專利名稱：副溶血弧菌免疫金快速檢測(cè)試紙的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種副溶血弧菌免疫金快速檢測(cè)試紙的制備方法。
背景技術(shù)：
副溶血性弧菌均屬弧菌科弧菌屬，是通過食物、水傳播的病原菌。副溶血性弧菌具有相似的生物學(xué)特性和同樣的致病性，均可引起腹瀉和食物中毒。副溶血弧菌最早是由Fujino等于1953年從日本一個(gè)食物中毒患者初次分離得到的，又稱嗜鹽菌，該菌因在含食鹽較濃(39Γ4%以上)的培養(yǎng)基中能生長(zhǎng)，而在不含鹽的培養(yǎng)基內(nèi)不能繁殖而得名。副溶血弧菌分布于世界各地，通常存在于海灣和海岸線區(qū)域以及海產(chǎn)品中，人多因食用污染本菌又未經(jīng)良好加工的海產(chǎn)品如蟹類、牡蠣！蝦等而引起食物中毒。副溶血弧菌引起的食物中毒，在細(xì)菌性食物中毒中占的比例很高，其危害僅次于沙門氏菌、大腸桿菌、葡萄球菌和肉毒梭菌。我國(guó)沿海地區(qū)每年都有因副溶血性弧菌引起食物中毒的報(bào)道。人中毒后的基本癥狀包括腹泄(呈水樣便或血樣便)、腹部痙攣、惡心、嘔吐和頭疼，也曾有發(fā)燒和發(fā)冷的報(bào)道，但較少。目前，美國(guó)和歐盟對(duì)進(jìn)口水產(chǎn)品都強(qiáng)制性要求進(jìn)行副溶血弧菌的檢測(cè)，檢驗(yàn)結(jié)果為陰性方可通關(guān)，否則出口的水產(chǎn)品將被全部自動(dòng)扣留或就地銷毀。這給我國(guó)水產(chǎn)品的出口設(shè)置了技術(shù)壁壘。因此，出口水產(chǎn)品加工廠認(rèn)真貫徹HACCP計(jì)劃，加強(qiáng)對(duì)副溶血弧菌的檢測(cè)，檢疫部門加強(qiáng)對(duì)工廠落實(shí)HACCP計(jì)劃情況的監(jiān)管和對(duì)出口水產(chǎn)品的檢驗(yàn)就顯得尤其重要。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于副溶血性弧菌的檢測(cè)已經(jīng)有了相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，方法大致分為以下幾個(gè)過程⑴前增菌；⑵選擇性增菌；⑶選擇性培養(yǎng)；⑷生化鑒定；(5) 神奈川現(xiàn)象和血清學(xué)實(shí)驗(yàn)。檢驗(yàn)過程需要5d-6d才能報(bào)告陽(yáng)性結(jié)果。檢驗(yàn)方法繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不僅影響檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的工作效率，而且使生產(chǎn)部門的產(chǎn)品運(yùn)輸和倉(cāng)儲(chǔ)時(shí)間延長(zhǎng)，生產(chǎn)成本加大。膠體金快速診斷試紙法是20世紀(jì)九十年代以來(lái)在單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新型體外診斷技術(shù)。操作簡(jiǎn)單，僅須將待檢樣品滴加到樣品槽中即可，過10幾分鐘就可根據(jù)顏色判斷結(jié)果，達(dá)到檢測(cè)的目的。該方法不需要特殊的儀器，一般技術(shù)人員即可完成，而且檢測(cè)成本低，可大大減少工作量，適應(yīng)于口岸快速檢測(cè)的需要。因此，盡快建立一套快速檢測(cè)副溶血性弧菌的準(zhǔn)確、可靠、科學(xué)的膠體金快速診斷試紙法勢(shì)在必行。