專利名稱：新生兒ABO/Rh血型鑒定試劑卡及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新生兒血型定型及其應用。更具體的說，本發(fā)明涉及一種ABOAh 血型定型試劑卡的組成、制備方法及其應用，涉及新生兒溶血病的早期診斷和輸血醫(yī)學領域。
背景技術：
新生兒溶血病(簡稱HDN)是發(fā)生在胎兒和早期新生兒的一種免疫性溶血性疾病。 該病由母嬰血型不配合引起。當胎兒由父體遺傳獲得的顯性抗原恰為母體缺乏時，此抗原在妊娠時通過胎盤進入母體，刺激母體產(chǎn)生相應的免疫抗體，此抗體可因再次懷孕得到刺激而加強。母體內(nèi)存在的與胎兒抗原相對應的免疫性抗體可通過胎盤進入胎兒體內(nèi)，與胎兒紅細胞上相應抗原結合，導致胎兒紅細胞破壞，引起死胎、流產(chǎn)或早產(chǎn)。出生后表現(xiàn)為貧血、黃疸，嚴重會導致心力衰竭及核黃疸甚至死亡。有資料表明中國有30 %妊娠存在血型不合，新生兒溶血病的發(fā)病率為11.9%。
由免疫產(chǎn)生的血型抗體多數(shù)為IgG抗體，而天然存在的血型抗體多數(shù)為IgM抗體。 大量的免疫血液學實驗證明，只有分子量較小的IgG免疫抗體能通過胎盤進入胎兒體內(nèi)引起新生兒溶血病。因此新生兒溶血病可以發(fā)生在所有能免疫產(chǎn)生IgG抗體的血型系統(tǒng)，但主要發(fā)生在ABO及1 系統(tǒng)，其中ABO系統(tǒng)的新生兒溶血病病情一般較輕，Mi系統(tǒng)的新生兒溶血病病情較嚴重，其他血型系統(tǒng)不合溶血病如Kidd、MN、Duffy等也有報道，但極少見?？?Pl、抗Lea、Leb等屬IgM性質(zhì)，不能通過胎盤，故不會產(chǎn)生HDN。
新生兒溶血病是新生兒期的常見病之一，如及早診斷治療，治愈率較高，比較少遺留神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，未及時診斷治療者，可發(fā)生嚴重并發(fā)癥核黃疸則會遺留智力低下、聽覺障礙、抽搐等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。故及早診斷、治療是本病的關鍵。因此，對新生兒溶血病作產(chǎn)后早期診斷以便及時采取預防措施是很重要的。要做到胎兒早期診斷就必須對新生兒作正確的免疫學分析及血型血清學檢查。
新生兒由于出生時ABO抗原還沒發(fā)育完全，直到18個月后才充分發(fā)育，而Mi血型抗原在出生時一般已形成。新生兒出生時，除少數(shù)有微量的IgM抗體外，尚未形成自己的 IgG、IgA和IgE，大部分嬰兒要在出生幾個月以后形成血型抗體。所以新生兒ABO血型檢測以正定型為主，與成人相比，抗原、抗體表達弱，存在漏檢的風險，容易造成血型鑒定和交叉配血困難。正確的血型鑒定與選擇高靈敏度交叉配血方法是保證新生兒安全輸血前提和保障。有助于新生兒溶血病的及時確診和治療。傳統(tǒng)的血型鑒定、交叉配血的方法也就是撥片法、鹽水配血法，操作煩瑣、易漏檢、錯檢，不能包成檢測結果的正確，嚴重危害了受血者的生命安全。然而，目前國內(nèi)尚無任何新生兒溶血病檢測的試劑盒銷售，各地醫(yī)院及血液中心的檢測方法五花八門，不能準確鑒定能引起新生兒溶血病的抗體實際情況。
