專利名稱：基于介質(zhì)微球的熒光相關(guān)譜分析方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于光學(xué)計(jì)量及超分辨成像領(lǐng)域，具體涉及一種基于介質(zhì)微球的熒光相關(guān)譜分析方法和裝置。
背景技術(shù)：
科學(xué)技術(shù)的發(fā)展使得人們極大地?cái)U(kuò)展了自己的視野。隨著研究的深入，人們對于微觀領(lǐng)域產(chǎn)生了越來越濃厚的興趣。在化學(xué)、生物、醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域，為了可以更加準(zhǔn)確地掌握研究對象的性質(zhì)，對單分子的探測與分析成為一種必不可少的研究手段。為了滿足上述要求，相應(yīng)的儀器設(shè)備被大量開發(fā)出來，熒光相關(guān)譜分析裝置(Fluorescence Correlation Spectroscopy,FCS)正是其中之一。通過動態(tài)地記錄收集到的熒光信號的強(qiáng)弱，并進(jìn)行自(互)相關(guān)數(shù)字信號處理，F(xiàn)CS可以有效地對活體細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)速率、分子流動速度和分子擴(kuò)散等信息進(jìn)行實(shí)時(shí)測量，從而成為生物化學(xué)研究中使用最為廣泛的分析裝置之一。然而，作為一種光學(xué)共焦成像系統(tǒng)，F(xiàn)CS的分辨能力也不可避免地受到了光學(xué)遠(yuǎn)場衍射極限的限制。因此當(dāng)測試樣品中熒光分子濃度過大時(shí)，往往不能有效地進(jìn)行單分子測量而對最終的測試結(jié)果產(chǎn)生干擾。解決這個(gè)問題最直接的辦法是對測試樣品進(jìn)行稀釋，然而，鑒于許多的生化反應(yīng)必須在高濃度浸潤環(huán)境下才可以完成，采用稀釋的辦法得到的測試數(shù)據(jù)并不可靠，甚至可能由于反應(yīng)無法進(jìn)行而造成測試失敗的結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種基于介質(zhì)微球的熒光相關(guān)譜分析方法和裝置，使用徑向偏振光和切向偏振光分別作為熒光激發(fā)光束和熒光抑制光束，通過介質(zhì)微球的納米噴射，突破光學(xué)遠(yuǎn)場衍射極限的限制，提高分辨率，并且有效減小了熒光相關(guān)譜分析裝置(Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS)中的有效激發(fā)面積，可以有效應(yīng)用于高濃度熒光分子樣品中。一種基于介質(zhì)微球的熒光相關(guān)譜分析方法，包括以下步驟(1)使用徑向偏振光作為熒光激發(fā)光束，切向偏振光作為熒光抑制光束，將所述的熒光激發(fā)光束和熒光抑制光束同軸平行入射到顯微物鏡中，并被所述的顯微物鏡同時(shí)聚焦在介質(zhì)微球上；所述的介質(zhì)微球位于所述的顯微物鏡的物方焦平面上，所述的介質(zhì)微球直徑為1 10um，折射率為1. 4 2 ；(2)所述的介質(zhì)微球?qū)?jīng)步驟(1)中顯微物鏡聚焦后的熒光激發(fā)光束和熒光抑制光束進(jìn)行再次聚焦，在所述的介質(zhì)微球下表面產(chǎn)生納米噴射(Nanojet)；所述的納米噴射 (Nanojet)包括由經(jīng)步驟(1)中顯微物鏡聚焦后的熒光激發(fā)光束產(chǎn)生的納米噴射和由經(jīng)步驟(1)中顯微物鏡聚焦后的熒光抑制光束產(chǎn)生的納米噴射，其中，由經(jīng)步驟(1)中顯微物鏡聚焦后的熒光激發(fā)光束產(chǎn)生的納米噴射為實(shí)心亮斑，由經(jīng)步驟(1)中顯微物鏡聚焦后的熒光抑制光束產(chǎn)生的納米噴射為中空的暗斑；
