專利名稱：測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞提取物中的nnk及其代謝物的液質(zhì)聯(lián)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及毒理學(xué)及生物化學(xué)分析領(lǐng)域，具體為一種分析4_(甲基亞硝基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)的細(xì)胞毒性的中性紅法及測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞提取物中的NNK及其代謝物的液質(zhì)聯(lián)用方法。
背景技術(shù)：
煙草特有亞硝胺(Tobacco-SpecificNitrosamines, TSNAs)是一類僅存在于煙草及煙氣中的氮亞硝胺類化合物。TSNAs屬于器官特異性致癌物質(zhì)，其作用的主要靶器官是肺部組織。TSNAs可誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生多種癌癥，其中NNK和NNN的致癌性最為強(qiáng)烈(施應(yīng)選.煙葉和煙氣中TSNAs的含量分析及其與前體物的關(guān)系[D].云南云南師范大學(xué)，2006 :15.)，國(guó)際癌癥研究組織(IARC)將NNK定為一類致癌物(Smokeless tobacco and tobacco-specific nitrosamines. IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans, vol. 89. Lyon (FR) : IARC, 2007.)。生物實(shí)驗(yàn)表明 NNK 是大鼠肺癌的強(qiáng)烈致癌劑(Brunnemann K, Hoffmann D. Analytical studies on tobacco-specific N-nitrosamines in tobacco and tobacco smoke[J]. Critical reviews in toxicology, 1991，21(4) : 235-240. )。NNK 和它的主要代謝物 NNAL 是煙氣中唯一已知的胰腺癌致癌物(Hecht S S, Chen C B, Ohmori T, Hoffmann D. Comparative carcinogenicity in F344 rats of the tobacco specific nitrosamines, N' -nitrosonornicotine and 4-(N-methyl-N-nitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butano ne [J], Cancer Res, 1980，40: 298-302 ；Hecht S S, Hoffmann D. The relevance of tobacco-specific nitrosamines to human cancer[J]. Cancer Surv.1989, 8: 273-294. )。NNK需要通過(guò)代謝活化才能表現(xiàn)其致癌性，對(duì)NNK進(jìn)行體內(nèi)體外代謝研究可以進(jìn)一步闡明煙草引發(fā)癌癥的機(jī)制，并為后續(xù)癌癥預(yù)防研究提供技術(shù)支持。在有機(jī)體一切代謝活動(dòng)與執(zhí)行功能的過(guò)程中，細(xì)胞呈現(xiàn)為一個(gè)獨(dú)立、有序、自動(dòng)控制性很強(qiáng)的代謝體系(翟中和，王喜忠，丁明孝.細(xì)胞生物學(xué)[M].北京高等教育出版社， 2000.)，是代謝與功能的基本單位。用細(xì)胞進(jìn)行體外毒理試驗(yàn)具有耗時(shí)短并且成本低的特點(diǎn)，測(cè)定體外細(xì)胞毒性可以大大減少活體動(dòng)物毒理學(xué)測(cè)定時(shí)的動(dòng)物數(shù)量，并可為確定后續(xù)染毒及分離分析試驗(yàn)的劑量提供依據(jù)。細(xì)胞毒性試驗(yàn)的多種方法中，中性紅法檢測(cè)結(jié)果與體內(nèi)LD5tl的相關(guān)性好，結(jié)果穩(wěn)定可靠，靈敏性也較高(王征，張?zhí)鞂?，朱玉平，?急性毒性體外篩選方法的比較[J].衛(wèi)生研究，2006，35 (3) J86488;隋海霞，高芄，張立實(shí)，等.保健食品快速篩選試驗(yàn)-細(xì)胞毒性方法的確定[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2004，16 (6) =485-488 .)。
