專利名稱：熒光定量檢測萊克多巴胺的試劑盒和熒光標記液的制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學檢驗領域，具體地說，本發(fā)明涉及一種熒光定量檢測萊克多巴胺 (RCT)的免疫層析檢測試劑盒和熒光標記液的制備方法。
背景技術：
常見的興奮劑有克侖特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇等，克侖特羅俗稱“瘦肉精”。隨著中國對克侖特羅監(jiān)管力度的加大，萊克多巴胺的使用逐漸減少，其他興奮劑的使用逐漸增加。萊克多巴胺是美國最新研制出的一種興奮劑，1999年12月美國食品與藥品管理局(FDA)批準萊克多巴胺可以使用在豬養(yǎng)殖，萊克多巴胺也是歐盟惟一允許使用的 β-興奮劑。中國也有研制專利報道，萊克多巴胺正作為克侖特羅的替代品被廣泛使用。但中國農業(yè)部、衛(wèi)生部、國家藥品監(jiān)督管理局明文禁止萊克多巴胺用于動物養(yǎng)殖，因此開發(fā)萊克多巴胺的快速、準確的測定試劑盒是當務之急。在現有技術中，張漫、羅曉琴等(《動物保健》2006年09期，《萊克多巴胺殘留檢測方法》)認為在萊克多巴胺的殘留檢測方法中，酶聯(lián)免疫方法是目前最理想的檢測方法，具有快速、簡便、操作簡單以及一次檢測樣品量大的特點，可以直接對尿液、飼料樣品進行檢測。申請?zhí)枮?00510071059. 0的發(fā)明專利，涉及一種萊克多巴胺檢測方法，是利用免疫親和層析柱及酶聯(lián)免疫吸附的方法來檢測食品中的萊克多巴胺殘留，首先通過合成抗原、包被抗原、動物免疫、抗體純化等步驟制備多克隆抗體，再將此抗體交聯(lián)到瓊脂糖凝膠上，制備免疫親和層析柱。被檢樣品處理后，通過親和柱以富集其中的萊克多巴胺，收集親和柱的洗脫液進行酶聯(lián)免疫吸附檢測，以確定其中的萊克多巴胺的含量。但是上述兩種方法均是液相檢測，溶液操作，以吸光度來定量檢測萊克多巴胺，不便于在現場大規(guī)模篩查和地域偏遠不發(fā)達的地區(qū)使用。申請?zhí)枮?005201365 . 8，發(fā)明名稱為萊克多巴胺膠體金免疫層析檢測試紙的實用新型專利，是由吸收層、膠體金標記層、檢測反應層以及吸水層依次設置在背襯上組成。 但是以膠體金法檢測，缺點是靈敏性較差，檢測限較難質控。另外，使用標記墊固相反應的缺點為生產工藝復雜化，且每次反應的結果均有較大的出入，誤差較大，影響檢測結果的靈敏性和精確度。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服上述現有技術的缺陷，提供一種成本低廉、操作簡便、靈敏性高的一種熒光定量檢測萊克多巴胺的免疫層析試劑盒。為實現上述目的，本發(fā)明采取了以下技術方案一種熒光定量檢測萊克多巴胺(RCT)的免疫層析試劑盒，該試劑盒包括試紙條和熒光標記液，所述試紙條由樣品墊、硝酸纖維素包被膜、吸水紙順次搭接粘貼在底板上構成；所述硝酸纖維素包被膜包括檢測區(qū)(T區(qū))和質控區(qū)(C區(qū))；所述檢測區(qū)包被有 RCT-BSA偶聯(lián)物(萊克多巴胺-牛血清白蛋白偶聯(lián)物)，所述質控區(qū)包被抗兔IgG ；所述熒光標記液中含有熒光標記RCT抗體(萊克多巴胺抗體)和熒光標記兔IgG。優(yōu)選地，所述硝酸纖維素包被膜質控區(qū)(C區(qū))，抗兔IgG的包被液濃度為0. 2 4mg/ml，用量為 90 μ l/27_35cm。優(yōu)選地，所述硝酸纖維素包被膜檢測區(qū)(T區(qū))，RCT-BSA偶聯(lián)物的包被液濃度為 0. 2 4mg/ml，用量為 90 μ l/27_35cm。