(3)將步驟(2)所產(chǎn)生的納米噴射作用于熒光樣品并激發(fā)熒光信號；換言之，由所述的熒光激發(fā)光束產(chǎn)生的納米噴射和熒光抑制光束產(chǎn)生的納米噴射共同作用于熒光樣品并激發(fā)熒光信號；(4)收集步驟( 所激發(fā)的熒光信號并進(jìn)行分析處理，得到熒光相關(guān)譜。其中，步驟⑴所述的徑向偏振光和切向偏振光，可以是作為工作光束直接入射； 也可以由激光器發(fā)出的工作光束轉(zhuǎn)換而來，所述的轉(zhuǎn)換可以通過偏振轉(zhuǎn)換器實(shí)現(xiàn)，也可以通過現(xiàn)有技術(shù)中其他方法實(shí)現(xiàn)。其中，步驟(1)所述的顯微物鏡，優(yōu)選為大數(shù)值孔徑顯微物鏡，可以為非浸沒式或浸沒式，其中非浸沒式大數(shù)值孔徑顯微物鏡的數(shù)值孔徑為0. 8 0. 95，浸沒式大數(shù)值孔徑顯微物鏡的數(shù)值孔徑為1. 0 1. 4，放大倍率為80 100倍。其中，步驟(4)中可以通過顯微物鏡來收集步驟(3)所激發(fā)的熒光信號，也可以通過現(xiàn)有技術(shù)中其他方法實(shí)現(xiàn)。當(dāng)通過顯微物鏡收集所述的熒光信號時(shí)，該顯微物鏡可以是與步驟(1)所述的顯微物鏡為同一顯微物鏡，此時(shí)收集反射回來的熒光信號，構(gòu)成“反射模式”；也可以是與步驟(1)所述的顯微物鏡的參數(shù)完全相同并在位置上構(gòu)成共焦關(guān)系的顯微物鏡，此時(shí)收集透射回來的熒光信號，構(gòu)成“透射模式”。其中，步驟中對于收集到的熒光信號進(jìn)行分析處理采用現(xiàn)有技術(shù)中通用方式來實(shí)現(xiàn)，通常是采用計(jì)算機(jī)來進(jìn)行分析處理。本發(fā)明還提供了用于實(shí)現(xiàn)上述的基于介質(zhì)微球的熒光相關(guān)譜分析方法的裝置，依次包括光源、第一顯微物鏡、介質(zhì)微球、樣品架和第二顯微物鏡，還包括與第二顯微物鏡連接的熒光信號分析處理裝置；其中，所述的光源，用于產(chǎn)生平行入射的同軸的徑向偏振光和切向偏振光；所述的第一顯微物鏡，用于對所述的徑向偏振光和切向偏振光進(jìn)行聚焦；所述的介質(zhì)微球，用于對經(jīng)第一顯微物鏡聚焦后的徑向偏振光和切向偏振光進(jìn)行再次聚焦，產(chǎn)生納米噴射；所述的樣品架，用于放置待觀察的熒光樣品，所述的熒光樣品在所述的納米噴射的作用下激發(fā)產(chǎn)生熒光信號；所述的第二顯微物鏡，用于收集所述的熒光信號；所述的熒光信號分析處理裝置， 用于分析和處理所收集到的熒光信號；所述的第一顯微物鏡、介質(zhì)微球、放置在樣品架上的待觀察的熒光樣品和第二顯微物鏡均位于所述的徑向偏振光和切向偏振光的同軸光路上，所述的介質(zhì)微球位于所述的第一顯微物鏡的物方焦平面上，所述的介質(zhì)微球直徑為1 10um，折射率為1. 4 2。其中，所述的光源，可以為直接發(fā)出徑向偏振光和切向偏振光的光源；也可以為激光光源和偏振轉(zhuǎn)換器的組合，即，由激光光源發(fā)出線偏光并經(jīng)偏振轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換得到徑向偏振光和切向偏振光。