專利名稱：一種應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物根際土壤微生態(tài)安全性評價的pcr-dgge技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物根際土壤微生態(tài)安全性評價的PCR-DGGE技術(shù)，屬轉(zhuǎn)基因生物安全性評估和微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自1983年世界上首例轉(zhuǎn)基因植物獲得成功以來，利用基因工程對農(nóng)作物進(jìn)行改良和優(yōu)化后在提高產(chǎn)量、改善農(nóng)產(chǎn)品營養(yǎng)成分、縮短育種周期、增強(qiáng)抗病蟲性等方面均取得了巨大成就。許多轉(zhuǎn)基因作物如玉米、棉花、大豆等已經(jīng)進(jìn)入了商業(yè)化生產(chǎn)。然而這些轉(zhuǎn)入了外源基因的作物是否會給人們帶來不可預(yù)料的風(fēng)險卻備受爭議，轉(zhuǎn)基因作物的安全問題也是目前國際社會關(guān)注的熱點(diǎn)。土壤是生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化的重要場所，土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定與否直接關(guān)系到賴以其生存的作物的生長和發(fā)育，并最終影響到整個農(nóng)業(yè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。土壤生態(tài)系統(tǒng)中蘊(yùn)含著極其豐富的微生物群落，參與土壤中諸多生物化學(xué)過程、營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)、有機(jī)物的分解轉(zhuǎn)化等，是土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化及有機(jī)物質(zhì)分解的基礎(chǔ)。土壤微生物在生態(tài)系統(tǒng)中起著舉足輕重的作用，是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，其多樣性與活性的保持是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)健康、穩(wěn)定的基礎(chǔ)，因此，評價轉(zhuǎn)基因作物對土壤微生物數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)及功能的影響具有重要的生態(tài)學(xué)意義。目前，國內(nèi)關(guān)于轉(zhuǎn)Bt基因水稻對根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響的研究主要采用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法，誤差極大，遠(yuǎn)不如分子生物學(xué)方法準(zhǔn)確、簡便、直觀。變形梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)因穩(wěn)定性強(qiáng)，重復(fù)性好，靈敏度高，能提供群落中優(yōu)勢種群信息并且可同時分析多個樣品等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于微生物分子生態(tài)學(xué)研究的各個領(lǐng)域，已經(jīng)發(fā)展成為研究微生物群落結(jié)構(gòu)的主要分子生物學(xué)方法之一。目前國內(nèi)外關(guān)于運(yùn)用PCR-DGGE技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)Bt基因作物對根際土壤微生物安全性評價的報道較少，建立適用于評價轉(zhuǎn)Bt基因作物對根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響的PCR-DGGE技術(shù)，對于完善轉(zhuǎn)基因作物土壤生態(tài)安全評價技術(shù)體系至關(guān)重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種快速、穩(wěn)定、直觀的應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物根際土壤微生態(tài)安全性評價的PCR-DGGE技術(shù)，以解決傳統(tǒng)培養(yǎng)方法工作量繁重、誤差大、 不全面、分辨水平低等問題，從而將PCR-DGGE技術(shù)成功應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物對根際土壤微生態(tài)安全性評價中。本發(fā)明根據(jù)植物根際土壤特性，結(jié)合土壤微生物多樣性研究方法，摸索出一種適用于評價轉(zhuǎn)基因作物根際土壤微生物群落影響的PCR-DGGE技術(shù)體系，該技術(shù)可以不經(jīng)過培養(yǎng)而直接提取根際土壤微生物基因組總DNA。