這對(duì)于加強(qiáng)進(jìn)出口水產(chǎn)品中弧菌的快速檢驗(yàn)檢疫、水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的調(diào)查和防治、無(wú)公害水產(chǎn)品檢測(cè)和生產(chǎn)以及水產(chǎn)品衛(wèi)生質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)等方面都具有十分重要的意義。有鑒于此，本發(fā)明提供一種副溶血弧菌的免疫金快速檢測(cè)試紙的制備方法，以建立簡(jiǎn)便、快速的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在以副溶血性弧菌為材料，制備多抗，利用先進(jìn)的膠體金生產(chǎn)工藝來(lái)研制檢測(cè)副溶血性弧菌標(biāo)檢測(cè)試紙。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的解決方案如下
副溶血弧菌免疫金快速檢測(cè)試紙的制備方法，包括以下步驟
a)副溶血弧菌抗原的制備用蛋白胨水培養(yǎng)基將副溶血弧菌培養(yǎng)過夜；
b)制得副溶血弧菌滅活疫苗；
c)用疫苗免疫實(shí)驗(yàn)兔制備多價(jià)抗血清采用皮下多點(diǎn)注射和靜脈直接注射免疫兔子制備兔抗副溶血弧菌多抗抗體，分別得到皮下多點(diǎn)注射制備的兔抗副溶血弧菌抗體(簡(jiǎn)稱為兔抗-1，下同)和靜脈直接注射制備的兔抗副溶血弧菌抗體(簡(jiǎn)稱為兔抗-2，下同)；
d)抗血清純化；
e)膠體金標(biāo)記將純化的兔抗血清膠體金進(jìn)行標(biāo)記；
f)免疫金試紙條的制備先將步驟d)中純化的兔抗-2噴在微孔濾膜檢測(cè)線上，羊抗兔抗體噴在對(duì)照線上，再將步驟e)中制備的膠體金標(biāo)記的兔抗-1噴在玻璃纖維膜上，然后組裝成免疫金試紙條；
所述的步驟b)，制得副溶血弧菌滅活疫苗，具體為先經(jīng)過0. 3%的甲醛37°C滅活Mh， 然后經(jīng)培養(yǎng)檢測(cè)確實(shí)無(wú)活菌后作為抗原；
所述的步驟c)，用疫苗免疫實(shí)驗(yàn)兔制備多價(jià)抗血清，采用皮下多點(diǎn)注射和靜脈直接注射免疫兔子制備兔抗副溶血弧菌多抗抗體，具體為
1)靜脈注射免疫每10天注射一次，首次lmL，第二次1.5mL，第三次2mL，第四次3mL， 當(dāng)效價(jià)達(dá)到1 :1280或1 2560時(shí)放血；
2)弗氏佐劑皮下多點(diǎn)注射免疫弗氏完全佐劑與菌液等體積混合后，兔頸背部皮下多點(diǎn)注射4mL，2周后，用弗氏不完全佐劑與菌液等體積混合液頸背部皮下多點(diǎn)注射4mL，2周后，采血前5-7天靜脈注射4mL，當(dāng)效價(jià)達(dá)到1 :1280或1 :2560時(shí)放血。所述的步驟f )，免疫金試紙條的制備，具體為
用膠體金標(biāo)記兔抗-1，建立膠體金免疫層析技術(shù)快速檢測(cè)副溶血弧菌的方法；應(yīng)用微孔濾膜作載體的免疫檢測(cè)技術(shù)，先將兔抗-2噴在微孔濾膜檢測(cè)線上，羊抗兔抗體噴在對(duì)照線上，膠體金標(biāo)記的兔抗-1噴在玻璃纖維膜上，干燥后加入封閉液混合，烘干液體后組裝成檢測(cè)副溶血弧菌；再通過金顆粒放大免疫反應(yīng)系統(tǒng)，使反應(yīng)結(jié)果在固相載體微孔濾膜上顯示出來(lái)。上述封閉液配方采用含有1% (W/V)酪蛋白和0. 05% (V/V) Tween -20的濃度為 0. 01 mol/L的PBS溶液，PBS溶液的pH值為7. 2。副溶血弧菌免疫金快速檢測(cè)試紙的制備方法，所制備的免疫金快速檢測(cè)試紙用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)時(shí)，將試紙條平放在桌面上，在加樣端加上IOOuL的樣品，樣品首先溶解噴在玻璃纖維膜上的金標(biāo)兔抗-1，然后溶液往NC膜移動(dòng)，當(dāng)遇到檢測(cè)線(T)的兔抗-2時(shí)，判斷試紙檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)如下