所述的偏振轉(zhuǎn)換器可以為現(xiàn)有技術(shù)中實(shí)現(xiàn)圓柱形偏振光的轉(zhuǎn)換的任何器件與裝置，優(yōu)選為瑞典ARCoptix公司的偏振轉(zhuǎn)換器feidial-Azimuthal Polarization Converter。其中，所述的第一顯微物鏡和第二顯微物鏡，優(yōu)選為大數(shù)值孔徑顯微物鏡，可以為非浸沒式或浸沒式，其中非浸沒式大數(shù)值孔徑顯微物鏡的數(shù)值孔徑為0. 8 0. 95，浸沒式大數(shù)值孔徑顯微物鏡的數(shù)值孔徑為1. 0 1. 4，放大倍率為80 100倍。所述的第二顯微物鏡可以與所述的第一顯微物鏡為同一顯微物鏡，此時(shí)收集反射回來的熒光信號，構(gòu)成“反射模式”；所述的第二顯微物鏡也可以與所述的第一顯微物鏡的參數(shù)完全相同，并在位置上構(gòu)成共焦關(guān)系，此時(shí)收集透射回來的熒光信號，構(gòu)成“透射模式”。所述的熒光信號分析處理裝置，通常為計(jì)算機(jī)。本發(fā)明的工作原理如下使用徑向偏振光作為熒光激發(fā)光束，切向偏振光作為熒光抑制光束，兩光束同軸平行入射到大數(shù)值孔徑顯微物鏡中。兩光束通過大數(shù)值孔徑顯微物鏡后，在大數(shù)值孔徑顯微物鏡的物方焦點(diǎn)附近產(chǎn)生聚焦光場。由于介質(zhì)微球位于大數(shù)值孔徑顯微物鏡的物方焦點(diǎn)上，因此熒光激發(fā)光束和熒光抑制光束將通過介質(zhì)微球的再次聚焦作用，在介質(zhì)微球下表面產(chǎn)生納米噴射現(xiàn)象，由于兩光束偏振狀態(tài)不一致，熒光激發(fā)光束產(chǎn)生的納米噴射為實(shí)心亮斑，熒光抑制光束產(chǎn)生的納米噴射為中空的暗斑。由于介質(zhì)微球的場限制效應(yīng)，兩種納米噴射的尺寸在徑向和軸向上都將小于一般的光學(xué)遠(yuǎn)場衍射極限。同時(shí)，根據(jù)STED原理，F(xiàn)CS 系統(tǒng)的有效激發(fā)面積將在徑向上被進(jìn)一步限制，這種限制效應(yīng)隨著熒光抑制光束光強(qiáng)的增加而不斷加強(qiáng)。有效激發(fā)面積的減小使得在同一時(shí)刻，只有來自單分子的熒光可能被FCS 系統(tǒng)觀察到，從而使高濃度熒光分子樣品的單分子觀察成為可能，提高了觀察的準(zhǔn)確性。位于有效激發(fā)面積內(nèi)的分子將被激發(fā)產(chǎn)生熒光信號，進(jìn)一步通過大數(shù)值孔徑顯微物鏡進(jìn)行收集并分析處理，得到熒光相關(guān)譜。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果(1)本發(fā)明裝置的結(jié)構(gòu)簡單，實(shí)現(xiàn)方法和原理容易；(2)打破了光學(xué)遠(yuǎn)場衍射極限限制，提高了分辨率；(3)觀察準(zhǔn)確度高，使用范圍有所擴(kuò)大，可在不對樣品進(jìn)行稀釋的前提下對高濃度熒光分子樣品進(jìn)行單分子觀察；(4)成本低廉。


圖1為本發(fā)明的基于介質(zhì)微球的熒光相關(guān)譜分析裝置的第一種實(shí)施方式的示意圖。圖2為本發(fā)明的基于介質(zhì)微球的熒光相關(guān)譜分析裝置的第二種實(shí)施方式的示意圖。圖3為本發(fā)明中徑向偏振光的示意圖。圖4為本發(fā)明中切向偏振光的示意圖。圖5為本發(fā)明中熒光激發(fā)光束經(jīng)由介質(zhì)微球產(chǎn)生的納米噴射的光強(qiáng)分布示意圖。圖6為本發(fā)明中熒光抑制光束經(jīng)由介質(zhì)微球產(chǎn)生的納米噴射的光強(qiáng)分布示意圖。