專利名稱：一種游離甲狀腺素的納米磁微粒化學(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒及其制備方法和檢測(cè)方法
一種游離甲狀腺素的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒及其 制備方法和檢測(cè)方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種結(jié)合了免疫磁微粒分離技術(shù)和納米磁微 ?；瘜W(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)的游離甲狀腺素的納米磁微粒化學(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒及其制備方法。本 發(fā)明還特別涉及該試劑盒的制備方法。
背景技術(shù)：
甲狀腺素，即3，5，3’，5’ -四碘甲狀腺原氨酸(T4)是一種分子量為777的甲狀腺 激素。T4在循環(huán)中有結(jié)合態(tài)和游離態(tài)兩種形式，正常情況下兩種形式之間保持著動(dòng)態(tài)平衡。 循環(huán)中T4有75%與甲狀腺結(jié)合球蛋白(TBG)結(jié)合，15%與前白蛋白，10%與白蛋白結(jié)合。游 離T4(FT4)僅占O. 03%，卻發(fā)揮著真正的生理作用。妊娠期、肝炎、先天性TBG增高、服用雌 激素(口服避孕藥)等引起TBG濃度增高時(shí)，總T3、T4的濃度也隨之升高。腎病、肝功能衰 竭、先天性TBG缺乏、服用雄激素或大劑量糖皮質(zhì)激素引起TBG濃度降低時(shí)，總Τ3、Τ4的濃 度也隨之降低。這些情況下測(cè)定總Τ3、Τ4不能準(zhǔn)確反映甲狀腺的功能狀態(tài)。游離Τ3、游離 Τ4的水平受到影響程度較小，因此很多情況下測(cè)定游離態(tài)的甲狀腺激素能更好的了解甲狀 腺功能。
FT4是目前醫(yī)院開展的常規(guī)免疫檢測(cè)項(xiàng)目，對(duì)甲狀腺疾病的診斷有無可替代的重 要參考價(jià)值。目前我國(guó)已批準(zhǔn)上市的FT4免疫檢測(cè)試劑有進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)兩大類，其中進(jìn)口試 劑有雅培等跨國(guó)定量檢測(cè)公司的產(chǎn)品，采用的方法學(xué)多為化學(xué)發(fā)光，而國(guó)產(chǎn)試劑中采用的 方法學(xué)多數(shù)為放免法，近兩年開始出現(xiàn)化學(xué)發(fā)光類產(chǎn)品。
放免分析法存在線性范圍窄、不易實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化等方法學(xué)限制因素。而納米磁微 ?；瘜W(xué)發(fā)光測(cè)定法具有靈敏度高、檢測(cè)線性范圍寬、操作簡(jiǎn)便，自動(dòng)化程度高等優(yōu)勢(shì)。目前 納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)因其有上述諸多優(yōu)點(diǎn)得到了廣泛的應(yīng)用。
然而，在實(shí)際的免疫檢測(cè)中，由于待測(cè)樣品中所含的雜質(zhì)成分較多，一定程度上影 響了檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性，所以從復(fù)雜的樣品基質(zhì)中快速分離、純化出目的待測(cè)物，是臨床 檢驗(yàn)工作者面臨的難題之一。磁微粒免疫檢測(cè)技術(shù)是利用高分子材料合成一定粒度大小的 磁性固相微粒作載體，以物理吸附、化學(xué)偶聯(lián)等方法包被上具有特異性親和力的抗體或抗 原等各種免疫活性物質(zhì)，具有分離速度快、效率高、可重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單、不影響被分離細(xì) 胞或其他生物材料的生物學(xué)性狀和功能等特點(diǎn)，在外加磁場(chǎng)作用下可定向運(yùn)動(dòng)，使得某些 特殊成分得以分離、濃集或純化。
