專利名稱：脂蛋白相關(guān)磷脂酶a2(lppla2)測定試劑盒(膠乳增強(qiáng)免疫比濁法)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種采用乳膠增強(qiáng)免疫比濁法測定人血清中髓過氧化物酶含量的試劑盒。
背景技術(shù)：
脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(Lp-PLA2)屬于磷脂酶A2超家族，主要由炎癥細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等)分泌。Lp-PLA2是由441個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子量為45kDa，與磷脂酶A2家族其余成員不同的是，LP-PLA2不需要鈣離子維持其催化活性。LP-PLA2具有降解血小板活化因子(platelet activating factor, PAF)的活性，因此也被稱為血小板活化因子こ酸水解酶(platelet-activating factor acetylhydro-lase, PAF-AH)。血小 板活化因子有促進(jìn)血小板聚集、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞趨化以及促進(jìn)白三烯等炎癥介質(zhì)釋放，從而促進(jìn)血栓形成和炎癥反應(yīng)。而LP-PLA2能將PAF水解為無活性的溶血PAF，故能減少炎癥和血栓的形成，具有抗炎和抗動脈粥樣硬化作用。脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2除水解PAF外，還能水解Sn-2位含有多不飽和脂肪?；难趸字?，循環(huán)中低密度脂蛋白low densitylipoprotein, LDL)相關(guān)Lp-PI A2復(fù)合物經(jīng)管腔進(jìn)入內(nèi)膜，在內(nèi)膜LDL被氧化，LDL上的卵磷脂變成氧化卵磷脂。Lp-PLA2隨即水解氧化卵磷脂生成溶血卵磷脂和氧化型游離脂肪酸。后二者是促炎介質(zhì)，能刺激粘附因子和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而促進(jìn)單核細(xì)胞由管腔向內(nèi)膜聚集。單核細(xì)胞在內(nèi)膜聚集后衍生為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞吞噬氧化型LDL變成泡沫細(xì)胞。泡沫細(xì)胞聚集成動脈粥樣硬化性斑塊，脆弱斑塊的破裂，易導(dǎo)致血栓形成和心血管事件的發(fā)生。因此，Lp-PLA2同時又具有促動脈粥樣硬化形成的作用。盡管Lp-PLA2能水解PAF而抗炎，但其在血漿中占優(yōu)勢的作用是水解氧化卵磷脂生成大量溶血卵磷脂和氧化型游離脂肪酸，而后二者又表現(xiàn)出很強(qiáng)的促動脈粥樣硬化形成的作用，臨床及實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果均證實(shí)了這一點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立ー種新的檢測方法，通過羊抗人的髓過氧化物酶抗體(或者單抗)與膠乳顆粒偶聯(lián)，采用膠乳增強(qiáng)比濁法來測定人體血清中LP-PLA2的含量，運(yùn)用該方法的試劑應(yīng)具有不需要預(yù)處理標(biāo)本，操作簡單，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，且能夠在全自動生化分析儀或者特種蛋白儀以及分光光度計上使用。為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了以下技術(shù)I. ー種采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法檢測LP-PLA2含量的試劑盒，其特征在于，包含試劑Rl，R2以及校準(zhǔn)品；所述試劑Rl PH值為6. 5-8. O的緩沖液，所述試劑R2為抗人LP-PLA2抗體膠乳試劑；所述標(biāo)準(zhǔn)品為含有定量的LP-PLA2的重組蛋白或者是從人血清中提取出來的天然LP-PLA2。2.所述的LP-PLA2檢測試劑盒中的Rl試劑主要包含緩沖液，無機(jī)鹽，加速劑和防腐劑。3.