樣品中含有副溶血弧菌在檢測(cè)線和對(duì)照線(C)上均顯現(xiàn)一條紫紅色線(形成夾心反應(yīng)，即金標(biāo)兔抗-1一副溶血弧菌一兔抗-2)；
樣品中不含有副溶血弧菌只在對(duì)照線上出現(xiàn)一條紫紅色線； 試紙無(wú)效檢測(cè)線和對(duì)照線上均不出現(xiàn)一條紫紅色線。
本發(fā)明的有益效果如下
采用本方法副溶血弧菌免疫金快速檢測(cè)試紙的操作簡(jiǎn)便、快速，不需特殊儀器設(shè)備， 檢測(cè)線上的紫紅色反應(yīng)線色澤鮮艷，易于判斷，且檢測(cè)結(jié)果可以保存。通過應(yīng)用該試紙條法對(duì)150份樣品的檢測(cè)，結(jié)果試紙條法陽(yáng)性率為2%，細(xì)菌分離檢測(cè)陽(yáng)性率為2%，兩者符合率達(dá) 100%。本發(fā)明選用的副溶血弧菌抗原免疫原性好，免疫兔子制得的抗體凝集效價(jià)達(dá)到211-212，用膠體金標(biāo)記組成檢測(cè)試紙條用于檢測(cè)副溶血弧菌，具有特異性強(qiáng)，靈敏性高，操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，結(jié)果易于判斷，且與溶藻弧菌、大腸桿菌、沙門氏菌、哈維氏菌和不發(fā)生交叉反應(yīng)。該方法的成功研制，能夠簡(jiǎn)單快速檢測(cè)副溶血弧菌。采用本發(fā)明副溶血弧菌免疫金快速檢測(cè)試紙的檢測(cè)技術(shù)具有簡(jiǎn)單、靈敏、快速、特異的優(yōu)點(diǎn)，能大大方便口岸進(jìn)出口貨物的通關(guān)速度，同時(shí)由于該檢測(cè)試紙價(jià)格低廉、不需要儀器設(shè)備、操作簡(jiǎn)便快速、結(jié)果容易判斷。這對(duì)于預(yù)防和控制我國(guó)水產(chǎn)品安全具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前未見國(guó)內(nèi)外利用免疫膠體金技術(shù)檢測(cè)進(jìn)出口水生動(dòng)物及其產(chǎn)品中副溶血性弧菌的報(bào)道，該技術(shù)有望為出入境副溶血性弧菌的檢測(cè)提供一種快速靈敏、簡(jiǎn)便可靠的方法， 特別適合口岸檢疫部門實(shí)施快速驗(yàn)放需要。
具體實(shí)施例方式1、本實(shí)施例首先制備副溶血弧菌滅活菌液
用0. 3%的甲醛滅活副溶血弧菌的培養(yǎng)液，經(jīng)檢測(cè)無(wú)存活細(xì)菌，將該細(xì)菌以含量16億個(gè)菌/每毫升免疫家兔，采用靜脈直接注射免疫和皮下多點(diǎn)注射免疫兩種方式，按文獻(xiàn)采用抗原吸收法封閉混合抗體與其他腸道桿菌的交差反應(yīng)，低溫保存。2、兔抗副溶血弧菌抗體的制備
將滅活的菌液采用靜脈注射和弗氏佐劑免疫，具體免疫程序如下
1)靜脈注射免疫每10天注射一次，首次lmL，第二次1.5mL，第三次2mL，第四次3mL， 當(dāng)效價(jià)達(dá)到1 :1280或1 2560時(shí)放血；
2)弗氏佐劑皮下多點(diǎn)注射免疫弗氏完全佐劑與菌液等體積混合后，兔頸背部皮下多點(diǎn)注射4mL，2周后用弗氏不完全佐劑與菌液等體積混合液頸背部皮下多點(diǎn)注射4mL，2周后采血前5-7天靜脈注射4mL，當(dāng)效價(jià)達(dá)到1 :1280或1 :2560時(shí)放血；