在國內(nèi)外，有些產(chǎn)家生產(chǎn)用于ABO血型定型和1 定型的ABOAh血型定型檢測試劑卡，但其采用的凝膠為葡聚糖凝膠，此凝膠顆粒的直徑大約在20-50微米。此外，已有的卡僅進行僅進行MiIgM抗體的檢測，不進行1 IgG抗體的測定，降低了 ABOAh血型定型的準確性，容易導致ABOAh血型的錯誤。 發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明點目的在于提供一種靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好的新生兒ABOAh血型鑒定試劑卡及其制備方法。
本發(fā)明的技術解決方案是
一種新生兒ABOAh血型鑒定試劑卡，其特征是具有8個微柱凝膠管，分別是一管為含有IgM性質(zhì)的單克隆抗A抗體的凝膠管、一管為含有IgM性質(zhì)的單克隆抗B抗體的凝膠管、一管為含有IgM性質(zhì)的單克隆抗AB抗體的凝膠管、一管為含有IgM性質(zhì)的單克隆抗D抗體的凝膠管、一管為含有IgM性質(zhì)和IgG性質(zhì)的單克隆抗D抗體的凝膠管、一管為用于陰性對照的含有凝膠懸浮介質(zhì)的凝膠管、一管為含有抗IgG試劑的凝膠管和一管為含有抗IgG試劑及抗C3d試劑的凝膠管。
一種新生兒ABOAh血型鑒定試劑卡的制備方法，其特征是包括下列步驟
1)凝膠懸浮緩沖液的配制
所述緩沖液配方如下
20mL的0. 15M磷酸鹽緩沖液
氯化鈉1.75g
甘氨酸18g
其中20mL的0. 15M磷酸鹽緩沖液是由11. 3mL的0. 15MKH2P04和8. 7mL的0. 15M Na2HPO4 組成；
以上試劑用800毫升蒸餾水溶解，用IM氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH至6. 7，最后定容至一升；
添加對羥基苯甲酸甲酯0. 6g和對羥基苯甲酸丙酯0. 13g，添加牛血清白蛋白，添加量為使牛血清白蛋白的終濃度為3% ；得到凝膠懸浮緩沖液；
2)凝膠的準備
選用葡聚糖凝膠，顆粒大小為20-50微米，用步驟1)配得的凝膠懸浮緩沖液充分浸泡后再用該凝膠懸浮緩沖液洗滌3-5次，除去凝膠破損碎片，收集得到顆粒大小均勻完整呈球形的凝膠；
3)抗體的選擇
選擇IgM性質(zhì)的單克隆抗A抗體，效價彡128
選擇IgM性質(zhì)的單克隆抗B抗體，效價彡128
選擇IgM性質(zhì)的單克隆抗AB抗體，效價彡128
選擇IgM性質(zhì)的單克隆抗D抗體，效價彡64
選擇IgG性質(zhì)和IgM性質(zhì)的單克隆抗D抗體，效價彡64
抗IgG試劑的選擇要求按照體積比1 2和體積比1 4稀釋的抗人球蛋白試劑，必須對按照體積比1 16稀釋的抗D IgG致敏的紅細胞有肉眼可見凝集；
抗C3d試劑的選擇要求按照體積比1 2和體積比1 4稀釋的抗C3d試劑必須對C3d致敏的紅細胞有肉眼可見凝集，與抗C3d試劑原液的反應強度> 1+ ；
4)凝膠的配制
