專利名稱：游離甲狀腺素(ft4)定量測定試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測定血清的試劑盒及其測試方法，尤其是涉及測定血清中游離甲狀腺素(FT4)含量的試劑盒及其測試方法。
背景技術(shù)：
甲狀腺素或3，5，3’，5’ 一四碘甲腺原氨酸(Thyroxine，簡稱T4)是一種分子量為 777的甲狀腺激素，在甲狀腺中由與一種特殊蛋白質(zhì)(甲狀腺球蛋白)結(jié)合的酪氨酸碘化合成。甲狀腺素(T4)釋放入血液后，大部分與血漿蛋白結(jié)合，僅約極少量的T4呈游離狀態(tài) (Free Thyroxine,FT4)存在于血液中。血清游離甲狀腺素(FT4)的生理濃度，不受機(jī)體甲狀腺結(jié)合球蛋白(TBG)濃度的影響，無論是生理性的TBG的增加，還是病理性的TBG減少， 對FT4的生理濃度均無影響。測定血清F4對診斷甲狀腺功能性疾病，具有重要的臨床價(jià)值。 FT4可作為下丘腦一垂體一甲狀腺軸疾病可疑患者的篩選指標(biāo)之一。對妊娠婦女或危重的非甲狀腺疾病如肝硬化、腎功能衰竭患者的甲狀腺功能判斷很有價(jià)值。尤其在中樞神經(jīng)甲狀腺功能低下時(shí)，F(xiàn)T4含量測定更有價(jià)值。從檢測角度上來說，目前臨床上用于測定FT4的方法主要有放免法、ELISA法、化學(xué)發(fā)光法等。過去以放免為代表的游離甲狀腺素(FT4)測定試劑盒受方法學(xué)的限制，其靈敏度和抗干擾能力嚴(yán)重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市場，目前應(yīng)用較多的為酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)和化學(xué)發(fā)光技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)興起于上個(gè)世紀(jì)80年代是繼酶聯(lián)免疫技術(shù)和放免技術(shù)之后發(fā)展起來的新興技術(shù)，由于其高靈敏度、高特異性，同時(shí)方法簡便、快速，標(biāo)記結(jié)合物穩(wěn)定，無放射性同位素?fù)p傷和污染等特點(diǎn)，在近些年得到了飛速發(fā)展。磁微粒分離酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)是一種以磁性微粒為固相分離載體，將免疫磁微粒分離技術(shù)與酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)相結(jié)合而建立的一種新型免疫檢測方法。傳統(tǒng)ELISA方法， 抗原、抗體的結(jié)合反應(yīng)是在固相(ELISA板反應(yīng)孔)表面進(jìn)行的，而磁微粒分離酶聯(lián)免疫檢測方法，抗原、抗體的結(jié)合反應(yīng)也在近似液相的條件下進(jìn)行，因而反應(yīng)快速、徹底。與傳統(tǒng) ELISA相比具有靈敏度高，檢測用時(shí)少的優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題在于提供一種游離甲狀腺素(FT4)定量測定試劑盒及其檢測方法，采用該試劑盒進(jìn)行FT4檢測具有較高的靈敏度和特異性，和更短的獲得檢測結(jié)果的時(shí)間和更簡便的操作方式。本發(fā)明提供了一種游離甲狀腺素(FT4)的定量測定試劑盒，其包含的試劑有FT4 磁分離試劑，酶反應(yīng)物，反應(yīng)增強(qiáng)劑，稀釋液，校準(zhǔn)品、質(zhì)控品，清洗液濃縮液以及底物溶液。所述的磁分離試劑含有標(biāo)記有抗FT4單克隆抗體的磁性微球。所述的酶反應(yīng)物是含有堿性磷酸酶標(biāo)記的FT4抗原。所述的反應(yīng)增強(qiáng)劑是含有Tris的緩沖液。所述稀釋液是含有BSA溶液。
所述的校準(zhǔn)品及質(zhì)控品是含有一定量的FT4抗原的BSA蛋白溶液。所述清洗液濃縮液是含有TWEEN-20和ftx)Clin-300的緩沖液。所述的底物溶液為酶促化學(xué)發(fā)光底物溶液。本發(fā)明游離甲狀腺素(FT4)的定量測定試劑盒的制備方法，包括下述步驟第一步磁分離試劑的制備過程一、磁珠緩沖液配制操作步驟，配制IL 1、稱取 TRIS 4. 58g 和 NaC16. 81g 于 IL 容器中，稱取 0. 96g TWEEN-20 于 20ml 容器中加適量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；2、用移液器將ftOclin-300量取0. 