圖7為本發(fā)明中熒光激發(fā)光束經(jīng)由不同折射率的介質(zhì)微球產(chǎn)生的納米噴射沿徑向(X方向)的光強(qiáng)分布曲線圖。圖8為本發(fā)明中熒光激發(fā)光束經(jīng)由不同折射率的介質(zhì)微球產(chǎn)生的納米噴射沿軸向(Z方向)的光強(qiáng)分布曲線圖。圖9為本發(fā)明中熒光抑制光束經(jīng)由不同折射率的介質(zhì)微球產(chǎn)生的納米噴射沿徑向(X方向)的光強(qiáng)分布示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例和附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅限于此。實(shí)施例1如圖1所示，一種基于介質(zhì)微球的熒光相關(guān)譜分析裝置，依次包括產(chǎn)生徑向偏振光Rl和切向偏振光R2的光源、第一顯微物鏡1、介質(zhì)微球2和樣品架5，樣品架5上放置有熒光樣品3，第一顯微物鏡1還連接有用于分析和處理所收集到的熒光信號的計(jì)算機(jī)(在圖 1中并未示出)。其中，徑向偏振光Rl和切向偏振光R2同軸且平行入射，第一顯微物鏡1、 介質(zhì)微球2和熒光樣品3三者均處于徑向偏振光Rl和切向偏振光R2的同軸光路上，且介質(zhì)微球2位于第一顯微物鏡1的物方焦平面上。上述裝置中，產(chǎn)生徑向偏振光Rl和切向偏振光R2的光源，可以為直接發(fā)出徑向偏振光和切向偏振光的光源；也可以為激光光源和偏振轉(zhuǎn)換器的組合，即，由激光光源發(fā)出線偏光并經(jīng)偏振轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換得到徑向偏振光和切向偏振光。所述的偏振轉(zhuǎn)換器可以為現(xiàn)有技術(shù)中實(shí)現(xiàn)圓柱形偏振光的轉(zhuǎn)換的任何器件與裝置，優(yōu)選為瑞典ARCoptix公司的偏振轉(zhuǎn)換器 Radial-Azimuthal Polarization Converter。上述裝置中，第一顯微物鏡1為大數(shù)值孔徑顯微物鏡，可以為非浸沒式或浸沒式， 其中非浸沒式大數(shù)值孔徑顯微物鏡的數(shù)值孔徑為0. 8 0. 95，浸沒式大數(shù)值孔徑顯微物鏡的數(shù)值孔徑為1. 0 1. 4，放大倍率為80 100倍。上述裝置中，介質(zhì)微球2的直徑為1 10um，折射率為1. 4 2。采用上述裝置進(jìn)行熒光相關(guān)譜分析方法如下使用徑向偏振光Rl作為熒光激發(fā)光束，切向偏振光R2作為熒光抑制光束，兩光束 Rl和R2同軸平行入射到第一顯微物鏡1中。圖3和圖4分別為徑向偏振光Rl和切向偏振光R2的示意圖，可見，徑向偏振光Rl 每點(diǎn)的偏振方向都是沿著徑向方向，所有的偏振方向構(gòu)成一個(gè)發(fā)散束；而切向偏振光R2每點(diǎn)的偏振方向都是沿著切線方向，所有點(diǎn)的偏振方向構(gòu)成一個(gè)渦旋。兩光束Rl和R2通過第一顯微物鏡1后，在第一顯微物鏡1的物方焦點(diǎn)附近產(chǎn)生聚焦光場。由于介質(zhì)微球2位于第一顯微物鏡1的物方焦點(diǎn)上，因此，兩光束Rl和R2被同時(shí)聚焦在介質(zhì)微球2上；介質(zhì)微球2對聚焦后的兩光束Rl和R2再次聚焦，在介質(zhì)微球2下表面產(chǎn)生納米噴射現(xiàn)象，詳細(xì)說明如下對于任意形式的入射光，經(jīng)過介質(zhì)微球2的光場分布都可以使用時(shí)域有限元差分 (Finite Difference Time Domain, FDTD)算法對其進(jìn)行精確仿真模擬。