3)凝集效價(jià)采用玻片凝集實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兔抗副溶血弧菌抗體效價(jià)，兔抗副溶血弧菌抗體純化后佐劑免疫的濃度為觀.72 mg/mL,玻片凝集試驗(yàn)效價(jià)為1 211，靜脈注射免疫的濃度為28. 72 mg/mL,玻片凝集試驗(yàn)效價(jià)為1:27 ；
3、兔抗副溶血弧菌抗體膠體金的制備
1)膠體金溶液的制備用檸檬酸三鈉還原法制備，取1%(W/V)氯金酸1mL加入到99 mL 超純水中，所得氯金酸溶液濃度為0. 01 (V/V)%，用水浴磁力攪拌鍋加熱至沸騰，在磁力攪拌器以一定轉(zhuǎn)速不斷攪拌下迅速加入2 mL的1%檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)攪拌加熱約15 min 至溶液顏色穩(wěn)定不變。此法制得的膠體金呈葡萄酒色，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)其吸收峰在520 nm處，得到的膠體金顆粒直徑約為20 nm左右，冷卻后置4°C冰箱避光保存；
2)兔抗-1標(biāo)記取需制備量的膠體金溶液，用0.1mol/L K2CO3和0. 1 mol/L的HCl 調(diào)其PH至8. 5。然后在磁力攪拌下逐滴加入純化的兔抗-1 (用佐劑免疫的兔抗體標(biāo)金，每 mL膠體金溶液加入兔抗-1 16. 7ug)，繼續(xù)磁力攪拌30 min后加入5% (W/V) PEG (MW 6000)至終濃度0. 1%(W/V)，再繼續(xù)攪拌15 min，最后放置4°C冰箱，靜置過夜。次日將標(biāo)記好的兔抗-1膠體金4000 r/min離心lOmin，取上清液15000 r/min離心30 min,小心吸棄上清。 沉淀用重懸緩沖液(含 1% 酪蛋白，0.05% (ff/V) PEG6000,0. 05%(V/V)Tween-20,0. 01 mol/ L pH7. 2的PBS緩沖液)恢復(fù)至原體積的二十分之一，置4°C冰箱備用； 4、反應(yīng)試紙條的制作
反應(yīng)試紙制成大小為5. 0 cm-6. OcmX0. 4cm-0. 6 cm左右的試紙條，具體組成為最底層為PVC膠板，試紙條的上端為吸水紙，下端為結(jié)合了膠體金的玻璃纖維膜和樣品墊，中間為硝酸纖維素膜(NC膜)，其中靠上端噴上了質(zhì)控試劑，如羊抗兔抗體，靠下端噴上了兔抗-2，試紙條表面覆蓋了一層薄膜，起保護(hù)作用。所制備的免疫金快速檢測(cè)試紙用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)時(shí)，將試紙條平放在桌面上，在加樣端加上IOOuL的樣品，樣品首先溶解噴在玻璃纖維膜上的金標(biāo)兔抗-1，然后溶液往NC膜移動(dòng)，當(dāng)遇到檢測(cè)線(T)的兔抗-2時(shí)，若樣品中含有副溶血弧菌，則形成夾心反應(yīng)，即金標(biāo)兔抗-1一副溶血弧菌一兔抗-2，在檢測(cè)線和對(duì)照線(C)上均顯現(xiàn)一條紫紅色線，若樣品中不含有副溶血弧菌，則只在對(duì)照線上出現(xiàn)一條紫紅色線，若檢測(cè)線和對(duì)照線均不出現(xiàn)一條紫紅色線，那么該試紙條為無(wú)效試紙條。實(shí)施例1
