基于熒光微球免疫層析法檢測t-2毒素的產(chǎn)品及其制備方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬于食品安全檢測領域，涉及一種基于熒光微球免疫層析法檢測T-2毒素的產(chǎn)品及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]T-2毒素是由多種鐮刀菌(三線鐮刀菌為主)產(chǎn)生的一種A類單端孢霉烯族倍半萜烯類霉菌毒素。該毒素廣泛污染小麥、大麥、玉米等谷物及其制品，可通過食物鏈的富集作用和體內(nèi)蓄積作用，最終對動物和人類健康造成潛在威脅。文獻顯示，T-2毒素已在全球范圍內(nèi)廣泛出現(xiàn)，在我國谷物中的檢出率達80%。T-2毒素具有較強的毒性，研究表明，其毒素能夠引起人和動物多個系統(tǒng)的毒性效應。包括抑制蛋白質(zhì)、DNAjP RNA的合成，誘導細胞凋亡，引起白細胞減少，造成血液毒性和免疫損傷等。人畜誤食被大量毒素污染的谷物或飼料后，會引發(fā)多種急慢性中毒。表現(xiàn)為，嘔吐、腹瀉食道病變、造血組織嚴重損傷、神經(jīng)機能障礙和免疫抑制等。目前，已有多個國家制定了 T-2毒素的殘留限量標準。在我國，由于監(jiān)測標準的缺乏，國內(nèi)未能形成健全的T-2毒素安全性評價方案，僅有GB21693-2008《配合飼料中T-2毒素的允許量》中規(guī)定豬配合飼料和禽配合飼料中T-2毒素的允許量< Img/
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[0003]國內(nèi)外有關(guān)T-2的檢測方法有液相色譜法、氣相色譜法和色譜聯(lián)用法等儀器分析方法。這類儀器分析方法準確、穩(wěn)定、靈敏，但耗時、設備昂貴，前處理方法繁瑣，需要專業(yè)人員操作，不適用實際生產(chǎn)生活中。此外，快捷簡便且靈敏的免疫檢測技術(shù)是目前市場上應用最廣泛的，主要有酶聯(lián)免疫吸附法、免疫層析法等。相比較而言，免疫層析方法簡單快速，結(jié)果直觀，且不需要專業(yè)分析人員，特別適合現(xiàn)場監(jiān)測。
[0004]熒光微球是指將熒光團通過包埋、共價鍵連接等方式引入有機或無機納米粒子中，并讓納米粒子承擔有機小分子焚光染料的檢測、標記等功能，具有相對穩(wěn)定的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及發(fā)光行為。在熒光染料標記技術(shù)的基礎上，建立起熒光微球標記層析檢測技術(shù)，兼具ELISA和膠體金試紙條的快速、穩(wěn)定、操作簡便等優(yōu)點。同時與膠體金免疫層析技術(shù)相比，又具有其自身優(yōu)點:(1)而熒光微球?qū)游黾夹g(shù)由于使用的示蹤物為熒光微球，在激發(fā)光的照射下存在一個信號放大的過程，所以其靈敏度較膠體金試紙條要高；(3)熒光微球檢測試紙條能夠通過熒光讀數(shù)儀進行定量檢測，能夠有效提高免疫層析檢測的靈敏度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個目的是提供一種基于熒光微球免疫層析法檢測T-2毒素的產(chǎn)品。
[0006]本發(fā)明所提供的基于熒光微球免疫層析法檢測T-2毒素的產(chǎn)品，可為如下ASB:
[0007]A、由試紙條和經(jīng)熒光微球標記的T-2毒素抗體組成；
[0008]所述試紙條由依次連接并固定于底板上的樣品墊、設有檢測線和質(zhì)控線的層析膜，以及吸水墊組成；
[0009]所述檢測線和所述質(zhì)控線相互分離；
[0010]所述檢測線處包被有T-2毒素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物；
[0011]所述質(zhì)控線處包被有二抗，所述二抗為抗所述經(jīng)熒光微球標記的T-2毒素抗體的抗體；
[0012]所述檢測線位于所述層析膜靠近所述樣品墊的一端；