對于熒光激發(fā)光束來說，由于它的偏振態(tài)為徑向偏振光R1，計(jì)算結(jié)果表明它的納米噴射現(xiàn)象呈現(xiàn)為一個(gè)實(shí)心亮斑，如圖5所示。在徑向(X方向)和軸向(Z方向)兩個(gè)方向上，光斑的尺寸都小于光學(xué)遠(yuǎn)場衍射極限。進(jìn)一步的計(jì)算表明，它的大小與介質(zhì)微球2的折射率相關(guān)——當(dāng)介質(zhì)微球2的折射率處于1. 4 2區(qū)間時(shí)，隨著介質(zhì)微球2折射率的增加， 納米噴射在徑向(X方向)和軸向(Z方向)兩個(gè)方向上都被進(jìn)一步壓縮。圖7和圖8清晰地描述了這種變化趨勢。如圖7所示為熒光激發(fā)光束經(jīng)由不同折射率的介質(zhì)微球2 (直徑為3um)產(chǎn)生的納米噴射沿徑向(X方向)的光強(qiáng)分布曲線圖；圖8為熒光激發(fā)光束經(jīng)由不同折射率的介質(zhì)微球2 (直徑為3um)產(chǎn)生的納米噴射沿軸向(Z方向)的光強(qiáng)分布曲線圖。
對于熒光抑制光束來說，由于它的偏振態(tài)為切向偏振光R2，F(xiàn)DTD算法計(jì)算結(jié)果表明它的納米噴射現(xiàn)象呈現(xiàn)為一個(gè)空心的暗斑，如圖6所示。暗斑的大小也與介質(zhì)微球2的折射率相關(guān)，但與熒光激發(fā)光束不同，當(dāng)介質(zhì)微球2的折射率處于1. 4 2區(qū)間時(shí)，暗斑的大小并沒有呈現(xiàn)一直縮小的趨勢，它的徑向(X方向)尺寸在折射率等于1.8時(shí)達(dá)到極小值， 如圖9所示。圖9為熒光抑制光束經(jīng)由不同折射率的介質(zhì)微球2 (直徑為3um)產(chǎn)生的納米噴射沿徑向(X方向)的光強(qiáng)分布示意圖。熒光激發(fā)光束的主要作用是對熒光樣品3中的熒光分子進(jìn)行激發(fā)。事實(shí)上由于在上述裝置中由熒光激發(fā)光束產(chǎn)生的納米噴射大小已經(jīng)小于光學(xué)遠(yuǎn)場衍射極限，僅僅使用熒光激發(fā)光束便可以得到比傳統(tǒng)FCS更好的分辨率。盡管如此，此時(shí)的FCS有效激發(fā)區(qū)域在徑向(X方向)和軸向(Z方向)上的大小仍達(dá)到百納米量級，對于高濃度熒光分子樣品來說進(jìn)行單分子分析仍然不夠，因此有必要對FCS有效激發(fā)面積進(jìn)行進(jìn)一步壓縮。熒光抑制光束的主要作用是抑制照射區(qū)域的熒光激發(fā)現(xiàn)象，壓制熒光信號的產(chǎn)生。由于熒光抑制光束通過介質(zhì)微球2產(chǎn)生的納米噴射為中空的暗斑，其與熒光激發(fā)光束產(chǎn)生的納米噴射同時(shí)作用在熒光樣品3上時(shí)，光斑中心點(diǎn)處的熒光激發(fā)不受影響但其周圍區(qū)域的熒光激發(fā)將被壓制，從而使熒光信號僅僅來自于光斑中心點(diǎn)，達(dá)到壓縮FCS有效激發(fā)面積的目的。抑制作用隨著熒光抑制光束光強(qiáng)的增加而增強(qiáng)，可以用公式表述為d = H{a-s[g)其中d為FCS有效激發(fā)面積的徑向(X方向)尺寸，a為拋物線擬合系數(shù)，ζ為熒光抑制光束通過介質(zhì)微球2產(chǎn)生納米噴射的最大光強(qiáng)Isted與熒光激發(fā)光束過介質(zhì)微球2產(chǎn)生納米噴射的最大光強(qiáng)Is的比值，即ζ = Isted/Is通過上述公式可以計(jì)算FCS有效激發(fā)面積的徑向(X方向)尺寸，如當(dāng)介質(zhì)微球2 的大小為3um、折射率為1.8時(shí)，徑向尺寸d約等于50nm。