對(duì)于細(xì)胞中NNK代謝物的檢測(cè)，文獻(xiàn)報(bào)道多采用[5-3H]NNK標(biāo)記，HPLC法分析 (Hecht S S. Metabolism of 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)- 1-butanone by Cultured Monkey Lung Explants[J]. Drug Metabolism and Disposition, 2000, 28(1): 5-9. ；Berhard Schrader, Hirsch-Ernst, Ekkehard scholz, et al. Metabolism of 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone in primary cultures of rat alveolar type II cells[J]. Drug Metabolism and Disposition, 2000, 28(2): 180-185. ；Mullett W Μ, Levsen K, Borlak J, et al. Automated in-tube solid-phase microextraction coupled with HPLC for the determination of N—nitrosamines in cell cultures [J], Analytical Chemistry, 2002，74(7) : 1695-1701)。同位素放射性標(biāo)記試驗(yàn)需具備相應(yīng)的安全防護(hù)措施和條件，每次試驗(yàn)或階段性試驗(yàn)結(jié)束后，都可能有不同程度的放射性污染和放射性廢物的出現(xiàn)，要面臨去污染處理和放射性廢物處理等問(wèn)題， 近年來(lái)應(yīng)用日益受限。且建立的HPLC法分析時(shí)間長(zhǎng)，分離效果不佳，峰形質(zhì)量不高。因此建立一種對(duì)所有NNK代謝物都適用且前處理簡(jiǎn)單快速、選擇性好、檢測(cè)靈敏度高的液質(zhì)聯(lián)用方法，具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問(wèn)題而專門研究的一種測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞提取物中的NNK及其代謝物的液質(zhì)聯(lián)用方法，該方法特點(diǎn)是通過(guò)毒理學(xué)與生物化學(xué)相結(jié)合，利用建立的液質(zhì)聯(lián)用方法，分析NNK在細(xì)胞中的代謝，具有前處理簡(jiǎn)單快速、選擇性好、檢測(cè)靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的
一種測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞提取物中的NNK及其代謝物的液質(zhì)聯(lián)用方法，首先利用中性紅法分析NNK的細(xì)胞毒性，選定適宜的染毒范圍，在選定的染毒范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行NNK的染毒試驗(yàn)，并對(duì)染毒后所得的細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞提取物中的NNK及其代謝物進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析。具體包括以下步驟
a.中性紅試驗(yàn)取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)，按適宜密度接種于96孔板，其中第一列作為空白對(duì)照，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24 h后染毒，將第三到八列依次加入不同濃度的 NNK染毒液，第二列、第十一列分別加入培養(yǎng)液與十二烷基磺酸鈉(SDS)作為陰性與陽(yáng)性對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)；24 h后，棄培養(yǎng)液，用PBS漂洗兩次，加入已過(guò)濾的提前對(duì)h溫育的中性紅培養(yǎng)液培養(yǎng)3 h;棄培養(yǎng)液，用PBS漂洗兩次，加入現(xiàn)配的酸乙醇洗脫液(乙醇+水+冰醋酸， 體積比50 49 :1)，置于振蕩器上震蕩混勻20 min，用酶標(biāo)儀于MO nm處測(cè)定吸光度值；