中國(guó)發(fā)明專利公開CN101639481A公開了一種了游離甲狀腺素的磁微粒納米磁微 粒化學(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒，該試劑盒包括游離甲狀腺素系列校準(zhǔn)品，抗異硫氰酸熒光素單克 隆抗體包被的磁微粒溶液，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的游離甲狀腺素抗體溶液，辣根過氧化物 酶標(biāo)記的游離甲狀腺素，化學(xué)發(fā)光底物液，濃縮洗滌液。該試劑盒中抗異硫氰酸熒光素單克 隆抗體包被的磁微粒溶液、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的游離甲狀腺素抗體溶液以及辣根過氧化 物酶標(biāo)記的游離甲狀腺素構(gòu)成免疫反應(yīng)步驟用的免疫反應(yīng)試劑。該試劑盒雖然能夠?qū)崿F(xiàn)快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)，但是其中，辣根過氧化物酶標(biāo)記的游離甲狀腺素的制備過程非常繁瑣，工藝穩(wěn)定性不好，且標(biāo)記率低，限制其檢測(cè)效果特別是分析間精密度和導(dǎo)致成本增加。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種游離甲狀腺素的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒，其能夠以較低的成本制備得到，且能夠?qū)崿F(xiàn)游離甲狀腺素準(zhǔn)確和高精確地定量測(cè)定。
本發(fā)明同時(shí)還提供一種游離甲狀腺素的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒的制備方法，該方法工藝穩(wěn)定，成本低，且所得試劑盒的精密度特別是分析間精密度高。
為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采取的一種技術(shù)方案是
一種游離甲狀腺素(FT4)的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒，其包括用于免疫反應(yīng)步驟的免疫反應(yīng)試劑，該免疫反應(yīng)試劑包括含有熒光素標(biāo)記的游離甲狀腺抗體的溶液和包被有抗熒光素(FITC)抗體的磁微粒的懸浮液，其特征在于所述的免疫反應(yīng)試劑還包括含有堿性磷酸酶(ALP)標(biāo)記的游離甲狀腺素抗原的溶液，該堿性磷酸酶標(biāo)記的游離甲狀腺素抗原由堿性磷酸酶與游離甲狀腺素抗原通過交聯(lián)劑辛二酸二琥珀酰亞胺酯連接構(gòu)成。
進(jìn)一步地，所述的含有熒光素標(biāo)記的游離甲狀腺抗體的溶液的pH為7 9，其中的熒光素標(biāo)記的游離甲狀腺抗體的濃度為O. 5 1 μ g/mL。所述的含有堿性磷酸酶標(biāo)記的游離甲狀腺素抗原的溶液的PH為7 9，其中堿性磷酸酶標(biāo)記的游離甲狀腺素抗原的濃度為O.02^0.1 μ g/mL。
根據(jù)本發(fā)明，所述的含有熒光素標(biāo)記的抗游離甲狀腺素抗體能夠通過成熟和穩(wěn)定的工藝容易地制備。
根據(jù)本發(fā)明，所述包被有抗熒光素抗體的磁微粒的制備也是較為容易的，且現(xiàn)有技術(shù)已有成熟的制備工藝可以參照。例如可以通過常規(guī)的物理吸附或化學(xué)偶聯(lián)包被方式制備，沒有特別限制。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案該包被有抗熒光素抗體的磁微粒中， 抗熒光素抗體與磁微粒之間相化學(xué)偶聯(lián)。所述包被有抗熒光素抗體的磁微粒中，抗熒光素抗體與磁微粒之間相化學(xué)偶聯(lián)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知曉，本發(fā)明的試劑盒還可以進(jìn)一步包括有其它檢測(cè)所需的試劑，例如底物溶液。但是諸如底物溶液等其它試劑可以另行購(gòu)買或配制，因此，雖然試劑盒中可以包括這些試劑，但它們對(duì)于本發(fā)明試劑盒來說并非必不可少。