DNA分子的種類及相對比例可以反應(yīng)土壤樣品中微生物種群的數(shù)量及相對比例，使在獲得的DGGE圖譜中，每一條帶可以代表一種微生物的基因組DNA片段，即條帶信息反應(yīng)該樣品微生物群落組成，這樣根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)信息就被間接的記錄在DGGE圖譜上，分析該圖譜并結(jié)合聚類分析就可以比較分析轉(zhuǎn)基因作物對根際土壤微生物群落的影響。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明所述的應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物根際土壤微生態(tài)安全性評價的PCR-DGGE技術(shù)， 具體包括以下步驟1)收集不同生育期的轉(zhuǎn)基因作物、非轉(zhuǎn)基因作物的根際土壤樣品，進(jìn)行基因組 DNA提取通過采用酶裂解、化學(xué)裂解并結(jié)合反復(fù)凍融裂解法，以及重復(fù)氯仿、異戊醇抽提步驟，有效提高了細(xì)胞裂解效率和DNA得率，并減少了土壤中腐植酸、有機(jī)分子等雜質(zhì)對核酸提取和PCR擴(kuò)增過程的抑制作用，提高了所得DNA的純度。其中，所述的生育期包括苗期、分蘗期、拔節(jié)期、抽穗期、成熟期；所述的轉(zhuǎn)基因作物優(yōu)選轉(zhuǎn)Bt基因作物，更優(yōu)選轉(zhuǎn)Bt基因水稻。2)分別用細(xì)菌、真菌、放線菌的特異性引物對對上述提取的各基因組DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序采用降落PCR由于DGGE電泳要求在DNA片段的一端加入一段富含GC的DNA片段，擴(kuò)增所用一條引物的5’-端含有一段約40bp的GC夾子，其退火溫度較高，使得使用常規(guī)的PCR擴(kuò)增方法效率較低。因此，本發(fā)明設(shè)計了一種降落PCR擴(kuò)增方法，即以高于退火溫度10°C的溫度為起點(diǎn)，每個循環(huán)降低0. 5°C，反應(yīng)20個循環(huán)后溫度降為退火溫度，在此退火溫度下再進(jìn)行15 個循環(huán)，從而大大提高了 PCR擴(kuò)增質(zhì)量及擴(kuò)增效率。具體來講，本發(fā)明采用種群特異性引物，即細(xì)菌引物對341f_GC/518r、真菌引物對 NS7-GC/NS8、放線菌引物對R513-GC/F243分別針對性的研究了不同生育期轉(zhuǎn)Bt基因和非轉(zhuǎn)Bt基因作物根際土壤中主要的三大類微生物群落的結(jié)構(gòu)。其中細(xì)菌引物對序列如下341f-GC :cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg cctacgggag gcagca (參看 SEQ ID No 1)；518r :gtattaccgc ggctgctgg(參看 SEQ ID No 2)；真菌引物對序列如下NS7-GC :cgcccgccgc gccccgcgcc cgtcccgccg cccccgcccc aggcaataac aggtctg (參看 SEQ ID No 3)；NS8 :tccgcaggtt cacctacgga(參看 SEQ ID No 4)；放線菌引物對序列如下R513-GC :cgcccgccgc gccccgcgcc cgtcccgccg cccccgcccc cgcggctgct ggcacgta (參看 SEQ ID No 5)；F243 :ggatgagccc gcggccta (參看 SEQ ID No 6)。PCR 反應(yīng)體系(50μ 1) :2. 5mmol/l MgCl2,0. 2mmol/l dNTPs，0. 2pmol/L 引物， IXPCR buffer (試劑盒)，IU Taq DNA聚合酶(試劑盒)，1 μ 1 DNA模板，ddH20補(bǔ)齊。每個基因組樣品平行擴(kuò)增3管，混合之后用于后續(xù)試驗。降落PCR擴(kuò)增程序94 V解鏈5min ；94 V解鏈45s，55 °C (細(xì)菌)/50 V (真菌)/63°C (放線菌)退火45s，72°C延伸45s，運(yùn)行32個循環(huán)；72°C延伸lOmin。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。3)DGGE電泳分離得指紋印記圖譜^t DCode Universal Mutation Detection System(Bio-Rad)巾iiif DGGE ^}。 具體為在7. 5%的聚丙烯酰胺凝膠上，200V電壓、60°C溫度下運(yùn)行5個小時，細(xì)菌、真菌和放線菌DGGE電泳的變性劑濃度梯度分別是20-70%、30-60%和30_70%。其中100%變性劑中含有7M的尿素和40% (ν/ν)的去離子甲酰胺。電泳后，在400ml 0. 25 μ g/ml的溴化乙錠溶液中染色，洗滌數(shù)次后于Gel Doc2000紫外凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)上成像檢測。4)對圖譜進(jìn)行數(shù)字化處理及聚類分析首先應(yīng)用Bio-rad的Quantity One軟件獲得DGGE圖譜的數(shù)字化信息，然后使用 NTSYSpc軟件分析獲得UPGMA聚類圖，從而直觀比較轉(zhuǎn)基因作物與非轉(zhuǎn)基因親本作物根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。有益效果本發(fā)明建立了一種適用于評價轉(zhuǎn)基因作物對根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響的 PCR-DGGE技術(shù)體系，為轉(zhuǎn)基因植物的土壤微生物安全性評價體系的建立提供了新的思路和依據(jù)。此方法直接提取根際土壤樣品中總DNA，避免了傳統(tǒng)培養(yǎng)過程中的篩選和富集作用， 能更真實(shí)、直接的反應(yīng)根際土壤樣品中微生物多樣性及群落組成情況，與傳統(tǒng)方法相比，節(jié)省了大量時間和財力，避免了傳統(tǒng)方法菌種培養(yǎng)和篩選過程導(dǎo)致的微生物信息的缺失。另外此方法又可同時分析多個土壤樣品，從而更直觀、客觀地分析不同樣品間微生物群落結(jié)構(gòu)差異。


