH 至 7. 212、半成品及成品的組成上述⑴一(11)步驟所得產(chǎn)品裝入小瓶及尖底離心管中，即為半成品。抽出三份經(jīng)過(guò)特異性、穩(wěn)定性、靈敏度及精密度檢定合格才能組裝成P24試劑盒。組裝成盒后還需抽出三份，同半成品ー樣經(jīng)過(guò)檢定合格才能出售。實(shí)施例2一種人類免疫缺陷病毒P24抗原酶免檢測(cè)試劑盒的操作步驟I、操作步驟如下(I)取出已包被條孔或板，恢復(fù)至室溫。(2)配液將濃縮洗滌液(20X)用蒸餾水或去離子水稀釋備用(20倍濃洗滌液lml+19ml蒸餾水即為工作液)。(3)加樣每孔加待檢血清50ul，各板設(shè)陽(yáng)性對(duì)照一孔(50ul)，陰性對(duì)照一孔(50ul)，空白對(duì)照一孔(加蒸餾水50ul)，然后除空白對(duì)照孔外，各孔加酶標(biāo)記液50ul。(4)溫育用封板膜封板后置37°C溫育30分鐘。(5)洗滌小心揭掉封板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液充分洗滌5遍，扣干。(6)每孔加入顯色液A、B各I滴(50ul)，輕輕振蕩混勻，37°C避光顯色15分鐘(7)測(cè)定OD值每孔加終止液I滴(50ul)，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶免分析儀波長(zhǎng)于450nm處(建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè))，測(cè)定各孔OD值。(8)結(jié)果判定陰性對(duì)照(A值)*2. 5 =臨界值(cut off值)，陰性對(duì)照高于0. 05時(shí)按實(shí)際OD值算，陰性對(duì)照小于0. 05按0. 05計(jì)算，凡待檢標(biāo)本孔A值大于臨界值即為陽(yáng)性。
權(quán)利要求
1.“ー種人類免疫缺陷病毒P24抗原酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒”，其特征在于該試劑盒包括 (1)用親和素預(yù)先包被酶標(biāo)板，并加入生物素標(biāo)記的抗P24抗原抗體二次包被反應(yīng)，制成抗體預(yù)包被反應(yīng)條48-96孔； (2)酶標(biāo)記抗P24抗原抗體； (3)陽(yáng)性對(duì)照液I支、陰性對(duì)照液I支； (4)20倍濃縮洗液I瓶； (5)底物緩沖液甲I瓶； (6)底物緩沖液こI瓶； (7)終止液I瓶組成。
2.一種如權(quán)利I所描述的ー種“人類免疫缺陷病毒p24抗原酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒”的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟 (1)利用人類免疫缺陷病毒P24抗原基因片段，通過(guò)原核表達(dá)或者真核表達(dá)制備抗原； (2)制備抗體的制備和純化 用上述重組抗原免疫豚鼠、兔子或者羊，得抗P24抗血清或免疫Balb/C小鼠得陽(yáng)性鼠脾細(xì)胞與骨髄瘤細(xì)胞融合成雜交瘤細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆株，得腹水；抗血清或腹水用鹽析、離子交換層析、或者親和層析法進(jìn)行純化，得純抗P24抗體，其純度95%以上，效價(jià)大于10萬(wàn)。
(3)用親和素預(yù)先包被酶標(biāo)板，并加入生物素標(biāo)記的抗人類免疫缺陷病毒P24單克隆抗體或者多克隆抗體進(jìn)行二次包被反應(yīng)，制成抗體預(yù)包被反應(yīng)條48-96孔； (4)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)與純化的抗人類免疫缺陷病毒P24抗體酶聯(lián)，制成酶標(biāo)抗體； (5)配制陽(yáng)性對(duì)照液、陰性對(duì)照液； (6)配制20倍濃縮洗液； (7)配制底物緩沖液甲； (8)配制底物緩沖液こ； (9)配制終止液； (10)分裝上述試劑盒除預(yù)包被板其余七種成分，按需要分裝在小瓶或尖底離心管中； (11)檢定試劑盒的特異性、靈敏度、精密性、穩(wěn)定性合格； (12)組裝成成品。
3.根據(jù)權(quán)利I所述的ー種“人類免疫缺陷病毒p24抗原酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒”，其特征在于其中所述的抗體預(yù)包被反應(yīng)條48-96孔、酶標(biāo)記P24抗體、陽(yáng)性對(duì)照液為HIV陽(yáng)性血清，陰性對(duì)照液為正常人血清、濃洗滌液為磷酸-Tween-20緩沖液，底物緩沖液甲為H202、底物緩沖液こ為3. 3’，5. 5’ -四甲基聯(lián)苯胺和終止液為(4N H2S04)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在干，所述親和素包被固相載體酶標(biāo)板采用一下方法 用0. 05M的pH值為4. 5-5. 0的檸檬酸緩沖液配制所需濃度的親和素包被液，將包被液加入固相載體酶標(biāo)上，并洗滌、封閉，再加入生物素化的人類免疫缺陷病毒P24單克隆抗體進(jìn)行反應(yīng)后，經(jīng)洗滌、抽濕干燥后用鋁箔袋密封。
5.如權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，所述濃縮洗滌液配方為含0. 02MPBS,8.9%NaCl 和 0. 5% Tween-20 o
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種人類免疫缺陷病毒P24抗原酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，解決傳統(tǒng)酶標(biāo)板批間差不足的問(wèn)題，設(shè)計(jì)并建立了P24抗原的檢測(cè)試劑盒，該試劑盒是包括親和素預(yù)先包被后加入生物素化抗人類免疫缺陷病毒P24抗體的酶標(biāo)板包被反應(yīng)條、酶標(biāo)記抗P24抗原抗體、陽(yáng)性對(duì)照液一支、陰性對(duì)照液一支、20倍濃洗滌液1瓶、底物緩沖液甲1瓶、底物緩沖液乙1瓶及終止液1瓶組成。本發(fā)明具有較好的均一性，特異性，靈敏度，定量精確，快速簡(jiǎn)便，適用于人類免疫缺陷病毒P24抗原早期檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/531GK102768274SQ20111011415
公開(kāi)日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2011年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月4日
發(fā)明者林志鏗 申請(qǐng)人:武漢康苑生物醫(yī)藥科技有限公司