更優(yōu)選地，所述硝酸纖維素包被膜質控區(qū)，抗兔IgG的包被液濃度為0. 5 1. 5mg/ ml ；RCT-BSA偶聯(lián)物的包被液濃度為1 2mg/ml。優(yōu)選地，所述熒光標記液中的熒光標記RCT抗體的濃度為2 5ug/ml，熒光標記兔IgG的濃度為2 5ug/ml。使用時，采用相同的濃度。所述熒光標記液的激發(fā)波長 (Ex) 310 550nm，發(fā)射波長為 340 620nm。本發(fā)明另一發(fā)明目的是提供了一種上述熒光標記液的制備方法。具體采取了以下技術方案所述熒光標記液的制備方法，其步驟如下A.含羧基的熒光素或熒光膠乳標記液的制備方法將18-22mg的熒光素或480_520mg熒光膠乳標記物與50mgRCT抗體或兔IgG混合后，邊攪拌邊緩慢加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，使其整個反應體系中EDC的含量為0. 1-0. :3mg，N-羥基琥珀酰亞胺的含量為 0.1-0. ang，在低溫下2 8°C避光反應過夜；用透析或其他方法去除雜質，用熒光保護劑復溶；或B.含氨基的熒光素或熒光膠乳標記液的制備方法將18-22mg的熒光素或480_520mg mg熒光膠乳標記物與65mgRCT抗體或兔IgG 混合后，置于4 40°C環(huán)境，調節(jié)體系pH6. 8 9. 0，一邊攪拌一邊緩慢加入0. 2 1 %戊二醛；反應2 5小時，透析或其他方法去除雜質，用熒光保護劑復溶；或C.含硫碳酰胺鍵的熒光素或熒光膠乳標記液的制備方法用pH8. 0 pH9. 6碳酸緩沖液分別溶解45mg RCT抗體或兔IgG，用pH8. 0 pH9. 6 碳酸緩沖液溶解或懸浮18-22mg熒光素或480-520mg熒光膠乳；邊攪拌邊將上述溶解的熒光素或熒光膠乳漸漸加入球蛋白溶液中，加完后，繼續(xù)避光攪拌10-14小時，結合完畢后， 裝入透析袋中，用上述碳酸緩沖鹽水透析過夜，用熒光保護劑復溶。本發(fā)明所述的萊克多巴胺的免疫層析試紙盒的檢測原理是競爭法，熒光素分子或熒光膠乳微粒與RCT抗體共價結合。將檢測樣本(尿樣或提取液)加入熒光標記物中，其熒光標記RCT抗體可與尿液中的RCT結合，形成復合物；而包被在硝酸纖維素膜上檢測區(qū)(T) 的RCT-BSA偶聯(lián)物也競爭結合熒光標記RCT抗體。當含RCT樣本與熒光標記物混合后滴加至試紙條的上，在層析作用下混合液沿著硝酸纖維素膜向前移動，樣本中所含RCT量越多， 可與T區(qū)RCT-BSA偶聯(lián)物結合的熒光標記的抗體越少，從而使T區(qū)測得熒光檢出值降低。通過熒光檢測儀掃描T區(qū)熒光信號強度，可檢測出樣本中RCT含量。本發(fā)明的萊克多巴胺免疫層析試紙條與GC/MS、HPLC等色譜儀器以及酶免法檢測萊克多巴胺相比，具有簡便(簡單操作一步完成)、適合不同數量樣本檢測和快速(15分鐘左右即可有結果)等優(yōu)點；與免疫膠體金標記試紙條相比，本發(fā)明具有靈敏度更高、準確定
量等優(yōu)點。本發(fā)明的萊克多巴胺層析試劑盒，采用熒光標記液與樣本預先混合的方法，使反應與信號釋放更加均一，與其他層析法相比，其批量生產的精密度和準確度達到最好效果。 在熒光定量檢測儀上可以達到僅10秒就能對萊克多巴胺進行靈敏的定量測定，更快更精確的測定動物組織中所含的萊克多巴胺殘留；萊克多巴胺層析試紙條具有良好的準確度 (回收率為80% -110% )，定量偏差20%以內)和高靈敏度(靈敏度達0. 2ug/kg)，需要的樣品量少(SOul)，操作非常簡便。