b.NNK的染毒及細(xì)胞培養(yǎng)液樣品前處理接種細(xì)胞M h后進(jìn)行NNK染毒處理，繼續(xù)培養(yǎng)對(duì)h后取出培養(yǎng)液。取1 mL培養(yǎng)液置于10 mL離心管，加入內(nèi)標(biāo)溶液(內(nèi)標(biāo)為三種氘代內(nèi)標(biāo)NNK-d4、HPB-d4、NNAL-d3的混合內(nèi)標(biāo)溶液)，加入3 mL乙腈，靜置1 h沉淀蛋白，10000 rpm離心10 min,取上清液過(guò)0. 22 μ m有機(jī)相濾膜，取200 μ L濾液于色譜瓶，用流動(dòng)相混合液(是指15%的流動(dòng)相A與85%的流動(dòng)相B的混合液，其中A指水(含10 mM甲酸銨)，B指乙腈)定容至1 mL，混勻，進(jìn)行LC-MS/MS分析測(cè)定；c.NNK的染毒及細(xì)胞提取物樣品前處理接種細(xì)胞M h后進(jìn)行NNK染毒處理，繼續(xù)培養(yǎng)對(duì)h后取出培養(yǎng)液。用PBS潤(rùn)洗細(xì)胞表面三次，取最后一次的潤(rùn)洗液留作監(jiān)測(cè)；加入胰酶進(jìn)行消化，離心后棄去上清液，得細(xì)胞沉淀，加入生理鹽水，反復(fù)吹打細(xì)胞15-30 min，將混合液移至離心管，再向原管中加入生理鹽水潤(rùn)洗，洗液一起并入離心管；向管中加入10-15 粒玻璃珠，于渦旋震蕩器上渦旋10 s，隨即放入冰水中30 s，反復(fù)幾次，再于14000 rpm，4 °C離心30 min，取上清液即得細(xì)胞提取物；取細(xì)胞提取物20 μ L，加入60 μ L乙腈沉淀蛋白，靜置1 h，10000 rpm離心10 min,取上清液；過(guò)MEPS針(指填充吸附微量萃取針)萃取后，進(jìn)行LC-MS/MS分析測(cè)定；
d.樣品分析 色譜條件
色譜柱Agilent ZORBAX HILIC Plus 柱 O. IX 100 mm, 3.5 μ m,美國(guó) Agilent 公司)；流動(dòng)相A 水(含10 mM甲酸銨)，B :乙腈；流速200 μ L/min ；洗脫方式等度15% A+85% B ；進(jìn)樣量2 μ L ；柱溫26 °C ； 質(zhì)譜條件
電離模式電噴霧電離(ESI);掃描模式正離子掃描；檢測(cè)方式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);電噴霧電壓(Ion Spray Voltage, IS):5500 V ；離子源溫度(TEM):600 °C;霧化氣(GS1，N2): 65 psi ；輔助加熱氣(GS2，N2):60 psi ；氣簾氣(Curtain gas, CUR, N2) :35 psi ；碰撞氣 (Collision gas, CAD, N2):8 psi ；駐留時(shí)間(Dwell Time):50 ms ；入口電壓 EP(Entrance Potential) 10 V;出口電壓 CXP (Collision Cell Exit Potential) :12 V。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)條件下各分析物及內(nèi)標(biāo)化合物的母離子、子離子以及優(yōu)化的去簇電壓DP和碰撞能量CE值如下表1所示。表1分析物及內(nèi)標(biāo)物的MRM參數(shù)
Table 1 MRM parameters of the analytes and internal standards
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞提取物中的NNK及其代謝物的液質(zhì)聯(lián)用方法，其特征在于首先利用中性紅法分析NNK的細(xì)胞毒性，選定適宜的染毒范圍，在選定的染毒范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行NNK的染毒試驗(yàn)，并對(duì)染毒后所得的細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞提取物中的NNK及其代謝物進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞提取物中的NNK及其代謝物的液質(zhì)聯(lián)用方法，其特征在于具體包括以下步驟a.中性紅試驗(yàn)取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)，按適宜密度接種于96孔板，其中第一列作為空白對(duì)照，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24 h后染毒，將第三到八列依次加入不同濃度的 NNK染毒液，第二列、第十一列分別加入培養(yǎng)液與十二烷基磺酸鈉(SDS)作為陰性與陽(yáng)性對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)；24 h后，棄培養(yǎng)液，用PBS漂洗兩次，加入已過(guò)濾的提前對(duì)h溫育的中性紅培養(yǎng)液培養(yǎng)3 h ；棄培養(yǎng)液，用PBS漂洗兩次，加入現(xiàn)配的酸乙醇洗脫液，置于振蕩器上震蕩混勻20 min，用酶標(biāo)儀于MO nm處測(cè)定吸光度值；b.NNK的染毒及細(xì)胞培養(yǎng)液樣品前處理接種細(xì)胞M h后進(jìn)行NNK染毒處理，繼續(xù)培養(yǎng)對(duì)h后取出培養(yǎng)液；取1 mL培養(yǎng)液置于10 mL離心管，加入內(nèi)標(biāo)溶液，加入3 mL乙腈，靜置1 h沉淀蛋白， 10000 rpm離心10 min,取上清液過(guò)0. 