專(zhuān)利名稱(chēng)：一種定量檢測(cè)透明質(zhì)酸片段結(jié)構(gòu)變化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及透明質(zhì)酸的測(cè)定方法，特別涉及一種定量檢測(cè)透明質(zhì)酸片段結(jié)構(gòu)變化的方法。
背景技術(shù)：
透明質(zhì)酸是由葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖組成的雙糖單位重復(fù)連接而成一種直鏈高分子黏多糖。透明質(zhì)酸片段一般為大分子透明質(zhì)酸鈉降解而成，其降解方法可分為三大類(lèi)物理降解(例如加熱、微波、超聲波，射線等)、化學(xué)降解(例如酸、堿、氧化等)和生物降解(例如玻璃酸酶)。使用動(dòng)物組織提取的玻璃酸酶降解透明質(zhì)酸，只有酶切位點(diǎn)的糖苷鍵斷裂，其雙糖結(jié)構(gòu)單元沒(méi)有變化。但是在物理降解和化學(xué)降解過(guò)程中，透明質(zhì)酸除了糖苷鍵的斷裂，葡萄糖醛酸殘基或乙酰氨基葡萄糖殘基的結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生變化。例如透明質(zhì)酸在加熱過(guò)程中產(chǎn)生雙鍵，在堿降解過(guò)程中會(huì)發(fā)生脫乙酰基反應(yīng)等。然而，透明質(zhì)酸降解產(chǎn)生的透明質(zhì)酸片段，是長(zhǎng)短不一的透明質(zhì)酸小分子片段的混合物，使用一般技術(shù)很難檢測(cè)其結(jié)構(gòu)的變化及變化程度。核磁共振技術(shù)(NMR)可用來(lái)測(cè)定物質(zhì)結(jié)構(gòu)，但這一技術(shù)對(duì)樣品純度要求很高，且儀器昂貴，檢測(cè)費(fèi)用很高，無(wú)法普及使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種定量檢測(cè)透明質(zhì)酸片段結(jié)構(gòu)變化的方法，可以對(duì)不同降解方法制備的透明質(zhì)酸片段的結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行定量分析。本發(fā)明是通過(guò)以下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明涉及一種定量檢測(cè)透明質(zhì)酸片段結(jié)構(gòu)變化的方法，其特征在于包括如下步驟
1)將透明質(zhì)酸片段用透明質(zhì)酸酶酶解，然后采用高效液相色譜法測(cè)定透明質(zhì)酸片段的含量；
2)將透明質(zhì)酸片段采用咔唑法測(cè)定透明質(zhì)酸片段的含量；
3)將步驟2)的測(cè)定值減去步驟1)的測(cè)定值，即為透明質(zhì)酸片段結(jié)構(gòu)變化的量。上述本發(fā)明的定量檢測(cè)透明質(zhì)酸片段結(jié)構(gòu)變化的的方法，優(yōu)選的，所述的步驟1) 包括以下步驟
a)樣品預(yù)處理
精密稱(chēng)取透明質(zhì)酸對(duì)照品和透明質(zhì)酸片段樣品適量分別置于50ml容量瓶中，用醋酸鈉緩沖液溶解并定容，加入透明質(zhì)酸酶，37°C水浴池；
b)色譜條件
在本發(fā)明的高效液相色譜測(cè)定中，采用糖分析柱；流動(dòng)相為0. 5-1. 0 mol/L的磷酸鹽緩沖液；流速為0. 3-1. 0 ml/min ；柱溫為30士5°C ；檢測(cè)波長(zhǎng)235士5nm ；進(jìn)樣量為20 μ 1 ；
c)結(jié)果計(jì)算
采用高效液相色譜分別對(duì)對(duì)照品酶解液和樣品酶解液進(jìn)行色譜分離，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品含量。
本發(fā)明使用的透明質(zhì)酸酶也稱(chēng)為玻璃酸酶，其降解透明質(zhì)酸時(shí)，只有酶切位點(diǎn)的糖苷鍵斷裂，其雙糖結(jié)構(gòu)單元沒(méi)有變化。本發(fā)明使用透明質(zhì)酸酶對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，并結(jié)合液相色譜分離技術(shù)得到樣品含量，方法特異性高，而咔唑法的原理是只要樣品中存在己糖醛酸結(jié)構(gòu)即可與咔唑試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，從而推算得到樣品含量，特異性較差。這兩種方法在測(cè)定大分子透明質(zhì)酸鈉和酶法生產(chǎn)的透明質(zhì)酸片段含量時(shí)結(jié)果是一致的，但是在測(cè)定物理或化學(xué)方法制備的透明質(zhì)酸片段的含量時(shí)，高效液相色譜法的測(cè)定值明顯低于咔唑法的測(cè)定值。