將步驟幻準備的凝膠與步驟幻所選擇的各個抗體按照體積65% 35%的比例混合，分別配制成含有IgM性質(zhì)的單克隆抗A抗體的凝膠、含有IgM性質(zhì)的單克隆抗B抗體的凝膠、含有IgM性質(zhì)的單克隆抗AB抗體的凝膠、含有IgM性質(zhì)的單克隆抗D抗體的凝膠、 含有IgG性質(zhì)和IgM性質(zhì)的單克隆抗D抗體的凝膠、含有抗IgG試劑的凝膠；將步驟2)準備的凝膠與步驟幻的抗IgG試劑及抗C3d試劑按照體積比65% 17.5% 17. 5%配制成含有抗IgG試劑及抗C3d試劑的凝膠，將步驟2、準備的凝膠與步驟1)中配得的凝膠懸浮緩沖液按照體積65% 35%的比例混合，配制成含有凝膠懸浮介質(zhì)的凝膠。
5)分裝
將步驟4)中配制得到的各凝膠分別加到一空白卡片的8個微柱管中，形成具有8 個微柱凝膠管的新生」L檢測試劑卡。
本發(fā)明優(yōu)點在于
①使用具有很強緩沖能力的緩沖體系，采用磷酸鹽和氨基酸組成的緩沖體系，體系的PH維持在6. 7左右。與常規(guī)輸血領域使用的枸櫞酸緩沖體系相比，具有更強的緩沖能力，有利于保證整個體系處于合適的緩沖范圍。
②本發(fā)明的凝膠緩沖液具有低離子濃度體系，用氨基酸和氯化鈉作為添加劑，輔助微量的磷酸鹽維持低離子強度環(huán)境，保持凝膠顆粒呈圓球顆粒并充分溶脹，使凝膠顆粒的直徑大小控制在一定的范圍內(nèi)。同時低離子強度鹽水可以增加抗原抗體之間的引力，使原來在鹽水介質(zhì)中不能凝集紅細胞的抗體能夠發(fā)生凝集?？杉涌旆磻俣?，縮短保溫的時間。
③本緩沖液具有潤滑體系，采用一定濃度的牛血清白蛋白，使得紅細胞通過凝膠間隙時獲得合適的潤滑能力，使無凝集的紅細胞具有完全通過凝膠間隙的能力，而凝集的紅細胞則不能通過。
④具有防腐作用，大量文獻證實選擇有機物苯甲酸酯類作為防腐劑，能有效防止細菌的繁衍，相對于疊氮鈉不僅具有更長時間的保存期，而且可以避免使用疊氮鈉化學防腐劑對凝膠懸浮介質(zhì)體系的離子強度提升而引起的對新生兒ABOAh血型鑒定試劑卡的靈敏度和特異性產(chǎn)生的不良影響。
本發(fā)明的另一方面，為了保證本發(fā)明新生兒ABOAh血型鑒定試劑卡的質(zhì)量，在凝膠準備過程中需要選擇適當?shù)哪z，現(xiàn)所選擇的凝膠顆粒直徑為20-50微米。通過對葡聚糖凝膠顆粒進行充分溶脹，洗滌去除破損的凝膠顆粒和超大或超小凝膠顆粒。洗滌后的凝膠用懸浮緩沖液來懸浮凝膠。除了篩選凝膠的顆粒外，另外還需選擇合適效價的抗體。
本發(fā)明的新生兒ABOAh血型鑒定試劑卡之所以具有優(yōu)良的特異性、靈敏度以及長達1年半的保存期，是在于整個體系各種成分的協(xié)同作用，凝膠顆粒排列于一張卡上可以完成新生兒ABOAh血型鑒定，緩沖體系可以維持反應體系需要的pH，低鹽弄許體系可以保證凝膠顆粒得到充分溶脹且凝膠顆粒直徑在所需要的范圍內(nèi)。潤滑體系可以保證凝膠顆粒之間的潤滑能力。有機防腐劑可以防止凝膠或抗體因細菌污染而失效。呈球形的凝膠可以保證凝膠顆粒之間合適的間隙。合適的抗體為抗原的檢測提供有效的保障。
本新生兒ABOAh血型鑒定試劑卡可以用于ABOjh(D)血型確認，產(chǎn)生的陽性反應不低于3+。一般在2-25°C條件下保存有效期不低于18個月。
本發(fā)明的實施為新生兒ABO、Rh(D)血型鑒定提供了標準化，各大醫(yī)院和采供血機構可以用本標準一致的新生兒ABOAh(D)血型鑒定試劑卡，準確的確認ABOAh(D)血型，對新生」L溶血病早期診斷治療創(chuàng)造了條件。