[0013]所述質(zhì)控線位于所述層析膜靠近所述吸水墊的一端；
[0014]B、由含有A中所述試紙條的試劑盒和所述經(jīng)熒光微球標記的T-2毒素抗體組成；
[0015]所述試劑盒由所述試紙條和與所述試紙條扣合且符合如下條件的蓋板組成:所述蓋板上具有與所述樣品墊對應的加樣窗口，以及與所述檢測線和所述質(zhì)控線對應的顯示窗
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[0016]在所述產(chǎn)品中，“所述T-2毒素與載體蛋白的偶聯(lián)物”中的“所述T-2毒素半抗原”具體可為3-琥?白酰-T-2 ;“所述載體蛋白”具體可為卵清蛋白(ovalbumin, OVA)。
[0017]在本發(fā)明中，由3-琥?白酰-T-2和卵清蛋白(ovalbumin, OVA)形成偶聯(lián)物的偶聯(lián)比為10.8:1 (卵清蛋白:3_琥珀酰-T-2的物質(zhì)的量比)。
[0018]該偶聯(lián)物具體是按照包括如下步驟的方法制備獲得的:
[0019]a)按照如下制備半抗原3-琥珀酰-T-2 (3-HS-T-2):al)將T_2毒素溶于吡啶，加入琥珀酸酐并置于沸水浴中攪拌反應4h，后蒸干吡啶；其中，所述T-2毒素、所述吡啶和所述琥泊酸酐的配比為1mg:0.4mL:210mg ;a2)向步驟al)的殘渣中加入氯仿復溶，再用去離子水洗滌，去除雜質(zhì)，保留氯仿層，洗滌過程重復4次；其中，所述氯仿的用量與步驟al)中所述T-2毒素的用量配比為5mL:10mg ;a3)將步驟a2)中的溶液蒸干，即得所述半抗原
3-琥珀酰-T-2。
[0020]b)按照如下制備包被原(3-HS-T-2-0VA):bl)向步驟a)制備的所述半抗原3_琥珀酰-T-2中加入DMF，震蕩溶解，得到A液；其中，所述DMF的用量與步驟al)中所述T-2毒素的用量配比為ImL: 1mg ;將卵清蛋白(OVA)和1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)溶于磷酸鹽緩沖液中，得到B液；其中，所述卵清蛋白(0VA)、所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)_碳二亞胺(H)C)和所述磷酸鹽緩沖液的配比為25mg:15mg:5mL ;所述磷酸鹽緩沖液的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下=KH2PO40.27g/L，Na2HPO4.12H20 2.86g/L，KCl 0.2g/L，NaCl 8.8g/L ；b2)將所述A液和所述B液混勻，室溫(20-25°C )攪拌過夜(12_16h) ；b3)將步驟2)的反應液裝入半透膜中，在所述磷酸鹽緩沖液中透析3天，每天更換3次透析液，獲得所述包被原。
[0021]當然所述卵清蛋白可以替換為其他載體蛋白，只要確保所述偶聯(lián)物具有對T-2毒素的抗原性即可。
[0022]在所述產(chǎn)品中，所述熒光微球標記的T-2毒素抗體為將待標記的T-2毒素抗體和所述熒光微球以酰胺鍵共價結(jié)合形成的聚合體。
[0023]其中，所述熒光微球為表面修飾有羧基官能團，內(nèi)部包埋有熒光物質(zhì)的納米粒子，直徑為200nm，其變異系數(shù)為5% ;所述熒光微球的最大激發(fā)和發(fā)射波長分別為580nm和605nmo
[0024]在本發(fā)明的一個實施例中，所述熒光微球具體是以含有所述熒光微球的懸濁液的形式呈現(xiàn)的，其固體含量為2%，即每ImL所述懸濁液中含有所述熒光微球0.02g，余量為超純水。更加具體的，所述焚光微球為Thermo Fisher Scientific Inc.產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為 F-8887。
