用于檢測脂蛋白相關磷脂酶a2的試劑盒及其制備和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生化物質的檢測領域，具體涉及一種用于檢測脂蛋白相關磷脂酶A2 的試劑盒及其制備方法，以及一種檢測脂蛋白相關磷脂酶A2的方法。
【背景技術】
[0002] LP-PLA2由PLA2G7基因編碼，又被稱為血小板活化因子乙酰水解酶（PAF-AH)， 屬于磷脂酶家族中PLA2的一種，是絲氨酸依賴的磷脂酶，其催化活性不需要Ca 2+。人血漿 Lp-PLA2的分子量為45KDa，其主要由巨噬細胞、單核細胞、T淋巴細胞、肥大細胞、肝細胞等 分泌生成，并受到炎性介質的調節(jié)。比如，γ干擾素和脂多糖抑制其分泌，血小板活化因子 促進其分泌。Lp-PLA2的主要作用包括：產生十二烷酸類炎性物質、參與磷脂重建及生物膜 的穩(wěn)定平衡、脂蛋白代謝、細胞信號傳遞、宿主反應、促進機體壞死組織自體消失。
[0003] 近來研宄發(fā)現(xiàn)Lp-PLA2能促進粥樣斑塊的形成，并且在循環(huán)中與低密度脂蛋白 (LDL)結合。目前研宄認為冠心病（CHD)是一種慢性炎癥疾病，炎癥參與CHD發(fā)病的各個 階段。Lp-PLA2由粥樣斑塊內炎癥細胞分泌，在嚴重粥樣斑塊內濃度顯著提高，可作為預測 CHD未來心血管事件的標志物。另外還有研宄發(fā)現(xiàn)Lp-PLA2與充血性心衰（CHF)風險有關。 腦梗死的發(fā)生與AS斑塊的不穩(wěn)定性密切相關，不穩(wěn)定的斑塊容易產生栓子或形成血栓，進 而導致梗死。Lp-PLA2可能是缺血性卒中獨立的預測因子，測定Lp-PLA2水平可能提供傳 統(tǒng)危險因子評估以外的預測信息，測定其水平有助于指導預防策略。研宄發(fā)現(xiàn)代謝綜合癥 (MS)發(fā)生時，低水平炎性反應發(fā)揮著重要作用，Lp-PLA2的活性越高MS健康反應越明顯。
[0004] 目前，市面上測定LP-PLA2的方法主要有分光光度法、膠乳增強比濁法、放射性免 疫法（RIA)和酶聯(lián)免疫法（ELISA)。
[0005] 其中，檢測Lp-PLA2的分光光度法目前有兩種，一種是使用PAF硫酯類為底物。其 原理是酶水解PAF硫酯類似物骨上sn-2位的硫酯基團，釋放出游離硫醇，然后加入可以檢 測的硫醇的5' 5-二硫（二硝苯甲酸），在405nm處檢測吸光度的改變。該類底物有1-硫 代癸?；?2-癸?；?PC、1-十六烷酰-2-硫代十六烷酰-PC等。另一種是使用帶有4-硝 基苯酚基團的PAF類似物。該類底物與PAF硫酯類結構相似，只是把sn-2位的硫酯基團換 成4-硝基苯酚基團。其原理是酶水解底物后，釋放帶有4-硝基苯酚基團的物質，該物質性 質不穩(wěn)定，馬上分解成4-硝基苯酷，在405nm處可以測得由該變化引起的吸光度的改變，由 此可以測定酶的活性。
[0006] 膠乳增強比濁法，樣本中的LP-PLA2在磷酸鹽緩沖系統(tǒng)中與試劑中鼠抗人 Lp-PLA2抗體的致敏乳膠顆粒發(fā)生抗原抗體反應，在促聚劑聚乙二醇作用下產生凝集以使 濁度上升，在546nm波長檢測反應液吸光度的變化，其變化程度與樣本中的Lp-PLA2含量成 正比。
[0007] 放射性免疫法，該方法根據(jù)競爭機制原理，125I-Lp-PLA2與抗體的結合量與標準 品或樣品中的Lp-PLA2的含量呈一定函數(shù)關系。用免疫分離劑（PR)將結合部分（B)與游 離部分（F)分離后，測定結合部分的放射性強度，通過數(shù)據(jù)處理可求出樣品中Lp-PLA2的濃 度值。
[0008] 酶聯(lián)免疫法（ELISA)，此方法應用雙抗體夾心法測定全血樣本中人Lp-PLA2的 水平。用純化的人LP-PLA2抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中加入 Lp-PLA2,再與辣根過氧化物酶（HRP)標記的Lp-PLA2抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗 體復合物，經過徹底洗滌后加底物TMB (3, 3〃，5, 5〃-四甲基聯(lián)苯胺）顯色。TMB在HRP酶的 催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Lp-PLA2 含量呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中 人Lp-PLA2的含量。酶聯(lián)免疫法是較為常用的測定Lp-PLA2的一種方法。然而，全血樣本 中測量Lp-PLA2干擾成分多，影響測量的準確率；且選擇酶免發(fā)光抗體包被方式單一，同時 對Lp-PLA2結合不夠徹底，使檢測靈敏度不高；孔板上反應的不定因素較多，導致測試的重 復性較差；此外，酶聯(lián)免疫受制于其自動化程度，使得反應時間較長。

【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測Lp-PLA2的試劑盒。使用該試劑盒，采用雙 抗體夾心的方法，能夠高靈敏度、高重復性和高精確度地檢測Lp-PLA2的濃度。尤其是在 試劑盒中增加一種置換劑，進一步提高了 Lp-PLA2檢測的精密度。
[0010] 本發(fā)明還提供用于檢測Lp-PLA2的化學發(fā)光免疫檢測試劑盒的制備方法。