22 μ m有機(jī)相濾膜，取200 μ L濾液于色譜瓶，用流動(dòng)相混合液定容至1 mL，混勻，進(jìn)行LC-MS/MS分析測(cè)定；c.NNK的染毒及細(xì)胞提取物樣品前處理接種細(xì)胞M h后進(jìn)行NNK染毒處理，繼續(xù)培養(yǎng)對(duì)h后取出培養(yǎng)液；用PBS潤(rùn)洗細(xì)胞表面三次，取最后一次的潤(rùn)洗液留作監(jiān)測(cè)；加入胰酶進(jìn)行消化，離心后棄去上清液，得細(xì)胞沉淀，加入生理鹽水，反復(fù)吹打細(xì)胞15-30 min，將混合液移至離心管， 再向原管中加入生理鹽水潤(rùn)洗，洗液一起并入離心管；向管中加入10-15粒玻璃珠，于渦旋震蕩器上渦旋10 s，隨即放入冰水中30 s，反復(fù)幾次，再于14000 rpm, 4 °C離心30 min，取上清液即得細(xì)胞提取物；取細(xì)胞提取物20 yL，加入60 PL乙腈沉淀蛋白，靜置1 h，10000 rpm離心10 min,取上清液；過(guò)MEPS針萃取后，進(jìn)行LC-MS/MS分析測(cè)定；d.樣品分析色譜條件色譜柱Agilent ZORBAX HILIC Plus柱；流動(dòng)相A 水(含10 mM甲酸銨)，B 乙腈；流速200 μ L/min ；洗脫方式等度15% A+85% B ；進(jìn)樣量2 μ L ；柱溫26 V ；質(zhì)譜條件電離模式電噴霧電離(ESI);掃描模式正離子掃描；檢測(cè)方式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);電噴霧電壓(Ion Spray Voltage, IS):5500 V ；離子源溫度(TEM):600 °C;霧化氣(GS1，N2): 65 psi ；輔助加熱氣(GS2，N2):60 psi ；氣簾氣(Curtain gas, CUR, N2) :35 psi ；碰撞氣 (Collision gas, CAD, N2):8 psi ；駐留時(shí)間(Dwell Time):50 ms ；入口電壓 EP(Entrance Potential) 10 V;出口電壓 CXP (Collision Cell Exit Potential) :12 V。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞提取物中的NNK及其代謝物的液質(zhì)聯(lián)用方法，其特征在于所使用的色譜柱為美國(guó)Agilent公司的Agilent ZORBAX HILIC Plus 柱，型號(hào)為 2. IX 100 mm, 3.5 μ m。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞提取物中的NNK及其代謝物的液質(zhì)聯(lián)用方法，其特征在于步驟a中的酸乙醇洗脫液為乙醇+水+冰醋酸，體積比50 :49 :1。
全文摘要
一種測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞提取物中的NNK及其代謝物的液質(zhì)聯(lián)用方法，其特征在于首先利用中性紅法分析NNK的細(xì)胞毒性，選定適宜的染毒范圍，在選定的染毒范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行NNK的染毒試驗(yàn)，并對(duì)染毒后所得的細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞提取物中的NNK及其代謝物進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析。該方法特點(diǎn)是通過(guò)毒理學(xué)與生物化學(xué)相結(jié)合，利用建立的液質(zhì)聯(lián)用方法，分析NNK在細(xì)胞中的代謝，具有前處理簡(jiǎn)單快速、選擇性好、檢測(cè)靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N27/62GK102507766SQ20111031995
公開日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月20日
發(fā)明者劉克建, 劉惠民, 尚平平, 張建勛, 李翔, 王娟, 王昇, 趙貝貝 申請(qǐng)人:中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院