圖1為不同生育期轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻親本根際土壤DNA提取的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL15000，1 10依次為苗期Bt，苗期non Bt ； 分蘗Bt，分蘗non Bt ；拔節(jié)Bt，拔節(jié)non Bt ；抽穗Bt，抽穗non Bt ；成熟Bt，成熟non Bt。 其中苗期Bt指苗期轉(zhuǎn)Bt基因水稻，苗期non Bt指苗期非轉(zhuǎn)Bt基因水稻，其他類推。圖2為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中A為細(xì)菌，B為真菌，C為放線菌； M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000，0為空白對照，1 10與圖1所述相同。圖3為不同生育期轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻親本根際土壤細(xì)菌、真菌、放線菌的DGGE電泳圖，其中A為細(xì)菌，B為真菌，C為放線菌；1-10與圖1所述一致。圖4為不同生育期的轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻親本根際土壤細(xì)菌、真菌、 放線菌的UPGMA聚類圖，其中A為細(xì)菌，B為真菌，C為放線菌，其中苗期Bt指苗期轉(zhuǎn)Bt基因水稻，苗期non Bt指苗期非轉(zhuǎn)Bt基因水稻，其他類推。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案，所述實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例1
以轉(zhuǎn)Bt基因水稻為研究對象，采用PCR-DGGE技術(shù)研究盆栽條件下不同生育期 (如苗期、分蘗、拔節(jié)、抽穗、成熟)下該轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻親本根際土壤的微生態(tài)安全性情況。1)轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻根際土壤微生物基因組DNA的提取分別提取轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因親本水稻在各個生育期的根際土壤，采用反復(fù)凍融法進(jìn)行DNA提取將0. 5g樣品放入2ml離心管中，加入Iml抽提緩沖液(lOOmmol/L Tris-HCl, 1 OOmmo 1/L EDTA (pH 8. 0)，IOOmmol/L 磷酸鈉緩沖液(pH 8. 0)，1. 5mol/L NaCl，
CTAB)，加入 50 μ 1 濃度為 100mg/ml 的溶菌酶，37°C水浴 IOmin ；加入 200 μ 1 20% SDS, 65°C水浴0. 5h ；6000Xg離心5min ；取上清液，分別置于_70°C超低溫冰箱中及微波爐中反復(fù)凍融三次，6000Xg離心5min;上清液中加入等體積氯仿異戊醇(體積比對1)， 6000Xg離心lOmin，收集上層水相，重復(fù)抽提一次；加入0. 6倍等體積異丙醇過夜沉淀， 12000Xg離心IOmin ；沉淀用70%預(yù)冷的冰乙醇洗滌1次，室溫下晾干后用100 μ 1 TE溶解沉淀。應(yīng)用同樣方法，提取了非轉(zhuǎn)Bt基因水稻各個生育期的根基土壤基因組DNA。圖1為不同生育期轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻親本根際土壤基因組DNA 提取的瓊脂糖凝膠電泳圖?？梢钥闯?，從根際土壤樣品中提取得到了較高質(zhì)量的的基因組 DNA，點(diǎn)樣孔無蛋白殘留，基因組無拖尾現(xiàn)象。因此，使用該方法獲得了完整、無降解、純度高的各個生育期的轉(zhuǎn)Bt基因水稻和非轉(zhuǎn)Bt基因的根際土壤基因組DNA，充分說明該提取方法適用于轉(zhuǎn)基因植物根際土壤基因組DNA的獲取。2)分別用細(xì)菌、真菌、放線菌的特異性引物對對上述提取的不同生育期的各基因組DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序采用降落PCR其中采用的特異性引物對分別為細(xì)菌引物對341f_GC/518r、真菌引物對NS7-GC/ NS8、放線菌引物對R513-GC/F243。