這是因?yàn)閷?duì)于物理或化學(xué)方法制備的透明質(zhì)酸片段，結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致樣品不能被完全酶解或發(fā)生結(jié)構(gòu)變化的酶解產(chǎn)物不能在原保留時(shí)間被檢測(cè)到；而咔唑法因?yàn)樘禺愋圆?，測(cè)定結(jié)果不被樣品的結(jié)構(gòu)變化干擾。因此兩種方法的差值可用于評(píng)估樣品結(jié)構(gòu)變化的程度。本發(fā)明中高效液相色譜法測(cè)定透明質(zhì)酸片段含量特異性高，而咔唑法特異性差， 利用兩者的測(cè)定差值可評(píng)估不同方法制備的透明質(zhì)酸片段結(jié)構(gòu)變化的程度，對(duì)透明質(zhì)酸片段的生產(chǎn)和應(yīng)用有一定的指導(dǎo)作用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
1. 1樣品動(dòng)物組織提取的玻璃酸酶降解產(chǎn)生的透明質(zhì)酸片段，平均分子量為5800。1.2 方法:
a)樣品預(yù)處理
精密稱(chēng)取透明質(zhì)酸對(duì)照品和透明質(zhì)酸片段樣品適量分別置于50ml容量瓶中，用醋酸鈉緩沖液溶解并定容，加入透明質(zhì)酸酶，37°C水浴池；
b)色譜條件
高效液相色譜法的色譜條件為氨基柱(4. 6mmX250mm)，流動(dòng)相為0. 5 mol/L的磷酸鈉緩沖液；流速為0. 5ml/min ；柱溫為30°C;檢測(cè)波長(zhǎng)232nm ；進(jìn)樣量為20 μ L。咔唑法參照歐洲藥典中透明質(zhì)酸鈉的含量測(cè)定方法。c)結(jié)果計(jì)算
采用高效液相色譜分別對(duì)對(duì)照品酶解液和樣品酶解液進(jìn)行色譜分離，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品含量。(以上的處理方法，實(shí)施例2-5與上基本相同)
1.3結(jié)果咔唑法測(cè)定結(jié)果為92. 16%，高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果為90. 85%，兩者差值為1.31%，兩種方法測(cè)定的結(jié)果無(wú)明顯差異，說(shuō)明透明質(zhì)酸片段的結(jié)構(gòu)變化小，即此方法對(duì)透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)的破壞作用小。實(shí)施例2:
2.1樣品鹽酸降解產(chǎn)生的透明質(zhì)酸片段，平均分子量為11600。2. 2方法高效液相色譜法的色譜條件為氨基柱(4. 6mmX 250mm)，流動(dòng)相為0. 5 mol/L的磷酸鈉緩沖液；流速為0. 5ml/min ；柱溫為30°C;檢測(cè)波長(zhǎng)232nm ；進(jìn)樣量為20 μ 1。 咔唑法參照歐洲藥典中透明質(zhì)酸鈉的含量測(cè)定方法。2. 3結(jié)果咔唑法測(cè)定結(jié)果為95. 99%，高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果為77. 64%，兩者差值為18. 35%，說(shuō)明透明質(zhì)酸片段的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，即鹽酸降解對(duì)透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)有破壞作用。實(shí)施例3:
3.1樣品鹽酸降解產(chǎn)生的透明質(zhì)酸片段，平均分子量為7200。3. 2方法高效液相色譜法的色譜條件為氨基柱(4. 6mmX 250mm)，流動(dòng)相為0. 5 mol/L的磷酸鈉緩沖液；流速為0. 5ml/min ；柱溫為30°C;檢測(cè)波長(zhǎng)232nm ；進(jìn)樣量為20 μ 1。 咔唑法參照歐洲藥典中透明質(zhì)酸鈉的含量測(cè)定方法。3. 3結(jié)果咔唑法測(cè)定結(jié)果為95. 48%，高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果為62. 38%，兩者差值為33. 10%。結(jié)合實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，說(shuō)明在相同降解條件下，透明質(zhì)酸片段的平均分子量越低，其結(jié)構(gòu)破壞程度越嚴(yán)重。實(shí)施例4:
4.1樣品氧化降解產(chǎn)生的透明質(zhì)酸片段，平均分子量為9600。4. 2方法高效液相色譜法的色譜條件為氨基柱(4. 6mmX 250mm)，流動(dòng)相為0. 5 mol/L的磷酸鈉緩沖液；流速為0. 5ml/min ；柱溫為30°C;檢測(cè)波長(zhǎng)232nm ；進(jìn)樣量為20 μ 1。 咔唑法參照歐洲藥典中透明質(zhì)酸鈉的含量測(cè)定方法。4. 3結(jié)果咔唑法測(cè)定結(jié)果為106. 4%，高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果為67. 96%，兩者差值為38.40%。說(shuō)明氧化降解產(chǎn)生的透明質(zhì)酸片段結(jié)構(gòu)也發(fā)生了很大變化。實(shí)施例5
5.1樣品氧化降解產(chǎn)生的透明質(zhì)酸片段，平均分子量為2300。5. 2方法高效液相色譜法的色譜條件為氨基柱(4. 6mmX 250mm)，流動(dòng)相為0. 5 mol/L的磷酸鈉緩沖液；流速為0. 5ml/min ；柱溫為30°C;檢測(cè)波長(zhǎng)232nm ；進(jìn)樣量為20 μ 1。 咔唑法參照歐洲藥典中透明質(zhì)酸鈉的含量測(cè)定方法。5. 3結(jié)果咔唑法測(cè)定結(jié)果為103. 2%，高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果為42. 14%，兩者差值為61. 06%。結(jié)合實(shí)施例4的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，說(shuō)明在相同降解條件下，透明質(zhì)酸片段的平均分子量越低，其結(jié)構(gòu)破壞程度越嚴(yán)重。
權(quán)利要求
1.一種定量檢測(cè)透明質(zhì)酸片段結(jié)構(gòu)變化的方法，其特征在于包括如下步驟1)將透明質(zhì)酸片段用透明質(zhì)酸酶酶解，然后采用高效液相色譜法測(cè)定透明質(zhì)酸片段的含量；2)將透明質(zhì)酸片段采用咔唑法測(cè)定透明質(zhì)酸片段的含量；3)將步驟2)的測(cè)定值減去步驟1)的測(cè)定值，即為透明質(zhì)酸片段結(jié)構(gòu)變化的量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)透明質(zhì)酸片段結(jié)構(gòu)變化的的方法，其特征在于所述的步驟1)包括以下步驟a)樣品預(yù)處理精密稱(chēng)取透明質(zhì)酸對(duì)照品和透明質(zhì)酸片段樣品適量分別置于50ml容量瓶中，用醋酸鈉緩沖液溶解并定容，加入透明質(zhì)酸酶，37°C水浴池；b)色譜條件在本發(fā)明的高效液相色譜測(cè)定中，采用糖分析柱；流動(dòng)相為0. 5-1. 0 mol/L的磷酸鹽緩沖液；流速為0. 3-1. 0 ml/min ；柱溫為30士5°C ；檢測(cè)波長(zhǎng)235士5nm ；進(jìn)樣量為20 μ L ；c)結(jié)果計(jì)算采用高效液相色譜分別對(duì)對(duì)照品酶解液和樣品酶解液進(jìn)行色譜分離，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種對(duì)高分子透明質(zhì)酸鈉降解產(chǎn)生的透明質(zhì)酸片段發(fā)生的結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行定量檢測(cè)的方法。其特點(diǎn)是分別采用高效液相色譜法和咔唑法同時(shí)測(cè)定透明質(zhì)酸片段的含量，并利用其差值對(duì)不同方法制備的透明質(zhì)酸片段的結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行定量。本發(fā)明適用于各種方法制備的透明質(zhì)酸片段，根據(jù)測(cè)定結(jié)果可評(píng)估降解方法對(duì)透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)的破壞程度及初步判斷透明質(zhì)酸片段的生產(chǎn)方法，是評(píng)價(jià)透明質(zhì)酸片段質(zhì)量的一種重要手段。
文檔編號(hào)G01N21/78GK102323344SQ201110202860
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月20日
發(fā)明者劉愛(ài)華, 欒貽宏, 王海英, 郭學(xué)平 申請(qǐng)人:山東福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司