本發(fā)明采取的又一技術(shù)方案是一種上述的游離甲狀腺素的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒的制備方法，其包括分別制備所述含有熒光素標(biāo)記的游離甲狀腺抗體的溶液、 所述含有堿性磷酸酶標(biāo)記的游離甲狀腺素抗原的溶液以及包被有抗熒光素抗體的磁微粒的懸浮液的步驟，其中所述含有堿性磷酸酶標(biāo)記的游離甲狀腺素抗原的溶液的制備過程如下
①使游離甲狀腺素抗原與交聯(lián)劑 辛二酸二琥珀酰亞胺酯在二甲基亞砜溶劑中，在室溫下反應(yīng)，使生成甲狀腺素抗原與辛二酸二琥珀酰亞胺酯的連接物，于疒8°C下保存?zhèn)溆茫渲兴龅挠坞x甲狀腺素抗原、所述堿性磷酸酶的純度均大于等于95wt%，且所述堿性磷酸酶的比活性超過1000u/mg ；
②將含有堿性磷酸酶的緩沖液與步驟①所得溶液按照堿性磷酸酶與甲狀腺素抗原與辛二酸二琥珀酰亞胺酯的連接物的摩爾比為1:1. Γ1. 3的比例混合，在室溫下反應(yīng)， 使生成所述堿性磷酸酶標(biāo)記的游離甲狀腺素抗原，反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)液通過G-25凝膠柱除鹽，選擇具有適當(dāng)PH值的緩沖液調(diào)整濃度和pH值即得，其中堿性磷酸酶的緩沖液的濃度為O.5 L 5mg/mL。
根據(jù)一個(gè)具體方面，步驟①中，取游離甲狀腺素抗原，加入二甲基亞砜溶解該抗原至濃度為2(T50mg/mL，加入交聯(lián)劑辛二酸二琥珀酰亞胺酯，室溫反應(yīng)2 3小時(shí)，用二甲基亞砜將反應(yīng)液1:10稀釋，于2 8°C下保存?zhèn)溆谩?br> 根據(jù)又一具體方面，步驟②中，取濃度大于等于5mg/mL的堿性磷酸酶的磷酸鹽緩沖液，用PHflO的碳酸氫鈉緩沖液稀釋至O. 5^1. 5mg/mL，加入步驟①所得反應(yīng)液，室溫靜置反應(yīng)2(T60min。
在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，步驟②中，將含有堿性磷酸酶的緩沖液與步驟①所得溶液按照堿性磷酸酶與甲狀腺素抗原與辛二酸二琥珀酰亞胺酯的連接物的摩爾比為1:1. 2 的比例混合。
進(jìn)一步地，所述的含有熒光素標(biāo)記的游離甲狀腺抗體的溶液的制備方法如下配制含有熒光素的pH為9 10的緩沖液,然后按照熒光素與抗游離甲狀腺素抗體的分子比為 20^200:1的比例,將所述含有熒光素的pH為9 10的緩沖液與抗游離甲狀腺素抗體的pH為 9^10的緩沖液混合，混勻后，室溫靜置反應(yīng)，然后將反應(yīng)液通過G-25凝膠柱進(jìn)行分離，除去游離的熒光素，得到含有熒光素標(biāo)記的抗游離甲狀腺素抗體的溶液，接著用具有適當(dāng)PH值的緩沖液調(diào)整濃度和pH，即得。其中適當(dāng)pH值的緩沖液可以為例如含有O. 5%牛血清白蛋白、pH8. O的TRIS緩沖液。
進(jìn)一步地，所述的包被有抗熒光素抗體的磁微粒的懸浮液的制備方法如下使含有羧基活性基團(tuán)的磁微粒與抗熒光素抗體在偶聯(lián)劑碳二亞胺的存在下，室溫反應(yīng)疒18小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束，磁分離，去上清，用具有適當(dāng)PH值的緩沖液調(diào)整pH和濃度，即得，其中所述的磁微粒具有超順磁性，其直徑為O. 5 2μπι，每克磁微粒上所帶的羧基活性基團(tuán)的含量不低于O. 4mmol ;所述的抗熒光素抗體為單克隆抗體或多克隆抗體，純度大于等于90wt%，稀釋效價(jià)大于1:100萬。其中適當(dāng)pH值的緩沖液可以為例如含有O. 5%牛血清白蛋白、pH8. O的 TRIS緩沖液。
優(yōu)選地，上述的具有適當(dāng)pH值的緩沖液為含有O. 5%牛血清白蛋白、pH8. O的TRIS 緩沖液。
本發(fā)明所述的熒光素可以是已知的各種熒光素，常用的有例如異硫氰酸熒光素， 四乙基羅丹明，四甲基異硫氰酸羅丹明等。
本發(fā)明的試劑盒應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)時(shí)的步驟與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法一樣，即包括依次進(jìn)行的免疫反應(yīng)步驟、使用磁分離及洗滌設(shè)備對(duì)免疫反應(yīng)的反應(yīng)液進(jìn)行洗滌的步驟以及向洗滌后的反應(yīng)液內(nèi)加入底物溶液并利用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度的步驟。