細(xì)菌的引物對序列如下341f-GC :cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg cctacgggag gcagca (參看 SEQ ID No 1)；518r :gtattaccgc ggctgctgg(參看 SEQ ID No 2)；真菌的引物對序列如下NS7-GC :cgcccgccgc gccccgcgcc cgtcccgccg cccccgcccc aggcaataac aggtctg (參看 SEQ ID No 3)；NS8 :tccgcaggtt cacctacgga(參看 SEQ ID No 4)；放線菌的引物對序列如下R513-GC :cgcccgccgc gccccgcgcc cgtcccgccg cccccgcccc cgcggctgct ggcacgta (參看 SEQ ID No 5)；F243 :ggatgagccc gcggccta (參看 SEQ ID No 6)。PCR 反應(yīng)體系(50μ 1) :2. 5mmol/l MgCl2,0. 2mmol/l dNTPs，0. 2pmol/L 引物， IXPCR buffer (Fermentas)，IU Taq DNA 聚合酶(Fermentas)，1 μ 1 DNA 模板，ddH20 補(bǔ)齊。 每個基因組樣品平行擴(kuò)增3管，混合之后用于后續(xù)試驗。擴(kuò)增程序如下94 V解鏈5min ；94 V解鏈45s，55 °C (細(xì)菌)/50 V (真菌)/63°C (放線菌)退火45s，72°C延伸45s，運(yùn)行32個循環(huán)；72°C延伸IOmin。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果參看圖2?？梢钥闯鋈龑σ飳U(kuò)增后分別獲得了長度約為200bp、350bp、310bp不等的細(xì)菌、真菌、放線菌DNA片段， 擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一，擴(kuò)增效果良好。3)DGGE電泳分離得指紋印記圖譜將上述擴(kuò)增得到的DNA片段進(jìn)行DGGE電泳，DGGE電泳在DCode Universal Mutation Detection System(Bio-Rad)中進(jìn)行。即在7. 5%的聚丙烯酰胺凝膠上，200V電壓、60°C溫度下運(yùn)行5個小時，其中細(xì)菌、真菌和放線菌DGGE電泳的變性劑(100%變性劑含有7M的尿素和40% (ν/ν)的去離子甲酰胺)濃度梯度分別是20-70^^30-60%和30-70%。 電泳后，在400ml 0. 25 μ g/ml的溴化乙錠溶液中染色，洗滌數(shù)次后于Gel Doc2000紫外凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)上成像檢測，結(jié)果如圖3所示?？梢钥闯鲛D(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻根際土壤細(xì)菌和放線菌的DGGE指紋圖譜在同一生育時期的差異不大，只有一些微弱的變化，然而真菌的DGGE圖譜差異稍微明顯；另外，在不同生育期內(nèi)轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻的根際土壤細(xì)菌、真菌及放線菌群落均表現(xiàn)出差異性，這可能與水稻不同生育期的生理代謝不同有關(guān)。由此可見，從DGGE圖譜可以直觀的分析比較轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的差異，從而判斷轉(zhuǎn)Bt基因水稻對根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響程度。4)對圖譜進(jìn)行數(shù)字化處理及聚類分析首先應(yīng)用Bio-rad的Quantity One軟件獲得DGGE圖譜的數(shù)字化信息，然后使用NTSYSpc軟件對不同生育期轉(zhuǎn)Bt水稻與非轉(zhuǎn)Bt水稻根際土壤細(xì)菌、真菌、放線菌進(jìn)行 UPGMA聚類分析，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果可以看出在苗期轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻根際土壤細(xì)菌、真菌、放線菌群落的相似性分別為83^^78^^89%,在各生育期中相似性最高；在分蘗期轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻根際土壤細(xì)菌和真菌群落未聚在一起，表現(xiàn)一定的差異性，而放線菌群落有高達(dá)80 %的相似性；在拔節(jié)期轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt 基因水稻根際土壤細(xì)菌群落有80%的相似性，真菌群落相似性較低，放線菌群落有72%的相似性；抽穗期轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻根際土壤細(xì)菌、真菌、放線菌群落的相似性分別為70^,52^,80% ；在成熟期轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻根際土壤細(xì)菌、真菌、放線菌群落的相似性是相對各生育期中最低的，分別為61 %，41 %和72%。從上述相似性指數(shù)可以看出，轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻根際土壤細(xì)菌和放線菌群落結(jié)構(gòu)在同一生育期內(nèi)差異較小，只有真菌群落差異稍大；在不同生育期內(nèi)三個微生物群落具有一定差異。