FCS有效激發(fā)面積的軸向(Z方向)尺寸1與熒光激發(fā)光束通過介質(zhì)微球2產(chǎn)生納米噴射的軸向(Z方向)尺寸相等如當(dāng)介質(zhì)微球2的大小為3um、折射率為1. 8時(shí)，軸向尺寸1約等于lOOnm。通過兩種納米噴射的共同作用對熒光樣品3進(jìn)行觀察并激發(fā)熒光信號，熒光信號通過反射再次經(jīng)過第一顯微物鏡1，由第一顯微物鏡1收集并接入與第一顯微物鏡1連接的計(jì)算機(jī)進(jìn)行分析處理，這一過程被稱為“反射模式”。實(shí)施例2如圖2所示，一種基于介質(zhì)微球的熒光相關(guān)譜分析裝置，依次包括產(chǎn)生徑向偏振光Rl和切向偏振光R2的光源、第一顯微物鏡1、介質(zhì)微球2、樣品架5和第二顯微物鏡4，樣品架5上放置有熒光樣品3，第二顯微物鏡4還連接有用于分析和處理所收集到的熒光信號的計(jì)算機(jī)(在圖2中并未示出)。其中，徑向偏振光Rl和切向偏振光R2同軸且平行入射， 第一顯微物鏡1、介質(zhì)微球2、熒光樣品3和第二顯微物鏡4均處于徑向偏振光Rl和切向偏振光R2的同軸光路上，且介質(zhì)微球2位于第一顯微物鏡1的物方焦平面上?？梢?，與實(shí)施例1的裝置相比，本實(shí)施例只是增加了一個(gè)第二顯微物鏡4，第二顯微物鏡4與第一顯微物鏡1參數(shù)完全相同。第二顯微鏡4的作用是收集由熒光樣品3產(chǎn)生的熒光信號。因此，與實(shí)施例1的方法相比，僅僅是在收集熒光信號的步驟有所不同。本實(shí)施例中，熒光信號將不再通過反射再次進(jìn)入第一顯微物鏡1，而是直接透過熒光樣品3被第二顯微物鏡4收集，并接入第二顯微物鏡4連接的計(jì)算機(jī)進(jìn)行分析處理，這一過程被稱為 “透射模式”。為了達(dá)到最佳收集效果，第二顯微物鏡4與第一顯微物鏡1在位置上構(gòu)成共焦關(guān)系。與實(shí)施例1中的“反射模式”相比，本實(shí)施例中的“透射模式”增加了一個(gè)顯微物鏡，因此提高了系統(tǒng)成本；并且，“透射模式”僅僅適用于熒光樣品3為透明樣品的情況，而 “反射模式”則無此限制。本發(fā)明方法和裝置在不做任何改動的情況下，也可以適用于單分子雙光子熒光相關(guān)譜分析的應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種基于介質(zhì)微球的熒光相關(guān)譜分析方法，其特征在于，包括以下步驟(1)使用徑向偏振光作為熒光激發(fā)光束，切向偏振光作為熒光抑制光束，將所述的熒光激發(fā)光束和熒光抑制光束同軸平行入射到顯微物鏡中，并被所述的顯微物鏡同時(shí)聚焦在介質(zhì)微球上；所述的介質(zhì)微球位于所述的顯微物鏡的物方焦平面上，所述的介質(zhì)微球直徑為 1 10um，折射率為1. 4 2 ；(2)所述的介質(zhì)微球?qū)?jīng)步驟(1)中顯微物鏡聚焦后的熒光激發(fā)光束和熒光抑制光束進(jìn)行再次聚焦，在所述的介質(zhì)微球下表面產(chǎn)生納米噴射；(3)將步驟(2)所產(chǎn)生的納米噴射作用于熒光樣品并激發(fā)熒光信號；(4)收集步驟C3)所激發(fā)的熒光信號并進(jìn)行分析處理，得到熒光相關(guān)譜。
2.如權(quán)利要求1所述的基于介質(zhì)微球的熒光相關(guān)譜分析方法，其特征在于，步驟(1)所述的顯微物鏡為非浸沒式大數(shù)值孔徑顯微物鏡或浸沒式大數(shù)值孔徑顯微物鏡，所述的非浸沒式大數(shù)值孔徑顯微物鏡的數(shù)值孔徑為0. 8 0. 95，所述的浸沒式大數(shù)值孔徑顯微物鏡的數(shù)值孔徑為1. O 1. 4，放大倍率為80 100倍。