[0025]所述T-2毒素抗體既可為T-2毒素單克隆抗體也可為T-2毒素多克隆抗體。在本發(fā)明的一個實施例中，所述T-2毒素抗體為T-2毒素單克隆抗體，具體為鼠源T-2毒素單克隆抗體，具體為北京維德維康生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為T-2-3D1-F1。相應的，所述二抗為抗鼠IgG的抗體，具體為羊抗鼠IgG的多克隆抗體，具體為北京維德維康生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。
[0026]所述經(jīng)熒光微球標記的T-2毒素抗體按照包括如下步驟的方法制備:將所述T-2毒素抗體和所述熒光微球以6 μ g:20 μ L (相當于0.4mg熒光微球)的比例進行反應得到以酰胺鍵共價結(jié)合形成的熒光微球與T-2毒素抗體的偶聯(lián)物。
[0027]在所述經(jīng)熒光微球標記的T-2毒素抗體的制備方法中，所述反應具體為:將所述T-2毒素抗體和所述熒光微球以6 μ g:20 μ L(相當于0.4mg熒光微球)的比例加入到標記緩沖液中，室溫(20-25°C )避光振蕩15min ;加入偶聯(lián)活化劑1_乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)，室溫(20-25°C )避光振蕩反應2h ;接著加入牛血清白蛋白溶液室溫(20-25°C )避光振蕩15min ;離心，所得沉淀用復溶液復溶；再離心，所得沉淀中即含有所述經(jīng)熒光微球標記的T-2毒素抗體。
[0028]所述標記緩沖液的pH值為6.5，溶質(zhì)為嗎啉乙磺酸，溶劑為水；所述嗎啉乙磺酸在所述標記緩沖液中的濃度為0.05M。
[0029]所述牛血清白蛋白溶液的溶劑為水，溶質(zhì)為牛血清白蛋白；所述牛血清白蛋白在所述牛血清白蛋白溶液10mL中的含量為20g。
[0030]所述復溶液的溶劑為0.02M磷酸緩沖液，溶質(zhì)為牛血清白蛋白、葡聚糖(Dextran40000)和聚乙二醇(PEG 20000);所述牛血清白蛋白在所述復溶液中的濃度為10g/L，所述Dextran 40000在所述復溶液中的濃度為20g/L，所述PEG 20000在所述復溶液中的濃度為lg/L。所述0.02M磷酸緩沖液的組成如下??每IL所述0.02M磷酸緩沖液中含有 Na2HPO4.12H20 5.37g，NaH2PO4.2H20 0.78g，余量為水。
[0031]其中，所述T-2毒素抗體與所述標記緩沖液的使用配比為6 μ g =ImL0所述偶聯(lián)活化劑1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)用量為0.4mg/20yL所述熒光微球(相當于0.4mg熒光微球)。所述牛血清白蛋白溶液的用量為20 μ L/20 μ L所述熒光微球(相當于0.4mg焚光微球)。所述離心的轉(zhuǎn)速為12857g，時間為lOmin。所述離心的次數(shù)為2次。
[0032]在本發(fā)明的一個實施例中，具體是按照包括如下步驟的方法制備獲得所述經(jīng)熒光微球標記的T-2毒素抗體的:將6 μ g所述T-2毒素抗體和20 μ L所述熒光微球(固體含量為2%，相當于0.4mg熒光微球)加入到所述標記緩沖液中，室溫(20-25°C )避光振蕩15min ;加入0.4mg偶聯(lián)活化劑1-乙基_(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)，室溫(20-250C )避光振蕩反應2h ;接著加入20 μ L所述牛血清白蛋白溶液，室溫(20_25°C )避光振蕩15min ;12857g離心lOmin，所得沉淀用所述復溶液復溶；再12857g離心lOmin，所得沉淀中即含有所述經(jīng)熒光微球標記的T-2毒素抗體。
[0033]在本發(fā)明中，所述樣品墊的材質(zhì)為聚酯纖維膜；所述層析膜的材質(zhì)為硝酸纖維素膜；所述吸水墊的材質(zhì)為植物纖維吸濾紙；所述底板的材質(zhì)為PVC膠粘板。
[0034]上述基于熒光微球免疫層析法檢測T-2毒素的產(chǎn)品可按照如下所述方法制備。
[0035]本發(fā)明所提供的基于熒光微球免疫層析法檢測T-2