2ml于IOml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中，然后在上述IL容器中加入800ml純化水，充分?jǐn)嚢瑁?、調(diào)節(jié)PH計(jì)測量其PH值，調(diào)PH，控制PH在7. 95-8. 05之間；4、稱取BSA 3g倒入上述IL容器中；5、最后定容至1000ml，用0. 2um濾器過濾；過濾完后貼好標(biāo)簽于2_8°C冷庫貯存。二、磁分離試劑的制備過程1、將1. Omg辛二酸二琥珀酰亞胺酯溶于50ul DMSO中，取2mg抗F1M單克隆抗體溶于PH 9. 5的0. lmol/L PB緩沖液中至總體積為Iml ；2、確定辛二酸二琥珀酰亞胺酯的投入量，用移液槍吸取辛二酸二琥珀酰亞胺酯加入到步驟1的抗體溶液中，置室溫90min ；3、將步驟2抗體溶液加入到Centricon-10濃縮管中然后放入到高速冷凍離心機(jī)中在3000g下濃縮30min至體積為0. 5ml ；4、取0. 5ml磁珠，加入5ml反應(yīng)杯中，放入專用試管架，經(jīng)磁鐵吸附2分鐘后吸取
上清；5、每次加入1. 5ml PH9. 5 0. lmol/L PB,混勻30秒，上架，去上清，重復(fù)操作3次； 將步驟4獲得的抗體溶液加入到上述磁珠中，混勻后室溫反應(yīng)4小時(shí)；6、加入 0. 3ml lmol/L 的 TRIS 溶液 37V 15 分鐘；7、每次加入1. 5ml PH 7. 2 0. lmol/L PB清洗已經(jīng)標(biāo)記的磁珠，混勻30秒，上架，
去上清，重復(fù)操作3次；8、用IOOml磁珠保存液將磁珠轉(zhuǎn)入125ml玻璃瓶，即為0. 05%的FT4磁分離試劑； 磁珠保存液配方為0.1% BSA，0.05%吐溫-20,0.02% NaN3，20%乙醇，4°C保存。9、將步驟9獲得的磁分離試劑用磁珠緩沖液按照1 1的比例混勻，即得本發(fā)明試劑盒中磁分離試劑。第二步酶反應(yīng)物制備過程一、酶反應(yīng)物稀釋液配制操作步驟，配制IL 1、取 Tris 6. 06g、NaCl 13. 0g、Zncl2 0. 05g、Proclin-300 0. 2ml 禾口 MgCl2 0. 05g 于燒瓶中，然后在燒瓶中加入800ml純化水，充分?jǐn)嚢瑁乖噭┩耆芙猓?、調(diào) PH，控制 PH 在 7. 35-7. 45 范圍內(nèi)；3、稱取BSA 3g倒入上述燒杯中；4、最后定容至1000ml，用0. 2um濾器過濾即得。二、堿性磷酸酶ALP與FT4抗原的偶聯(lián)
1、取FT4抗原Img放置于Iml玻璃管中；2、取200ul DMSO溶解抗原使抗原的終濃度到達(dá)5mg/ml，充分混勻；3、按照Imol抗原加入5mol的辛二酸二琥珀酰亞胺酯的摩爾比例加辛二酸二琥珀酰亞胺酯到步驟2的溶液中，37°C恒溫箱中反應(yīng)1. 5小時(shí)；4、按照5mol抗原加入Imol的ALP的摩爾比往步驟3溶液中添加ALP，然后加入 Iml的PH為7. 4濃度為0. IM的PB緩沖液，置于37度恒溫箱中反應(yīng)3小時(shí)；5、將步驟4的溶液用PD-IO柱純化，收集純化液，按照1 5000的體積添加上述步驟一)獲得的酶反應(yīng)物稀釋液，混合均勻，即得酶反應(yīng)物。第三步反應(yīng)增強(qiáng)劑配制步驟，配制IL 1、稱取TRIS1. 56g和NaCl 4. 23g于IL容器中；用移液器將Proclin-300量取 0. 2ml于IOml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；2、用量筒量取800ml純化水于上述IL容器中，充分?jǐn)嚢?，直至完全溶解調(diào)PH，控制 PH 在 7. 35-7. 45 之間；3、稱取Mak330.9g于上述IL容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0. 2um濾
器過濾ο第四步稀釋液配制步驟，配制IL 1、稱取 NaC19. Og 和 BSA 60g 于 IL 的容器中；2、用移液器將Proclin-300量取0. 5ml加IOml純化水溶解，倒入上述IL的容器中；3、最后定容1000ml，完全溶解后，用0. 2um濾器過濾，貼好標(biāo)簽于2_8°C冷庫貯存， 有效期為12個(gè)月。第五步校準(zhǔn)品和質(zhì)控品的配制校準(zhǔn)品濃度分別為2，10，20，40，80pg/ml ；質(zhì)控品濃度分別為10，40pg/ml。第六步清洗濃縮液配制步驟，配制IL 1、稱取 TRIS 12. 54g 和 NaCl 325. 6g 于 IL 容器中；2、稱取5g Tween-20于IOOml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述IL容