3.如權(quán)利要求1所述的基于介質(zhì)微球的熒光相關(guān)譜分析方法，其特征在于，步驟(4) 中，通過顯微物鏡來收集步驟C3)所激發(fā)的熒光信號。
4.用于實(shí)現(xiàn)如權(quán)利要求1 3任一所述的基于介質(zhì)微球的熒光相關(guān)譜分析方法的裝置，其特征在于，依次包括光源、第一顯微物鏡、介質(zhì)微球、樣品架和第二顯微物鏡，還包括與第二顯微物鏡連接的熒光信號分析處理裝置；其中，所述的光源，用于產(chǎn)生平行入射的同軸的徑向偏振光和切向偏振光；所述的第一顯微物鏡，用于對所述的徑向偏振光和切向偏振光進(jìn)行聚焦；所述的介質(zhì)微球，用于對經(jīng)第一顯微物鏡聚焦后的徑向偏振光和切向偏振光進(jìn)行再次聚焦，產(chǎn)生納米噴射；所述的樣品架， 用于放置待觀察的熒光樣品，所述的熒光樣品在所述的納米噴射的作用下激發(fā)產(chǎn)生熒光信號；所述的第二顯微物鏡，用于收集所述的熒光信號；所述的熒光信號分析處理裝置，用于分析和處理所收集到的熒光信號；所述的第一顯微物鏡、介質(zhì)微球、放置在樣品架上的待觀察的熒光樣品和第二顯微物鏡均位于所述的徑向偏振光和切向偏振光的同軸光路上，所述的介質(zhì)微球位于所述的第一顯微物鏡的物方焦平面上，所述的介質(zhì)微球直徑為1 lOum，折射率為1. 4 2。
5.如權(quán)利要求4所述的裝置，其特征在于，所述的第一顯微物鏡為非浸沒式大數(shù)值孔徑顯微物鏡或浸沒式大數(shù)值孔徑顯微物鏡，所述的非浸沒式大數(shù)值孔徑顯微物鏡的數(shù)值孔徑為0. 8 0. 95，所述的浸沒式大數(shù)值孔徑顯微物鏡的數(shù)值孔徑為1. O 1. 4，放大倍率為 80 100倍。
6.如權(quán)利要求4所述的裝置，其特征在于，所述的第二顯微物鏡為非浸沒式大數(shù)值孔徑顯微物鏡或浸沒式大數(shù)值孔徑顯微物鏡，所述的非浸沒式大數(shù)值孔徑顯微物鏡的數(shù)值孔徑為0. 8 0. 95，所述的浸沒式大數(shù)值孔徑顯微物鏡的數(shù)值孔徑為1. O 1. 4，放大倍率為 80 100倍。
7.如權(quán)利要求4所述的裝置，其特征在于，所述的第二顯微物鏡與第一顯微物鏡為同一顯微物鏡。
8.如權(quán)利要求4所述的裝置，其特征在于，所述的第二顯微物鏡與第一顯微物鏡的參數(shù)完全相同，并在位置上構(gòu)成共焦關(guān)系。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于介質(zhì)微球的熒光相關(guān)譜分析方法和裝置，該方法使用徑向偏振光和切向偏振光分別作為熒光激發(fā)光束和熒光抑制光束，依次通過顯微物鏡的聚焦和介質(zhì)微球的納米噴射后，再作用于熒光樣品并激發(fā)熒光信號，通過對熒光信號的收集和分析處理完成熒光相關(guān)譜分析。該裝置依次包括產(chǎn)生徑向偏振光和切向偏振光的光源、第一顯微物鏡、介質(zhì)微球、放置有熒光樣品的樣品架和第二顯微物鏡，還包括與第二顯微物鏡連接的熒光信號分析處理裝置。第一顯微物鏡、介質(zhì)微球、熒光樣品和第二顯微物鏡均處于徑向偏振光和切向偏振光的同軸光路上，且介質(zhì)微球位于第一顯微物鏡的物方焦平面上。本發(fā)明可以有效應(yīng)用于高濃度熒光分子樣品中。
文檔編號G01N21/64GK102305782SQ20111022843
公開日2012年1月4日 申請日期2011年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月10日
發(fā)明者劉旭, 匡翠方, 王婷婷, 郝翔 申請人:浙江大學(xué)