兔抗副溶血弧菌抗體標(biāo)記，取需制備量的膠體金溶液，用0. 1 mol/L K2CO3和0.1 mol/ L的HCl調(diào)其pH至8. 5。然后在磁力攪拌下逐滴加入純化的兔抗副溶血弧菌抗體(用佐劑免疫的兔抗體標(biāo)金，每HiL膠體金溶液加入兔抗副溶血弧菌抗體16. 7ug),繼續(xù)磁力攪拌30 min后加入5%PEG(MW 6000)至終濃度0. 1%，再繼續(xù)攪拌15 min，最后放置4°C冰箱，靜置過夜。次日將標(biāo)記好的兔抗副溶血弧菌抗體膠體金4000 r/min離心lOmin，取上清液15000 r/min離心30 min，小心吸棄上清。沉淀用重懸緩沖液(含1%酪蛋白，0.05% PEG6000，0. 05% Tween-20,0. 01 mol/L pH7. 2的PBS緩沖液)恢復(fù)至原體積的二十分之一，置4°C冰箱備用。實(shí)施例2
反應(yīng)試紙條組成為大小為5. 0 cnT6. 0cm X0. 4cm^0. 6 cm左右，具體組成為最底層為PVC膠板，試紙條的上端為吸水紙，下端為結(jié)合了膠體金的玻璃纖維膜和樣品墊，中間為硝酸纖維素膜(NC膜)，其中靠上端噴上了質(zhì)控試劑，如羊抗兔IgG或SPA，靠下端噴上了兔抗-2，試紙條表面覆蓋了一層薄膜，起保護(hù)作用。實(shí)施例3
封閉液的配方選擇實(shí)驗(yàn)
包被有T、C線的NC膜分別用以下8種封閉液進(jìn)行封閉
(1)1%BSA、0. 5%Tween-20 的 0. 01mol/L ρΗ7· 2 的 PBS
(2)0. 5%BSA、0. 5%Tween-20 的 0· 01 mol/L ρΗ7· 2 的 PBS
(3)1%BSA、0. 05%Tween-20 的 0. 01 mol/L ρΗ7· 2 的 PBS
(4)0. 5%BSA、0. 05%Tween-20 的 0. 01 mol/L ρΗ7· 2 的 PBS ；
(5)l%casein、0. 5%Tween-20 的 0· 01 mol/L ρΗ7· 2 的 PBS ；
(6)0. 5% casein,0. 5%Tween-20 的 0· 01 mol/L ρΗ7· 2 的 PBS ；
(7)1% casein,0. 05% Tween -20 的 0. 01 mol/L ρΗ7· 2 的 PBS;
(8)0. 5% casein,0. 05%Tween -20 的 0· 01 mol/L pH7. 2 的 PBS。
經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)測(cè)試，得到結(jié)果為采用用含1% casein,0. 05%Tween -20的0. 01 mol/L pH7. 2的PBS封閉效果最好，斑點(diǎn)顯色清楚，背景較淺。實(shí)施例4
通過檢測(cè)線包被兔抗-2的抗體濃度為0,24. 32,48. 64,72. 96,97. 28、121. 6mg/ml的6 個(gè)濃度梯度，膠體金兔抗-1的體積為標(biāo)記時(shí)膠體金體積的1/5、1/10、1/15、和1/20時(shí)，組合組裝成方陣試紙條，然后用2倍系列稀釋的副溶血弧菌菌懸液進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果檢測(cè)線兔抗-2濃度為72. 96mg/ml以上檢測(cè)線顯色較清楚；膠體金兔抗_1的體積為標(biāo)記時(shí)膠體金體積的1/15時(shí)，檢測(cè)線、對(duì)照線顯色較清楚且背景顏色較淺。因此最終確定試紙條的檢測(cè)線兔抗-2的濃度為72. 96mg/ml，膠體金兔抗-1稀釋為標(biāo)記前體積的1/15，靈敏度可達(dá)到 2. 6X103cfu/mlo同樣的，對(duì)照線包被葡萄球菌A蛋白，濃度為0、2、4、6、8、10mg/ml的6個(gè)濃度梯度，再用前面確定的膠體金兔抗-1濃度進(jìn)行反應(yīng)，最后得出對(duì)照線包被葡萄球菌A蛋白的最低濃度為6mg/ml。對(duì)照線包被羊抗兔IgG，濃度為2、3、4、5、6、7 mg/ml的6個(gè)濃度梯度，再用前面確定的膠體金兔抗-1濃度進(jìn)行反應(yīng)，最后得出對(duì)照線包被葡萄球菌A蛋白的最低濃度為-g/ ml ο實(shí)施例5