優(yōu)選地，所述的免疫反應(yīng)步驟具體實(shí)施如下在檢測(cè)樣管中加入待測(cè)樣本原液或稀釋液，然后依次加入含有熒光素標(biāo)記的游離甲狀腺抗體的溶 液、含有堿性磷酸酶標(biāo)記的游離甲狀腺素抗原的溶液，混勻，在25 40 °C下進(jìn)行第一次溫育,然后加入包被有抗熒光素抗體的磁微粒的懸浮液，混勻，在25 40°C下進(jìn)行第二次溫育；所述的底物溶液為堿性磷酸酶化學(xué)發(fā)光底物溶液。
進(jìn)一步地，所述第一次溫育的時(shí)間可以為l(T20min，通常為15min ;第二次溫育的時(shí)間可以為3 15min,通常為5min。
上述的使用磁分離及洗滌設(shè)備對(duì)免疫反應(yīng)的反應(yīng)液進(jìn)行洗滌的步驟以及向洗滌后的反應(yīng)液內(nèi)加入底物溶液并利用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度的步驟均可參照常規(guī)方法實(shí)施，所用的設(shè)備以及裝置也是常規(guī)的。其中，堿性磷酸酶化學(xué)發(fā)光底物溶液對(duì)于本領(lǐng)域人員來說也是已知的，可商購(gòu)獲得。
由于以上技術(shù)方案的實(shí)施，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)
1.申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，采取辛二酸二琥珀酰亞胺酯作為交聯(lián)劑進(jìn)行堿性磷酸酶和游離甲狀腺素抗原的偶聯(lián)時(shí)，具有和其它交聯(lián)劑相比更高的偶聯(lián)效率，在降低制備成本的同時(shí)，有利于提高檢測(cè)效果。因此，本發(fā)明的試劑盒中的三種試劑均可以通過穩(wěn)定的制備工藝制備得到，生產(chǎn)成本低，且由于制備工藝的穩(wěn)定性，試劑盒分析批間差小，檢測(cè)的分析間精密度提聞;
2.本發(fā)明的試劑盒中的含有堿性磷酸酶標(biāo)記的游離甲狀腺素抗原的溶液的制備方法，能夠有效將游離甲狀腺素抗原與堿性磷酸酶偶聯(lián)，偶聯(lián)效率高，進(jìn)一步降低試劑盒的成本低和確保試劑盒的檢測(cè)效果。
3、采取本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，準(zhǔn)確度好，精密度高，靈敏度高，檢測(cè)范圍寬，樣品無序預(yù)稀釋，操作簡(jiǎn)單省時(shí)。與采用進(jìn)口試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的方法相比，本發(fā)明的檢測(cè)方法在成本上具有顯著的優(yōu)勢(shì)。


圖1為測(cè)試校準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖2為靈敏度評(píng)價(jià)擬合曲線；
圖3為血清樣本檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性(其中橫坐標(biāo)X為實(shí)施例4制備得的試劑盒樣本測(cè)值，濃度單位為pg/mL，縱坐標(biāo)y為雅培公司試劑盒樣本測(cè)值，濃度單位為pg/mL)。
具體實(shí)施方式
為描述方便，下文中，用第一試劑、第二試劑以及磁分離試劑分別代表本發(fā)明中的含有熒光素標(biāo)記的游離甲狀腺抗體的溶液、含有堿性磷酸酶(ALP)標(biāo)記的游離甲狀腺素抗原的溶液和包被有抗熒光素抗體的磁微粒的懸浮液。
實(shí)施例1第一試劑的制備
(I)材料與儀器以磷酸鹽緩沖液保存的抗FT4單克隆抗體(純度超過95wt%，濃度為2mg/mL);異硫氰酸熒光素(FITC)，碳酸氫鈉等試劑應(yīng)達(dá)到化學(xué)純；G_25凝膠純化柱采購(gòu)自GE公司。
(2)制備步驟