所述的LP-PLA2檢測試劑盒中R2試劑主要包含穩(wěn)定劑，抗人單(多)克隆抗體膠乳顆粒，緩沖液，穩(wěn)定劑和防腐剤。其中乳膠微球直徑為60-300nm。4.試劑Rl所述的無機(jī)鹽選自氯化鈉，氯化鎂，氯化鉀ー種或幾種。緩沖液為磷酸鹽緩沖液，碳酸鹽緩沖液，甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。加速劑為聚こニ醇4000，聚こニ醇6000，聚こニ醇 80005.試劑R2所選用的抗體為鼠抗人LP-PLA2單克隆抗體，羊抗人LP-PLA2單克隆抗體，兔抗人LP-PLA2單克隆抗體ー種或者幾種混合。也可以選鼠抗人LP-PLA2多克隆抗體，羊抗人LP-PLA2多克隆抗體，兔抗人LP-PLA2多克隆抗體其中ー種。6.試劑R2中的穩(wěn)定劑選自小牛白蛋白，甘氨酸，明膠，吐溫20，曲拉通ー種或者幾種。7.本發(fā)明所述的試劑R2為抗人LP-PLA2抗體膠乳試劑，采用的是抗人的LP-PLA2 抗體與膠乳顆粒相偶聯(lián)。經(jīng)過離心(過濾)的方法去掉未反應(yīng)的偶聯(lián)劑以及未反應(yīng)的抗體，在含有穩(wěn)定劑和防腐劑的緩沖液中分散而成。8.所述抗人LP-PLA2抗體的膠乳試劑的制備包括以下步驟。步驟I :將膠乳在PH6. 5的溶液中活化。步驟2 :洗滌去掉溶液中的碳化ニ亞胺，加PH7. 5-9. O的緩沖液，加入LP-PLA2抗體，在37度反應(yīng)4小吋。步驟3 :將步驟2所得的液體用PH7. 5-9. O的固定液固定6小吋。步驟4 :將步驟3所得的液體用PH7. 5-9. O的封閉液體封閉12小時。步驟5 :將步驟4所得的液體洗滌去掉未結(jié)合抗體，溶液用含有穩(wěn)定劑和防腐劑的緩沖液洗滌分散即得。9.作為優(yōu)選，步驟I中所用的緩沖液為PBS緩沖液，MES緩沖液，碳酸鹽緩沖液中的任何一種緩沖液，且濃度在20-100mmol/L，PH在5. 5-6. 5之間。10.作為優(yōu)選，步驟I中所用的膠乳可以是羧基化的聚苯こ烯膠乳或者是氨基化的聚苯こ烯膠乳。其孔徑在60nm-150nm均可。11.作為優(yōu)選，步驟I中含有I-(3_ ニ甲基氨基丙基)-3_こ基碳ニ亞胺、I-(3_ ニ甲基氨基丙基)-3_こ基碳ニ亞胺鹽或N-羥基硫代琥珀酰亞胺中的一種或者多種。12.作為優(yōu)選，在步驟2中，去掉溶液I中所含的未反應(yīng)的物質(zhì)，采用的是高速冷凍離心機(jī)或者超微孔徑的過濾膜進(jìn)行過濾。13.作為優(yōu)選，在步驟5中，所用的穩(wěn)定劑是小牛血清白蛋白，明膠，甘氨酸，脫脂奶粉ー種或者幾種相混合。14、本發(fā)明檢測的原理是利用抗原抗體反應(yīng)，先加入試劑R1，使血清中的LP-PLA2的位點(diǎn)暴露，當(dāng)加入抗人的LP-PLA2膠乳顆粒溶液，使溶液中的抗原抗體反應(yīng)形成不溶于溶液的抗原抗體復(fù)合物，從而產(chǎn)生一定的濁度，在人血清中LP-PLA2的含量在一定的范圍內(nèi)LP-PLA2的含量與濁度成正比。再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計算，從而得到LP-PLA2的含量。15、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下特點(diǎn)I)本發(fā)明試劑盒具有較高的檢測靈敏度，最低檢測能夠達(dá)到O. lng/L，操作簡單，快速，從檢測到出結(jié)果最多只需要10分鐘，甚至更短。2)本發(fā)明的試劑盒R2試劑中的抗體乳膠的制備由于采用的化學(xué)偶聯(lián)法，穩(wěn)定性好，在2-8度至少可以保存12個月。而采用物理吸附法的膠乳抗體試劑，批間差異比較大，而且穩(wěn)定性不好。3)本發(fā)明試劑盒與進(jìn)ロ試劑盒對樣品中LP-PLA2含量檢測的數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計分析，無顯著性差異，檢測結(jié)果可靠，在臨床上可以替代進(jìn)ロ試劑或者化學(xué)發(fā)光試劑，大幅降低成本以及檢測時間。


圖I為本發(fā)明實(shí)施例I的校準(zhǔn)曲線實(shí)施案例