試紙條的穩(wěn)定性測(cè)試實(shí)驗(yàn)
連續(xù)測(cè)試6個(gè)月，測(cè)試期間，檢測(cè)副溶血弧菌菌懸液出現(xiàn)的對(duì)照線(C)和檢測(cè)線(T)的顏色均沒有異常變化，這說明試紙條穩(wěn)定強(qiáng)。經(jīng)檢測(cè)，采用本發(fā)明制備的副溶血弧菌免疫金快速檢測(cè)試紙具有很好的特異性和穩(wěn)定性，具體如下
副溶血弧菌免疫金快速檢測(cè)試紙的特異性
檢測(cè)副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌、美人魚弧菌、麥?zhǔn)匣【?、弗氏枸櫞酸桿菌、沙門氏菌等7株菌株，只有副溶血弧菌的對(duì)照線(C)和檢測(cè)線(T)，均出現(xiàn)紫紅色，顯示陽(yáng)性結(jié)果；而其余6株菌株只有對(duì)照線(C)出現(xiàn)紫紅色，檢測(cè)線(T)沒有出現(xiàn)紫紅色，顯示陰性結(jié)^ ο副溶血弧菌免疫金快速檢測(cè)試紙的穩(wěn)定性
連續(xù)測(cè)試6個(gè)月，測(cè)試期間，檢測(cè)副溶血弧菌菌懸液出現(xiàn)的對(duì)照線(C)和檢測(cè)線(T)的顏色均沒有異常變化，這說明試紙條穩(wěn)定強(qiáng)?？梢岳斫?，很多細(xì)節(jié)的變化是可能的，但這并不因此違背本發(fā)明的范圍和精神，任何所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員對(duì)其所做的適當(dāng)變化，皆應(yīng)視為不脫離本發(fā)明專利的范
權(quán)利要求
1.副溶血弧菌免疫金快速檢測(cè)試紙的制備方法，其特征在于，包括以下步驟a)副溶血弧菌抗原的制備用蛋白胨水培養(yǎng)基將副溶血弧菌培養(yǎng)過夜；b)制得副溶血弧菌滅活疫苗；c)用疫苗免疫實(shí)驗(yàn)兔制備多價(jià)抗血清采用皮下多點(diǎn)注射和靜脈直接注射免疫兔子制備兔抗副溶血弧菌多抗抗體，分別得到皮下多點(diǎn)注射制備的兔抗副溶血弧菌抗體和靜脈直接注射制備的兔抗副溶血弧菌抗體；d)抗血清純化；e)膠體金標(biāo)記將純化的皮下多點(diǎn)注射制備的兔抗副溶血弧菌抗體用膠體金進(jìn)行標(biāo)記；f)免疫金試紙條的制備先將步驟d)中純化的靜脈直接注射制備的兔抗副溶血弧菌抗體噴在微孔濾膜檢測(cè)線上，羊抗兔抗體噴在對(duì)照線上，再將步驟e)中制備的膠體金標(biāo)記的皮下多點(diǎn)注射制備的兔抗副溶血弧菌抗體噴在玻璃纖維膜上，然后組裝成免疫金試紙^^ ο
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的副溶血弧菌免疫金快速檢測(cè)試紙的制備方法，其特征在于， 所述的步驟b)，制得副溶血弧菌滅活疫苗，具體為先經(jīng)過0. 3%的甲醛37°C滅活Mh，然后經(jīng)培養(yǎng)檢測(cè)確實(shí)無(wú)活菌后作為抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的副溶血弧菌免疫金快速檢測(cè)試紙的制備方法，其特征在于， 所述的步驟c)，用疫苗免疫實(shí)驗(yàn)兔制備多價(jià)抗血清，采用皮下多點(diǎn)注射和靜脈直接注射免疫兔子制備兔抗副溶血弧菌多抗抗體，具體為1)靜脈注射免疫每10天注射一次，首次lmL，第二次1.5mL，第三次2mL，第四次3mL， 當(dāng)效價(jià)達(dá)到1 :1280或1 2560時(shí)放血；2)弗氏佐劑皮下多點(diǎn)注射免疫弗氏完全佐劑與菌液等體積混合后，兔頸背部皮下多點(diǎn)注射4mL，2周后，用弗氏不完全佐劑與菌液等體積混合液頸背部皮下多點(diǎn)注射4mL，2周后，采血前5-7天靜脈注射4mL，當(dāng)效價(jià)達(dá)到1 :1280或1 :2560時(shí)放血。