[0011] 另外，本發(fā)明還提供根據(jù)本發(fā)明提供的Lp-PLA2化學發(fā)光免疫檢測試劑盒的應 用，尤其是采用該試劑盒，通過全自動化學發(fā)光法進行Lp-PLA2檢測的方法，減少操作時 間，降低人為操作誤差，同時利用化學示蹤標記物的特異性，提高檢測靈敏度。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明，提供了一種用于檢測LP-PLA2的試劑盒，所述試劑盒包括用于結合 待測Lp-PLA2的包被磁球的一個或多個第一抗Lp-PLA2抗體，以及用于與待測Lp-PLA2在 不同于其（Lp-PLA2)與所述第一抗Lp-PLA2抗體的結合位點的其他位點相結合的標記有 示蹤標記物的一個或多個第二抗Lp-PLA2抗體。也就是說，第一抗Lp-PLA2抗體和第二抗 Lp-PLA2抗體的區(qū)別在于，其與待測Lp-PLA2上的結合位點不同。因此，在本發(fā)明的等同技 術方案中，試劑盒包括用于結合待測Lp-PLA2的包被磁球的一個或多個第二抗Lp-PLA2抗 體，以及用于與待測Lp-PLA2在不同于其（Lp-PLA2)與所述第二抗Lp-PLA2抗體的結合位 點的其他位點相結合的標記有示蹤標記物的一個或多個第一抗Lp-PLA2抗體。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明，所述第一抗Lp-PLA2抗體和第二抗Lp-PLA2抗體可以各自獨立地為 抗Lp-PLA2單克隆抗體和/或抗Lp-PLA2多克隆抗體。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明，所述示蹤標記物可以選自本領域中常用于標記抗原或抗體的示蹤標 記物，例如金剛烷、魯米諾及其衍生物、異魯米諾及其衍生物、叮啶醋、堿性磷酸酶或辣根過 氧化物酶，尤其優(yōu)選為N- (4-氨丁基）-N-乙基異魯米諾（ABEI)。
[0015] 適用于本發(fā)明的磁球也稱為磁珠，可以是本領域中常用的磁性微球。優(yōu)選的是，本 發(fā)明使用的磁球，是將納米級的Fe 2O3或Fe3O4磁性粒子和有機高分子材料進行復合，形成具 有超順磁性和極大量蛋白吸附容量的微米級的固相微球，具有在外加磁場作用下可迅速被 磁化，在撤走磁場后剩磁為零的屬性。其中，所述有機高分子材料的種類沒有特別限制，可 根據(jù)需要進行選擇。
[0016] 本發(fā)明所使用的磁性微球應能滿足直徑為0. 1-5 μ m，磁性微球還可以通過表面改 性而帶有多種活性功能基團，包括但不限于-OH、-COOH、-NH2。
[0017] 在一個具體實施例中，所述磁球為Fe2O3或Fe 304磁性納米粒子與有機高分子材料 的復合體，并具有〇. 1-5 μ m的粒徑；并且，所述磁球任選地通過表面改性而帶有一種或多 種活性功能基團。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明，在所述試劑盒中，第一抗LP-PLA2抗體和第二抗LP-PLA2抗體的濃度 分別為10-200 μ g/ml，示蹤標記物的濃度為0. 1-lmg/ml，磁球的濃度為0. l-5mg/ml。上述 各成分的濃度基于包含該成分的各獨立的試劑盒組分的量計。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明，所述試劑盒還包括Lp-PLA2的低點校準品和高點校準品，并任選地 包括緩沖液。本發(fā)明所述低點校準品與高點校準品是兩者相對而言，其中"低點校準品"， 是指將1^-?1^2用50%牛血清制品稀釋成濃度為1〇-3〇1^/1111得到的校準品；而"高點校準 品"是指將Lp-PLA2用50 %牛血清制品稀釋成濃度為500-700ng/ml得到的校準品。低點 校準品和高點校準品分別任選地含有牛血清白蛋白（BSA)和/或防腐劑。所述BSA濃度優(yōu) 選為 0· 01_5g/ml。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明，所述示蹤標記物直接或間接地標記第二抗Lp-PLA2抗體。間接標記 的方式包括但不限于通過異硫氰酸熒光素（FITC)與抗FITC抗體體系或通過鏈霉親和素 (SA)與生物素（Biotin)體系進行間接標記。直接標記是指ABEI直接與Lp-PLA2抗體連接 進行標記；間接標記是指通過中間媒介鏈接體系使得ABEI標記Lp-PLA2抗體，所述中間媒 介鏈接體系包括但不限于FITC與抗FITC抗體體系或鏈霉親和素與生物素體系。本發(fā)明人 發(fā)現(xiàn)，間接標記有利于減弱空間效應，有利于信號的放大，使得檢測更加靈敏。所述抗FITC 抗體優(yōu)選為羊抗FITC多克隆抗體。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明，所述第一抗Lp-PLA2抗體直接或間接地包被磁球。間接包被磁球的 方式包括但不限于通過FITC與抗FITC抗體體系或通過鏈霉親和素與生物素體系進行間接 包被。直接包被是指利用Lp-PLA2抗體直接對磁球進行包被；間接包被是指通過中間媒介 鏈接體系，使得Lp-PLA2抗體對磁球進行包被，所述中間媒介鏈接體系包括但不限于FITC 與抗FITC抗體體系或鏈霉親和素與生物素體系。間接包被的優(yōu)點在于，有利于減弱空間效 應，有利于信號