從上述試驗可以確定本發(fā)明所采用的土壤微生物基因組DNA提取方法、PCR擴(kuò)增方法及其DGGE電泳技術(shù)對于研究轉(zhuǎn)Bt基因作物對根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響是可行的。并且本發(fā)明用非加權(quán)配對算數(shù)平均法UPGMA聚類分析方法比較了轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻對根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，成功地鑒別了不同生育期轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異，此方法也可應(yīng)用于評價其他轉(zhuǎn)Bt基因作物對根際土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)影響的研究。
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物根際土壤微生態(tài)安全性評價的PCR-DGGE技術(shù)，其特征在于， 包括以下步驟1)收集不同生育期的轉(zhuǎn)基因作物、非轉(zhuǎn)基因作物的根際土壤樣品，進(jìn)行基因組DNA提??；2)分別用細(xì)菌、真菌、放線菌的特異性引物對對上述提取的各基因組DNA片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序采用降落PCR;3)DGGE電泳分離得指紋印記圖譜；4)對圖譜進(jìn)行數(shù)字化處理及UPGMA聚類分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR-DGGE技術(shù)，其特征在于，所述的生育期包括苗期、分蘗期、拔節(jié)期、抽穗期、成熟期。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR-DGGE技術(shù)，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因作物優(yōu)選轉(zhuǎn)Bt基因作物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR-DGGE技術(shù)，其特征在于，采用酶裂解、化學(xué)裂解并結(jié)合反復(fù)凍融裂解法，以及重復(fù)氯仿、異戊醇抽提步驟，進(jìn)行基因組DNA提取。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR-DGGE技術(shù)，其特征在于，所述細(xì)菌、真菌、放線菌的特異性引物對序列如SEQ ID No 1 6所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR-DGGE技術(shù)，其特征在于，所述降落PCR擴(kuò)增程序以高于退火溫度10°c的溫度為起點(diǎn)，每個循環(huán)降低0. 5°C，反應(yīng)20個循環(huán)后溫度降為退火溫度，在此退火溫度下再進(jìn)行15個循環(huán)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR-DGGE技術(shù)，其特征在于，所述DGGE電泳是在7.5 %的聚丙烯酰胺凝膠上，200V電壓、60°C溫度下運(yùn)行5個小時，細(xì)菌、真菌和放線菌DGGE電泳的變性劑濃度梯度分別是20-70%、30-60%和30-70%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR-DGGE技術(shù)，其特征在于，所述對圖譜進(jìn)行數(shù)字化處理及聚類分析是指首先應(yīng)用Bio-rad的Quantity One軟件獲得DGGE圖譜的數(shù)字化信息，然后使用NTSYSpc軟件做聚類分析。
9.權(quán)利要求1 8任一項所述的PCR-DGGE技術(shù)在轉(zhuǎn)基因作物根際土壤微生態(tài)安全性評價中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物根際土壤微生態(tài)安全性評價的PCR-DGGE技術(shù)，具體包括以下步驟1)收集不同生育期的轉(zhuǎn)基因作物、非轉(zhuǎn)基因作物的根際土壤樣品，進(jìn)行基因組DNA提?。?)使用細(xì)菌、真菌、放線菌的特異性引物對對上述提取的各基因組DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序采用降落PCR；3)DGGE電泳分離得指紋印記圖譜；4)對圖譜進(jìn)行數(shù)字化處理及UPGMA聚類分析。本發(fā)明可用于評價轉(zhuǎn)基因作物對根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，并由此評價轉(zhuǎn)基因作物對根際土壤微生態(tài)系統(tǒng)的潛在安全風(fēng)險。
文檔編號G01N27/447GK102286618SQ20111020619
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月22日
發(fā)明者唐雪明, 朱宏, 王金斌, 程凱, 趙凱, 魏曼曼 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院