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的副溶血弧菌免疫金快速檢測(cè)試紙的制備方法，其特征在于， 所述的步驟f)，免疫金試紙條的制備，具體為用膠體金標(biāo)記皮下多點(diǎn)注射制備的兔抗副溶血弧菌抗體，建立膠體金免疫層析快速檢測(cè)副溶血弧菌的方法；應(yīng)用微孔濾膜作載體的免疫檢測(cè)，先將靜脈直接注射制備的兔抗副溶血弧菌抗體噴在微孔濾膜檢測(cè)線上，羊抗兔抗體噴在對(duì)照線上，膠體金標(biāo)記的皮下多點(diǎn)注射制備的兔抗副溶血弧菌抗體噴在玻璃纖維膜上，干燥后加入封閉液于微孔濾膜上，烘干液體后組裝成檢測(cè)副溶血弧菌試紙；再通過金顆粒放大免疫反應(yīng)系統(tǒng)，使反應(yīng)結(jié)果在固相載體微孔濾膜上顯示出來(lái)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的副溶血弧菌免疫金快速檢測(cè)試紙的制備方法，其特征在于， 所述封閉液配方采用含有1% (W/ν)酪蛋白和0. 05% (V/V)Tween -20的濃度為0. 01 mol/ L的PBS溶液，PBS溶液的pH值為7. 2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的副溶血弧菌免疫金快速檢測(cè)試紙的制備方法，其特征在于， 所制備的免疫金快速檢測(cè)試紙用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)時(shí)，將試紙條平放在桌面上，在加樣端加上 IOOuL的樣品，樣品首先溶解噴在玻璃纖維膜上的金標(biāo)兔抗副溶血弧菌抗體，然后溶液往微孔濾膜移動(dòng)，當(dāng)遇到檢測(cè)線的兔抗副溶血弧菌抗體時(shí)，判斷試紙檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)如下樣品中含有副溶血弧菌在檢測(cè)線和對(duì)照線上均顯現(xiàn)一條紫紅色線； 樣品中不含有副溶血弧菌只在對(duì)照線上出現(xiàn)一條紫紅色線； 試紙無(wú)效檢測(cè)線和對(duì)照線上均不出現(xiàn)一條紫紅色線。
全文摘要
本發(fā)明公開一種副溶血弧菌免疫金快速檢測(cè)試紙的制備方法，包括以下步驟a)副溶血弧菌抗原的制備；b)制得副溶血弧菌滅活疫苗；c)用疫苗免疫實(shí)驗(yàn)兔制備多價(jià)抗血清；d)抗血清純化；e)膠體金標(biāo)記；f)免疫金試紙條的制備。采用本發(fā)明副溶血弧菌免疫金快速檢測(cè)試紙的檢測(cè)技術(shù)，具有簡(jiǎn)單、靈敏、快速、特異等優(yōu)點(diǎn)，能大大方便口岸進(jìn)出口貨物的通關(guān)速度，同時(shí)該檢測(cè)試紙具有價(jià)格低廉、不需要儀器設(shè)備、操作簡(jiǎn)便快速、結(jié)果容易判斷。
文檔編號(hào)G01N33/531GK102393455SQ20111024854
公開日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月26日
發(fā)明者劉陽(yáng), 孔繁德, 徐淑菲, 楊俊萍, 郭樹林, 陳信忠, 龔艷清 申請(qǐng)人:廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心