①用O. Γ0. 2mol/L pH9. (TlO. O的碳酸鹽緩沖液配制O. 5mg/mL的FITC溶液；
②按照FT4抗體與FITC分子比為1:20的比例在抗體溶液中加入步驟①所配FITC 溶液，混合均勻，室溫靜置12h小時(shí)，反應(yīng)生成FT4抗體-FITC連接物；
③將經(jīng)過步驟②的反應(yīng)液通過G-25凝膠柱進(jìn)行分離，除去未反應(yīng)的FITC，得到含有FT4抗體-FITC連接物(即FITC標(biāo)記的FT4抗體)的溶液；
④將步驟③所得含有FT4抗體-FITC連接物的溶液用含O. 5%牛血清白蛋白(BSA) PH8. O的O. lmol/L的TRIS緩沖液稀釋到FT4抗體-FITC連接物濃度為O. 5 I μ g/mL, pH為即為第一試劑。
實(shí)施例2第二試劑的制備
(I)材料與儀器FT4抗原(固體粉末，純度超過95%);以磷酸緩沖液保存的堿性磷酸酶(ALP溶液，ALP純度為約99%，比活性為約1500U/mg，濃度為10mg/mL);偶聯(lián)劑DSS購(gòu)自THERMO公司，TRIS等化學(xué)試劑應(yīng)達(dá)到化學(xué)純；G_25凝膠純化柱為GE公司產(chǎn)品。
(2)制備步驟
①取Img FT4抗原，加入DMSO溶解該抗原至濃度為2(T50mg/mL，加入DSSO. 5mg， 室溫反應(yīng)2小時(shí)，用DMSO將反應(yīng)液1:10稀釋，2-8°C保存?zhèn)溆茫?br> ②取Img的ALP溶液，用O.1M ρΗ9· 5的NaHCO3緩沖液將ALP溶液稀釋到Img/ mL,稀釋后的ALP緩沖液中加入步驟①制備的FT4-DMS0溶液進(jìn)行連接反應(yīng)，加入FT4-DMS0 溶液體積為ALP緩沖液體積的1/20，室溫靜置反應(yīng)30min，用G-25凝膠柱除鹽，2_8°C保存?zhèn)溆?
③將步驟②的溶液用含O. 5%牛血清白蛋白(BSA)pH8. O的O. lmol/L的TRIS緩沖液稀釋到O. 02 O.1 μ g/mL和pH9 10，即為第二試劑。
實(shí)施例3磁分離試劑的制備
(I)材料與儀器
磁微粒的懸浮液 磁微粒含量5wt%，磁微粒含羧基(COOH)活性集團(tuán)，每克(g)磁微粒(干重)羧基含量不低于O. 4毫摩爾(mmol )，具有超順磁性，直徑在0. 5-2 μ m之間
抗FITC抗體可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體，純度為90wt%以上，稀釋效價(jià)超過1:100萬；
2-嗎啉乙磺酸(MES)、碳二亞胺(EDC)、TRIS和其他試劑應(yīng)達(dá)到化學(xué)純。
(2)制備步驟
①取IOOmg磁微粒的懸浮液，磁分離去上清，用0. 05mol/L, pH4. 5 5MES緩沖液 IOmL重懸；
②加入2 4mg的抗FITC抗體,室溫混懸3(T60min ；
③加入0. 5 ImL新鮮配制的10mg/mL的EDC水溶液,室溫混懸2 12h ；
④磁分離，去上清，用含0.5%牛血清白蛋白(BSA)pH8.0的0. lmol/L的TRIS緩沖液重懸到lmg/mL, pH8. O,即為磁分離試劑。
實(shí)施例4游離甲狀腺素的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒
該試劑盒包括
按照實(shí)施例1方法制備的第一試劑(濃度為0. 75 μ g/mL), 50mL ；
按照實(shí)施例2方法制備的第二試劑(濃度為0. 05 μ g/mL), 50mL ；
按照實(shí)施例3方法制備的磁力分離試劑50mL。
實(shí)施例5游離甲狀腺素的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒
該試劑盒包括
按照實(shí)施例1方法制備的第一試劑(濃度為0. 5 μ g/mL), 5mL ；
按照實(shí)施例2方法制備的第二試劑(濃度為0. 02 μ g/mL), 5mL ；