器中；3、用移液器將ftOclin-300量取0. 2ml于盛有IOml純化水的燒杯中完全溶解后， 倒入上述IL容器中；4、用量筒量取800ml純化水于上述IL容器中，充分?jǐn)嚢?，直至完全溶解?、調(diào)PH，控制其范圍在7. 35-7. 45之間；6、最后定容1000ml，完全溶解后用0. 2um濾器過濾即得。第七步底物溶液配制步驟，配制IL 1、稱取 TRIS 2.35g、NaCl 6. 41g、Na2SO3 0. 002g 和 Proclin-300 0.2ml 于 IL 燒
2、用量筒量取600ml純化水于IL燒杯中，充分?jǐn)嚢?，直至完全溶解，調(diào)PH，控制其范圍在7. 95-8. 05之間；3、加入250ml Lumi-Phos 480后，用0. 2um濾器過濾收集濾液，用純化水定容至 1000ml，混勻后即得。本發(fā)明工作原理本發(fā)明為競爭法化學(xué)發(fā)光免疫分析法與磁性微粒分離技術(shù)相結(jié)合的一種檢測方法。在標(biāo)本、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品中加入定量的酶標(biāo)FT4抗原、結(jié)合著磁性微粒的FT4單克隆抗體及穩(wěn)定增強(qiáng)劑。37°C孵育后，酶標(biāo)FT4抗原與標(biāo)本、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品中FT4 競爭的與結(jié)合著磁性微粒的FT4單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合。在外加磁場中直接沉淀，不需離心即可分離。倒去上清液，清洗沉淀的復(fù)合物，然后加入酶促化學(xué)發(fā)光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)激發(fā)態(tài)中間體回到基態(tài)時(shí)便發(fā)出光子， 形成發(fā)光反應(yīng)，即可使用發(fā)光儀檢測反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度。在檢測范圍內(nèi)，反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度與樣本中的FT4濃度成反比。本發(fā)明的主要?jiǎng)?chuàng)新之處在于1、本發(fā)明試劑盒將化學(xué)發(fā)光技術(shù)與免疫磁微粒相結(jié)合，提供了一種接近均相的反應(yīng)體系，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明試劑盒具有更高的檢測靈敏度和特異性，并達(dá)到了較佳的性能參數(shù)。2、本發(fā)明公開了一種新的專用穩(wěn)定增強(qiáng)劑以及清洗液濃縮液，使得反應(yīng)過程更加穩(wěn)定可靠，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)靈敏有效，在提高產(chǎn)品性能的同時(shí)，并且大大降低了產(chǎn)品成本；3、試劑盒中的磁分離試劑，酶反應(yīng)物，穩(wěn)定增強(qiáng)劑，校準(zhǔn)品、質(zhì)控品，清洗液濃縮液、稀釋液以及底物溶液均是該反應(yīng)體系下的最優(yōu)配方，給該試劑盒的使用效期及檢測性能提供了有力保障。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、一、磁珠緩沖液配制操作規(guī)程配方見表1，以配制IL為例1、稱取 TRIS 4. 58g 和 NaC16. 81g 于 IL 容器中，稱取 0. 96g TWEEN-20 于 20ml 容器中加適量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；2、用移液器將Proclin-300量取0. 2ml于少量純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；然后在IL容器中加入800ml純化水，充分?jǐn)嚢瑁乖噭┩耆芙猓?、調(diào)節(jié)PH值，測量其PH值；用HCl或NaOH調(diào)PH,測量其PH在7. 95-8. 05之間即符合要求；4、稱取BSA(牛血清白蛋白)3g倒入上述容器中；5、最后定容至1000ml，測PH值，范圍在7. 95-8. 05之間即符合要求，用0. 2um濾器過濾；過濾完后貼好標(biāo)簽于2-8°C冷庫貯存，磁珠緩沖液有效期為12個(gè)月；磁珠緩沖液表權(quán)利要求