本發(fā)明公開了ー種檢測LP-PLA2含量的試劑盒，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)エ藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，他們都被視為包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明的產(chǎn)品及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或者適當(dāng)變更與組合，本實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技木。一、LP-PLA2試劑R2即抗人LP-PLA2抗體膠乳試劑的制備I :將2g孔徑大小為80nm的羧基化的膠乳加入到50ml的含有1_(3_ ニ甲基氨基丙基)-3-こ基碳ニ亞胺200mg/L的PH6. O的O. 4mol/L的MES緩沖液中，反應(yīng)30分鐘。2 :將反應(yīng)液分成25ml/管，在轉(zhuǎn)速為16000轉(zhuǎn)/分的高速冷凍離心機(jī)中離心30分鐘后，去掉上清液，每管加濃度為O. 4mol/L的磷酸鹽緩沖液5ml混勻。繼續(xù)在速為16000轉(zhuǎn)/分的高速冷凍離心機(jī)中離心30分鐘后，去掉上清液，每管加濃度為O. 2mol/L的磷酸鹽緩沖液25ml混勻。3，每管加入羊抗人LP-PLA2抗體25mg，在37度反應(yīng)6小時。4 向每管中加入還有10g/L的6-氨基己酸PH8. O的磷酸鹽緩沖液10ml。5 :每管液體加小牛白蛋白O. 8g，搖勻反應(yīng)12小時。5 :將所得的液體通過2次離心，轉(zhuǎn)速為16000轉(zhuǎn)/分，洗滌去掉未結(jié)合抗體，溶液用含有O. 5g/L的明膠和O. 2g/L小牛白蛋白和O. 05%的曲拉通以及O. lg/L疊氮鈉的O. 05mol/L PBS緩沖液分散即可。ニ、LP-PLA2試劑Rl即樣品緩沖液的制備
磷酸ニ氫鈉2. 86g/L
磷酸氫ニ鈉28. 65g/L
氣化納6.87g/L
氣化鎂0.34g/L
聚乙ニ醇 600016g/L乘氣納1.5g/L
純水IL 三LP-PLA2試劑中校準(zhǔn)品的制備I)校準(zhǔn)品稀釋液
_酸ニ氫鈉2.86g/L
磷龍ニ鈉2艮65g/L 氣化鈉9g/L
小牛白蛋白50g/L
聲氣鈉2· 5g/L
褲劑10g/L2)按照需要的LP-PLA2參考校準(zhǔn)品濃度將相應(yīng)的重組LP-PLA2純品I. 6mg加入校準(zhǔn)品稀釋液Iml的緩沖液中，制備得到1600ng/ml濃度的LP-PLA2校準(zhǔn)品在使用的時候在用緩沖液按照比例稀釋成多個濃度。四LP-PLA2測定方法(日立7060全自動生化分析儀)校準(zhǔn)品濃度1600ng/ml800ng/ml 400ng/ml 200ng/mll00ng/ml Ong/ml測定波長主波長340nm 副波長800nm試劑比例R1 R2 S = 200ul 50ul IOul校準(zhǔn)方式spline讀點(diǎn)方式在試劑Rl與樣品加入，反應(yīng)5分鐘，讀點(diǎn)Al，然后加入R2后，反應(yīng)5分鐘，再讀點(diǎn)A2，計算吸光度的變化。校準(zhǔn)曲線見圖I五本發(fā)明所述試劑盒的分析性能評估I.靈敏度測定用本發(fā)明所述的試劑盒對空白樣本(含有5%牛血清的生理鹽水)重復(fù)測定20次，最低檢測限度為空白的均值濃度加上ニ個標(biāo)準(zhǔn)差，得到最低檢測限度為5ng/ml。2.線性范圍。2.線性評估取濃度將近1600ng/ml (1340. 5ng/ml)的臨床血清標(biāo)本,進(jìn)行稀釋，至少稀釋6個點(diǎn)，每個點(diǎn)重復(fù)測定3次，根據(jù)式(1)，(2)，(3)計算出直線方程y = a+bx:
t ηΣΧ,Υ,-ΣΧ, ΣΥ,...............................ハ、 “ ~nW^XF⑴ μμΜζ ................................. (2)
η
[_] ·.··..·.·.(3)
式中b_回歸線的斜率；|a|-回歸線截距的絕對值；r_回歸系數(shù)；Xi-測定管溶液的濃度；Yi_3次重復(fù)測定的與測定管溶液濃度對應(yīng)的吸光度均值；i-1,2,3, ......, η ；η-測定樣本數(shù)。經(jīng)計算得出，在O. lng/ml到1340ng/ml的范圍內(nèi)，本試劑盒能達(dá)到很好的線性。3與酶聯(lián)免疫方法的試劑盒測定結(jié)果的相關(guān)性。通過測定100例標(biāo)本(其中陽性血清70例，陰性血清30例)本試劑盒與酶聯(lián)免疫方法的試劑盒的相關(guān)系數(shù)R2 = O. 987，相關(guān)方程為Y = O. 932X-6. 237。