按照實(shí)施例3方法制備的磁力分離試劑5mL。實(shí)施例6采取實(shí)施例4的試劑盒進(jìn)行游離甲狀腺素的定量檢測(cè)(1)檢測(cè)步驟①免疫反應(yīng)在檢測(cè)管中加入30 U 1待測(cè)樣本(血清或血衆(zhòng))原液，然后加入50 U 1 第一試劑，50iU第二試劑，混勻，37±1°C條件下溫育15min ;加入50 yl磁分離試劑，混勻， 37±1°C條件下溫育5min ；②洗滌使磁微粒在磁場(chǎng)中沉降，去除上清，加入600 yl的清洗液，去除磁場(chǎng)，震 蕩使磁微粒充分混懸，然后磁分離，去除上清。此步驟重復(fù)3次；③加底物溶液檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度在檢測(cè)管中加入150 U 1堿性磷酸酶化學(xué)發(fā)光底物 溶液(北京阿匹斯生物技術(shù)有限公司APCL- I )，震蕩使磁微粒充分混懸，檢測(cè)單位時(shí)間內(nèi)發(fā) 光強(qiáng)度。(2)繪制校準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線參見圖1。(3)靈敏度評(píng)價(jià)檢測(cè)“0”濃度樣本，重復(fù)檢測(cè)20次，計(jì)算相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(RLU)的平均值(M)和標(biāo)準(zhǔn) 差(SD)，并計(jì)算M-2SD值，根據(jù)零濃度校準(zhǔn)品和相鄰校準(zhǔn)品之間的濃度-RLU進(jìn)行兩點(diǎn)回歸 擬合得出一次方程，將M-2SD值帶入上述方程中，求出對(duì)應(yīng)的濃度值，即為最低檢測(cè)限。本 方法的靈敏度不大于2pg/mL。其中A點(diǎn)發(fā)光值分別參見表1 :表權(quán)利要求
1.一種游離甲狀腺素的納米磁微粒化學(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒，所述試劑盒包括用于免疫反應(yīng)步驟的免疫反應(yīng)試劑，所述的免疫反應(yīng)試劑包括含有熒光素標(biāo)記的游離甲狀腺抗體的溶液和包被有抗熒光素抗體的磁微粒的懸浮液，其特征在于所述的免疫反應(yīng)試劑還包括含有堿性磷酸酶標(biāo)記的游離甲狀腺素抗原的溶液，該堿性磷酸酶標(biāo)記的游離甲狀腺素抗原由堿性磷酸酶與游離甲狀腺素抗原通過交聯(lián)劑辛二酸二琥珀酰亞胺酯連接構(gòu)成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的游離甲狀腺素的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒，其特征在于所述的含有熒光素標(biāo)記的游離甲狀腺抗體的溶液的pH為7 9，其中的熒光素標(biāo)記的游離甲狀腺抗體的濃度為O. 5^1 μ g/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的游離甲狀腺素的納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒，其特征在于所述包被有抗熒光素抗體的磁微粒中，抗熒光素抗體與磁微粒之間相化學(xué)偶聯(lián)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的游離甲狀腺素的納米磁微粒化學(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒，其特征在于所述的含有堿性磷酸酶標(biāo)記的游離甲狀腺素抗原的溶液的PH為7 9，其中堿性磷酸酶標(biāo)記的游離甲狀腺素抗原的濃度為O. 02、.1 μ g/mL。
5.—種如權(quán)利要求廣4中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的游離甲狀腺素的納米磁微粒化學(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒的制備方法，其包括分別制備所述含有熒光素標(biāo)記的游離甲狀腺抗體的溶液、所述含有堿性磷酸酶標(biāo)記的游離甲狀腺素抗原的溶液以及所述包被有抗熒光素抗體的磁微粒的懸浮液的步驟，其特征在于所述含有堿性磷酸酶標(biāo)記的游離甲狀腺素抗原的溶液的制備過程如下①使游離甲狀腺素抗原與交聯(lián)劑辛二酸二琥珀酰亞胺酯在二甲基亞砜溶劑中，在室溫下反應(yīng)，使生成甲狀腺素抗原與辛二酸二琥珀酰亞胺酯的連接物，于疒8°C下保存?zhèn)溆茫?