1.一種游離甲狀腺素FT4的定量測定試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含F(xiàn)T4磁分離試劑，酶反應(yīng)物，反應(yīng)增強(qiáng)劑，稀釋液，F(xiàn)T4校準(zhǔn)品、FT4質(zhì)控品，清洗液濃縮液以及底物溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的FT4磁分離試劑含有標(biāo)記有抗FT4 單克隆抗體的磁性微球；所述的酶反應(yīng)物是含有堿性磷酸酶標(biāo)記的FT4抗原；所述的反應(yīng)增強(qiáng)劑是含有Tris的緩沖液；所述稀釋液是含有BSA的溶液；所述的校準(zhǔn)品及質(zhì)控品是含有一定量的FT4抗原的BSA溶液；所述清洗液濃縮液是含有TWEEN-20和ftOclin-300的緩沖液；所述的底物溶液為酶促化學(xué)發(fā)光底物溶液。
3.如權(quán)利要求1-2任其一所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中各組分按照如下制備方法制得一、磁分離試劑的制備過程一)、磁珠緩沖液配制操作步驟，配制IL(1)、稱取TRIS 4. 58g 和 NaC16. 81g 于 IL 容器中，稱取 0. 96g TWEEN-20 于 20ml 容器中加適量水使其完全溶解后，倒入上述IL容器中；(2)、用移液器將Proclin-300量取0.2ml于IOml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中，然后在上述IL容器中加入800ml純化水，充分?jǐn)嚢瑁?3)、調(diào)節(jié)PH,控制PH在7.95-8. 05之間；(4)、稱取BSA3g倒入上述IL容器中；(5)、最后定容至1000ml，用0.2um濾器過濾即得；二)、磁分離試劑的制備過程(1)、將1. Omg辛二酸二琥珀酰亞胺酯溶于50ul DMSO中，取2mg抗F1M單克隆抗體溶于PH 9. 5的0. lmol/L PB緩沖液中至總體積為Iml ；O)、用移液槍吸取上述辛二酸二琥珀酰亞胺酯加入到步驟1的抗體溶液中，置室溫 90min ；(3)、將步驟2抗體溶液加入到濃縮管中，然后放入到高速冷凍離心機(jī)中在3000g下離心30min濃縮至0. 5ml ；(4)、取0.5ml磁珠，加入5ml反應(yīng)杯中，經(jīng)磁鐵吸附2分鐘后吸取上清，然后加入1. 5ml PH9. 50. lmol/L PB，混勻30秒，然后加入步驟3獲得的抗體溶液，混勻后室溫反應(yīng)4小時(shí)；(5)、加入0. 3ml lmol/L 的 TRIS 溶液 37°C 15 分鐘，然后加入 1. 5ml PH 7. 20. lmol/L PB清洗已經(jīng)標(biāo)記的磁珠，混勻30秒；(6)、用IOOml磁珠保存液將磁珠轉(zhuǎn)入玻璃瓶；(7)、將步驟6獲得的溶液與上述磁珠緩沖液按照1 1的體積比例混勻，即得權(quán)利要求1或2所述試劑盒中的磁分離試劑；二、酶反應(yīng)物的制備過程一)、酶反應(yīng)物稀釋液配制操作步驟，配制IL (1)、取 Tris 6.06g、NaCl 13. Og^Zncl2 0. 05g,Proclin-300 0. 2ml 和 MgCl2 0. 05g 于燒瓶中，然后在燒瓶中加入800ml純化水，充分?jǐn)嚢?，使試劑完全溶解?2)、調(diào)PH,控制PH在7.35-7. 45范圍內(nèi);(3)、稱取BSA3g倒入上述燒杯中；(4)、最后定容至1000ml，用0.2um濾器過濾即得； 二 )、堿性磷酸酶ALP與FT4抗原的偶聯(lián)(1)、取FT4抗原；(2)、取200ulDMSO溶解抗原使抗原的終濃度到達(dá)5mg/ml，充分混勻；(3)、按照Imol抗原加入5mol的辛二酸二琥珀酰亞胺酯的摩爾比例加辛二酸二琥珀酰亞胺酯到步驟2的溶液中，37°C恒溫箱中反應(yīng)1. 5小時(shí)；、按照5mol抗原加入Imol的ALP的摩爾比往步驟3溶液中添加ALP，然后加入 ImlPH為7.4濃度為0. IM的PB緩沖液，置于37度恒溫箱中反應(yīng)3小時(shí)；(5)、將步驟4的溶液用PD-IO柱純化，收集純化液，按照1 5000的體積比添加上述步驟一)獲得的酶反應(yīng)物稀釋液，混合均勻，即得酶反應(yīng)物。三、反應(yīng)增強(qiáng)劑的制備過程，配制IL(1)、取TRIS1. 56g 和 NaCl 4. 23g 于 IL 容器中，取 0. 2ml Proclin-300 于 IOml 純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；(2)、取800ml純化水于上述IL容器中，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙?，調(diào)PH在7.35-7. 45之間；(3)、稱取Mak330.9g于上述IL容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0. 2um濾器過濾即得；四、稀釋液的制備過程，配制IL:(1)、稱取NaC19.Og和BSA 60g于IL的容器中；(2)、取0.5ml Proclin-300加IOml純化水溶解，倒入上述IL的容器中；(3)、最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um濾器過濾即得；五、FT4校準(zhǔn)品和FT4質(zhì)控品的配制FT4校準(zhǔn)品中F1M抗原的濃度分別為2，10，20，40，80pg/ml ；FT4質(zhì)控品中F1M抗原的濃度分別為10，40pg/ml ；六、清洗液濃縮液的制備過程，配制IL(1)、取TRIS 12. 54g 和 NaCl 325. 6g 于 IL 容器中；(2)、取5gTween-20于IOOml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述IL容器中；(3)、取0.2ml Proclin-300于盛有IOml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；(4)、取800ml純化水于上述IL容器中，充分?jǐn)嚢?，直至完全溶解?5)、調(diào)PH，控制其范圍在7.35-7. 45之間；(6)、最后定容1000ml，完全溶解后用0.2um濾器過濾即得；七、底物溶液的制備過程，配制IL(1)、取TRIS 2. 35g,NaCl 6. 41g, Na2SO3 0. 002g 和 Proclin-300 0.2ml 于 IL 燒杯中；(2)、取600ml純化水于IL燒杯中，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙猓{(diào)PH在7.95-8. 05之間；(3)、加入250mlLumi-Phos 480，用0. 2um濾器過濾收集濾液，用純化水定容至 1000ml，混勻后即得。
4.如權(quán)利要求1-3任其一所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的使用方法如下1)、加15μ 1 FT4校準(zhǔn)品、FT4質(zhì)控品、待測標(biāo)本至對應(yīng)試管底部；2)、加30μ 1酶反應(yīng)物至每一試管中；3)、加30μ 1反應(yīng)增強(qiáng)劑至每一試管中；4)、加30μ 1磁分離試劑至每一試管中；5)、用塑料薄膜覆蓋試管，多管混勻器輕輕振蕩試管架30s后，置37°C水浴30分鐘；6)、然后放至磁分離器上，確保每支試管都與分離器表面接觸，沉淀2分鐘，倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液；7)、清洗液濃縮液用純化水稀釋20倍后，加200μ 1稀釋后的清洗液至每一試管中，置多管混勻器上輕輕振蕩混勻30s ；8)、加200μ 1底物溶液至試管中混勻3秒，發(fā)光檢測儀檢測。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述待測標(biāo)本為高值HOOK樣本時(shí)，根據(jù)需要使用稀釋液對標(biāo)本進(jìn)行稀釋。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種游離甲狀腺素FT4的定量測定試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含F(xiàn)T4磁分離試劑，酶反應(yīng)物，反應(yīng)增強(qiáng)劑，稀釋液，F(xiàn)T4校準(zhǔn)品、FT4質(zhì)控品，清洗液濃縮液以及底物溶液。本發(fā)明還公開了該試劑盒的制備方法。本發(fā)明試劑盒將化學(xué)發(fā)光技術(shù)與免疫磁微粒相結(jié)合，提供了一種接近均相的反應(yīng)體系，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明試劑盒具有更高的檢測靈敏度和特異性，并達(dá)到了較佳的性能參數(shù)，并且大大降低了產(chǎn)品成本。
文檔編號(hào)G01N33/531GK102426255SQ20111025779
公開日2012年4月25日 申請日期2011年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月31日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請人:內(nèi)蒙古科慧生物科技有限責(zé)任公司