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
具體實施方式
一種新生兒ABO/他血型鑒定試劑卡的制備方法，其特征是包括下列步驟
1)凝膠懸浮緩沖液的配制
所述緩沖液配方如下
20mL的0. 15M磷酸鹽緩沖液
氯化鈉1. 75g
甘氨酸18g
其中20mL的0. 15M磷酸鹽緩沖液是由11. 3mL的0. 15MKH2P04和8. 7mL的0. 15M Na2HPO4 組成；
以上試劑用800毫升蒸餾水溶解，用IM氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6. 7，最后定容至一升；
添加對羥基苯甲酸甲酯0. 6g和對羥基苯甲酸丙酯0. 13g，添加牛血清白蛋白，添加量為使牛血清白蛋白的終濃度為3% ；得到凝膠懸浮緩沖液；
2)凝膠的準備
選用葡聚糖凝膠，顆粒大小為20-50微米，用步驟1)配得的凝膠懸浮緩沖液充分浸泡后再用該凝膠懸浮緩沖液洗滌3-5次，除去凝膠破損碎片，收集得到顆粒大小均勻完整呈球形的凝膠；
3)抗體的選擇
選擇IgM性質(zhì)的單克隆抗A抗體，效價彡128
選擇IgM性質(zhì)的單克隆抗B抗體，效價彡128
選擇IgM性質(zhì)的單克隆抗AB抗體，效價彡128
選擇IgM性質(zhì)的單克隆抗D抗體，效價彡64
選擇IgG性質(zhì)和IgM性質(zhì)的單克隆抗D抗體，效價彡64
抗IgG試劑的選擇要求按照體積比1 2和體積比1 4稀釋的抗人球蛋白試劑，必須對按照體積比1 16稀釋的抗D IgG致敏的紅細胞有肉眼可見凝集；
抗C3d試劑的選擇要求按照體積比1 2和體積比1 4稀釋的抗C3d試劑必須對C3d致敏的紅細胞有肉眼可見凝集，與抗C3d試劑原液的反應強度> 1+ ；
4)凝膠的配制
將步驟2)準備的凝膠與步驟3)所選擇的各個抗體(或試劑)按照體積 65% 35%的比例混合，分別配制成含有IgM性質(zhì)的單克隆抗A抗體的凝膠、含有IgM性質(zhì)的單克隆抗B抗體的凝膠、含有IgM性質(zhì)的單克隆抗AB抗體的凝膠、含有IgM性質(zhì)的單克隆抗D抗體的凝膠、含有IgG性質(zhì)和IgM性質(zhì)的單克隆抗D抗體的凝膠、含有抗IgG 試劑的凝膠；將步驟幻準備的凝膠與步驟幻的抗IgG試劑及抗C3d試劑按照體積比 65% 17.5% 17.5%配制成含有抗IgG試劑及抗C3d試劑的凝膠，將步驟幻準備的凝膠與步驟1)中配得的凝膠懸浮緩沖液按照體積65% 35%的比例混合，配制成含有凝膠懸浮介質(zhì)的凝膠。
5)分裝
將步驟4)中配制得到的各凝膠混合均勻后按照每管40微升的量分別加到一空白卡片的8個微柱管中，形成具有8個微柱凝膠管的新生兒檢測試劑卡。
6)半成品檢測
要求將分裝好的微柱凝膠管，具有與抗體相應抗原的紅細胞產(chǎn)生陽性反應，即紅細胞集中在凝膠上層表面，呈現(xiàn)直線型。而與不含抗體對應抗原的紅細胞產(chǎn)生陰性反應，即紅細胞可以全部通過凝膠到達微管底部，沉積在微管底部。而不含抗體只含有凝膠懸浮介質(zhì)和凝膠混合物的凝膠管中紅細胞可以全部通過凝膠到達微管底部，沉積在微管底部，呈現(xiàn)陰性反應。
7)封口