其中所述的游離甲狀腺素抗原、所述堿性磷酸酶的純度均大于等于95wt%，且所述堿性磷酸酶的比活性超過1000u/mg ；②將含有堿性磷酸酶的緩沖液與步驟①所得溶液按照堿性磷酸酶與甲狀腺素抗原與辛二酸二琥珀酰亞胺酯的連接物的摩爾比為1:1. Γ1. 3的比例混合，在室溫下反應(yīng)，使生成所述堿性磷酸酶標(biāo)記的游離甲狀腺素抗原，反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)液通過G-25凝膠柱除鹽， 選擇具有適當(dāng)PH值的緩沖液調(diào)整濃度和pH值即得，其中堿性磷酸酶的緩沖液的濃度為O.5 L 5mg/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于步驟①中，取游離甲狀腺素抗原，加入二甲基亞砜溶解該抗原至濃度為2(T50mg/mL，加入交聯(lián)劑辛二酸二琥珀酰亞胺酯，室溫反應(yīng)2 3小時(shí)，用二甲基亞砜將反應(yīng)液1:10稀釋，于疒8°C下保存?zhèn)溆谩?br> 7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的制備方法，其特征在于步驟②中，取濃度大于等于5mg/ mL的堿性磷酸酶的磷酸鹽緩沖液，用pH 9^10的碳酸氫鈉緩沖液稀釋至O. 5^1. 5mg/mL，加入步驟①所得反應(yīng)液，室溫靜置反應(yīng)2(T60min。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述的含有熒光素標(biāo)記的游離甲狀腺抗體的溶液的制備方法如下配制含有熒光素的PH為擴(kuò)10的緩沖液，然后按照熒光素與抗游離甲狀腺素抗體的分子比為2(Γ200:1的比例,將所述含有熒光素的pH為9 10的緩沖液與抗游離甲狀腺素抗體的pH為9 10的緩沖液混合,混勻后，室溫靜置反應(yīng)，然后將反應(yīng)液通過G-25凝膠柱進(jìn)行分離，除去游離的熒光素，得到含有熒光素標(biāo)記的抗游離甲狀腺素抗體的溶液，接著用具有適當(dāng)PH值的緩沖液調(diào)整濃度和pH，即得。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述的包被有抗熒光素抗體的磁微粒的懸浮液的制備方法如下使含有羧基活性基團(tuán)的磁微粒與抗熒光素抗體在偶聯(lián)劑碳二亞胺的存在下，室溫反應(yīng)2 18小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束，磁分離，去上清，用具有適當(dāng)pH值的緩沖液調(diào)整pH和濃度，即得，其中所述的磁微粒具有超順磁性，其直徑為O. 5^2 μ m,每克磁微粒上所帶的羧基活性基團(tuán)的含量不低于O. 4mmol ;所述的抗熒光素抗體為單克隆抗體或多克隆抗體，純度大于等于90wt%，稀釋效價(jià)大于1:100萬。
10.根據(jù)權(quán)利要求5或8或9所述的制備方法，其特征在于所述的具有適當(dāng)pH值的緩沖液為含有O. 5%牛血清白蛋白、pH8. O的TRIS緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種游離甲狀腺素的納米磁微粒化學(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒及其制備方法和檢測(cè)方法，試劑盒包括含有熒光素標(biāo)記的游離甲狀腺抗體的溶液、包被有抗熒光素抗體的磁微粒的懸浮液，以及含有堿性磷酸酶標(biāo)記的游離甲狀腺素抗原的溶液，該堿性磷酸酶標(biāo)記的游離甲狀腺素抗原由堿性磷酸酶與游離甲狀腺素抗原通過交聯(lián)劑辛二酸二琥珀酰亞胺酯連接構(gòu)成。本發(fā)明使得能夠以更低成本和更高準(zhǔn)確度和精密度對(duì)游離甲狀腺素進(jìn)行定量檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/78GK103063852SQ20121057130
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月25日
發(fā)明者于大為, 程曉蕾, 李冬冬 申請(qǐng)人:蘇州浩歐博生物醫(yī)藥有限公司