權(quán)利要求
1.ー種采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法檢測人血清中LP-PLA2含量的試劑盒，其特征在干，包含試劑Rl，R2以及校準(zhǔn)液；所述試劑RlPH值為6. 0-8. O的緩沖液，所述試劑R2為抗入H-FABP抗體膠乳試劑；所述標(biāo)準(zhǔn)品為含有定量的LP-PLA2的重組蛋白或者是從人血清中提取出來的天然LP-PLA2。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述抗人H-FABP抗體的膠乳試劑的制備為化學(xué)包被，包括以下步驟。
步驟I :將羧化的膠乳在PH6. 5的溶液活化。
步驟2 :洗滌去掉溶液中的碳化ニ亞胺，加PH7. 5-9. O的緩沖液，加入H-FABP抗體，在37度反應(yīng)4小吋。
步驟3 :將步驟2所得的液體用PH7. 5-9. O的固定液固定6小吋。
步驟4 :將步驟3所得的液體用PH7. 5-9. O的封閉液體封閉12小吋。
步驟5 :將步驟4所得的液體離心去上清液，取沉淀后用含有穩(wěn)定劑和防腐劑的緩沖液洗滌分散即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在干，步驟I所述溶液為含有I-(3- ニ甲基氨基丙基)-3-こ基碳ニ亞胺、I-(3-ニ甲基氨基丙基)-3-こ基碳ニ亞胺鹽或N-羥基硫代琥珀酰亞胺中的一種或者ニ種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在干，步驟3所述溶液含有6-氨基己酸，甘氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，步驟4所述溶液含有的穩(wěn)定劑選自甘氨酸，小牛血清，以及吐溫-20、曲拉通等表面活性劑以及氯化鈉、氯化鎂中的一種或者幾種。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在干，步驟4所述溶液含有的甘氨酸，小牛血清的濃度為O. 05-0. 5% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))吐溫-20或者曲拉通濃度為O. 005-0. 01 % (體積分?jǐn)?shù))氯化鎂、氯化鈉的濃度為O. 05-0. 15% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測定血清中脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(Lp-PLA2)含量測定的試劑盒。所要解決的技術(shù)問題是提供一種適用于全自動生化分析儀以及特定蛋白儀使用的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2含量的試劑盒。技術(shù)方案是脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2試劑盒，包括；a、試劑R1緩沖液、防腐劑、加速劑、表面活性劑，其余為純化水；b、試劑R2緩沖液、結(jié)合有抗人的脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2的乳膠微球c、校準(zhǔn)品緩沖液，穩(wěn)定劑，防腐劑以及根據(jù)濃度需要確定的一定量的重組脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2純品，其余為純化水。通過以上試劑組合，建立脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2含量的校準(zhǔn)曲線，在儀器上快速的測定血清中脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2的含量與酶聯(lián)免疫方法測定的結(jié)果有很好的符合性。
文檔編號G01N33/68GK102692507SQ20111021538
公開日2012年9月26日 申請日期2011年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月29日
發(fā)明者何仕釗 申請人:南京諾爾曼生物技術(shù)有限公司