用鋁箔紙通過壓膜方式將微柱管上口密封。貼標簽標記后于2-25°C保存。
8)保存實驗
上述完成的ABOAh定型檢測試劑卡可以保存18個月，保存期間，該ABOAh血型定型試劑卡具有以下檢測結果
(1)外觀
新生兒ABO/他血型定型檢測試劑卡是8個微柱管組成，凝膠均為乳白色，膠面上端有l(wèi)_2mm清澈透明的液體，凝膠顆粒之間不應有氣泡和異物。
(2)靈敏度
含有抗體的微柱凝膠管中，具有與抗體相應抗原的紅細胞產(chǎn)生陽性反應，且紅細胞集中在凝膠上層表面，呈現(xiàn)直線型。
(3)特異性
含抗體的微柱凝膠管中，具有與抗體相應抗原的紅細胞產(chǎn)生陽性反應，即紅細胞集中在凝膠上層表面，呈現(xiàn)直線型。與不含抗體對應抗原的紅細胞產(chǎn)生陰性反應，即紅細胞可以全部通過凝膠到達微管底部，沉積在微管底部。而不含抗體只含有凝膠懸浮介質(zhì)和凝膠混合物的凝膠管中紅細胞可以全部通過凝膠到達微管底部，沉積在微管底部，呈現(xiàn)陰性反應。
上述新生兒AB0/I h血型定型檢測試劑卡使用方法
ABOAh血型定型檢測試劑卡由8個凝膠管組成，其中第一管含有IgM性質(zhì)的單克隆抗A抗體的凝膠，第二管含有IgM性質(zhì)的單克隆抗B抗體的凝膠，第三管含有IgM性質(zhì)的單克隆抗AB抗體的凝膠，第四管含有IgM性質(zhì)的單克隆抗D抗體的凝膠，第五管含有IgM 性質(zhì)和IgG性質(zhì)的單克隆抗D抗體的凝膠管，第六管用于陰性對照的含有凝膠懸浮介質(zhì)的凝膠，第七管含有抗IgG抗體的凝膠管，第八管含有IgM性質(zhì)的單克隆抗IgG+C3d抗體的凝膠管。
1、用低離子鹽溶液(LISQ或生理鹽水(賂)將待測者紅細胞配制成0. 8% (ν/ν)， 分別加入第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七和第八支微管中，50μ L/管。
2、室溫孵育lOmin，用微柱凝膠卡專用離心機離心，900rpm2min，1500rpm 3min，取出后肉眼判定結果，記錄。
3、結果判斷
陽性結果紅細胞懸浮在凝膠表面或膠中。
陰性結果紅細胞沉積于微柱凝膠的底部。
權利要求
1.一種新生兒ABOAh血型鑒定試劑卡，其特征是具有8個微柱凝膠管，分別是一管為含有IgM性質(zhì)的單克隆抗A抗體的凝膠管、一管為含有IgM性質(zhì)的單克隆抗B抗體的凝膠管、一管為含有IgM性質(zhì)的單克隆抗AB抗體的凝膠管、一管為含有IgM性質(zhì)的單克隆抗 D抗體的凝膠管、一管為含有IgM性質(zhì)和IgG性質(zhì)的單克隆抗D抗體的凝膠管、一管為用于陰性對照的含有凝膠懸浮介質(zhì)的凝膠管、一管為含有抗IgG試劑的凝膠管和一管為含有抗 IgG試劑及抗C3d試劑的凝膠管。
2.—種權利要求1所述的新生兒ABOAh血型鑒定試劑卡的制備方法，其特征是包括下列步驟1)凝膠懸浮緩沖液的配制所述緩沖液配方如下20 mL的0. 15 M磷酸鹽緩沖液氯化鈉1. 75 g甘氨酸18 g其中20 mL的0. 15 M磷酸鹽緩沖液是由11.3 mL的0. 15 M KH2PO4和8. 7 mL的0. 15 M Na2HPO4 組成；以上試劑用800毫升蒸餾水溶解，用1 M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6. 7，最后定容至一升； 添加對羥基苯甲酸甲酯0. 6g和對羥基苯甲酸丙酯0. 13g，添加牛血清白蛋白，添加量為使牛血清白蛋白的終濃度為3% ；得到凝膠懸浮緩沖液；2)凝膠的準備選用葡聚糖凝膠，顆粒大小為20-50微米，用步驟1)配得的凝膠懸浮緩沖液浸泡后再用該凝膠懸浮緩沖液洗滌3-5次，除去凝膠破損碎片，收集得到顆粒大小均勻完整呈球形的凝膠；3)抗體的選擇選擇IgM性質(zhì)的單克隆抗A抗體，效價> 128 選擇IgM性質(zhì)的單克隆抗B抗體，效價> 128 選擇IgM性質(zhì)的單克隆抗AB抗體，效價> 128 選擇IgM性質(zhì)的單克隆抗D抗體，效價> 64 選擇IgG性質(zhì)和IgM性質(zhì)的單克隆抗D抗體，效價> 64抗IgG試劑的選擇要求按照體積比1:2和體積比1:4稀釋的抗人球蛋白試劑，必須對按照體積比1:16稀釋的抗D IgG致敏的紅細胞有肉眼可見凝集；抗C3d試劑的選擇要求按照體積比1 2和體積比1 4稀釋的抗C3d試劑必須對C3d 致敏的紅細胞有肉眼可見凝集，與抗C3d試劑原液的反應強度> 1+ ；4)凝膠的配制將步驟2)準備的凝膠與步驟3)所選擇的各個抗體按照體積65% 35%的比例混合， 分別配制成含有IgM性質(zhì)的單克隆抗A抗體的凝膠、含有IgM性質(zhì)的單克隆抗B抗體的凝膠、含有IgM性質(zhì)的單克隆抗AB抗體的凝膠、含有IgM性質(zhì)的單克隆抗D抗體的凝膠、含有 IgG性質(zhì)和IgM性質(zhì)的單克隆抗D抗體的凝膠、含有抗IgG試劑的凝膠；將步驟2)準備的凝膠與步驟3)的抗IgG試劑及抗C3d試劑按照體積比65%: 17. 5%: 17. 5%配制成含有抗IgG 試劑及抗C3d試劑的凝膠，將步驟2)準備的凝膠與步驟1)中配得的凝膠懸浮緩沖液按照體積65% 35%的比例混合，配制成含有凝膠懸浮介質(zhì)的凝膠； 5)分裝將步驟4)中配制得到的各凝膠分別加到一空白卡片的8個微柱管中，形成具有8個微柱凝膠管的新生」L檢測試劑卡。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新生兒ABO/Rh血型鑒定試劑卡及其制備方法，具有8個微柱凝膠管，一管為含有IgM性質(zhì)的單克隆抗A抗體的凝膠管、一管為含有IgM性質(zhì)的單克隆抗B抗體的凝膠管、一管為含有IgM性質(zhì)的單克隆抗AB抗體的凝膠管、一管為含有IgM性質(zhì)的單克隆抗D抗體的凝膠管、一管為含有IgM性質(zhì)和IgG性質(zhì)的單克隆抗D抗體的凝膠管、一管為用于陰性對照的含有凝膠懸浮介質(zhì)的凝膠管、一管為含有抗IgG試劑的凝膠管和一管為含有抗IgG試劑及抗C3d試劑的凝膠管。本發(fā)明為新生兒ABO、Rh(D)血型鑒定提供了標準化，為準確的確認ABO/Rh(D)血型，對新生兒溶血病早期診斷治療創(chuàng)造了條件。
文檔編號G01N33/80GK102507961SQ20111032229
公開日2012年6月20日 申請日期2011年10月21日 優(yōu)先權日2011年10月21日
發(fā)明者施秀英, 朱曉霞, 王惠民 申請人:江蘇中盛醫(yī)學診斷試劑有限公司