圖1是本發(fā)明的所述熒光定量檢測萊克多巴胺層析試劑盒中試紙條的結構示意圖；圖2是本發(fā)明的所述熒光定量檢測萊克多巴胺層析試劑盒中試紙條的結構示意圖；圖3是本發(fā)明的所述熒光定量檢測萊克多巴胺層析試劑盒中用于放置試紙條的檢測卡的結構示意圖。
具體實施例方式本發(fā)明所述熒光標記液為熒光素與蛋白的標記物或帶有熒光膠乳與蛋白的標記物，其中所使用的熒光素為異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明、藻紅蛋白、多甲藻綠素蛋白、鑭系螯合物、羧基熒光素、香豆素等其中的一種或幾種。在本發(fā)明實施例中，所采用的RCT抗體為常規(guī)單克隆抗體技術制備的單抗，所采用的RCT-BSA偶聯(lián)物(即萊克多巴胺抗原)即是利用常規(guī)化學合成方法得到，利用競爭法的原理檢測標本。以下結合附圖和具體實施例來詳細說明本發(fā)明。實施例一在該實施例中，熒光定量檢測萊克多巴胺免疫層析試劑盒，包括有試紙條和熒光標記液。其中，按試紙條的常規(guī)方法，試紙條由樣品墊1、包括檢測區(qū)(T區(qū))3和質控區(qū)(C 區(qū))4的硝酸纖維素包被膜2、吸水紙5依次相互搭接地粘貼在底板6上而構成，如圖1和圖 2所示。在該實施例中，包被膜的檢測區(qū)T線處用0. 5mg/mlRCT-BSA偶聯(lián)物(即萊克多巴胺抗原)包被液，使用量為90uV27Cm。在包被膜的質控區(qū)C線處使用濃度為lmg/ml的抗兔IgG進行包被，使用量同為90ul/27cm。用于結合熒光標記的兔IgG，用于檢測試紙條的有效性。在該實施例中，熒光標記液受3IOnm激發(fā)，發(fā)射波長為340nm。在該實施例中，熒光標記液的制備采用含羧基的熒光膠乳標記物(本實施例用到的熒光素為7-羥基香豆素膠乳)的制備方法(A)，步驟如下將500mg的7_羥基香豆素膠乳分別與50mgRCT抗體或50mg兔IgG混合后，邊攪拌邊緩慢加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)_碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS)，使其整個反應體系中EDC的含量為0. aiig，NHS含量為0. lmg，在低溫下2 8°C避光反應過夜。用透析或其他方法去除雜質；用熒光保護劑復溶。將上述制備好的熒光膠乳微粒標記的RCT抗體和熒光膠乳微粒標記兔IgG按適當比例混合，以使兩種抗體濃度分別都為2ug/ml，分裝備用。實施例二在該實施例中，熒光定量檢測萊克多巴胺免疫層析試劑盒，包括試紙條和熒光標記液。其中，試紙條由樣品墊、包括檢測區(qū)(T區(qū))和質控區(qū)(C區(qū))的纖維素包被膜、吸水紙按試紙條的常規(guī)方法依次相互搭接地粘貼在底板上。在該實施例中，包被膜的檢測區(qū)T線處用lmg/ml RCT-BSA偶聯(lián)物(即萊克多巴胺抗原)包被液，使用量為90ul/35cm。在包被膜的質控區(qū)C線處使用濃度為lmg/ml的抗兔 IgG進行包被，使用量同為90ul/35cm，用于結合熒光標記的兔IgG，用于檢測試紙條的有效性。在該實施例中，熒光標記液受550nm激發(fā)后，發(fā)射波長為620nm。在該實施例中，熒光標記液的制備采用含氨基的熒光膠乳標記物(本實施例用到的熒光素為四甲基異硫氰酸羅丹明膠乳)的制備方法，步驟如下將500mg熒光膠乳標記物分別與65mgRCT抗體或65mg兔IgG混合后，置于4 40°C環(huán)境，調節(jié)體系pH7. 0 8. 5，一邊攪拌一邊緩慢加入0. 4 0. 6%戊二醛；反應2 5 小時，透析或其他方法去除雜質，用熒光保護劑復溶。將上述制備好的熒光膠乳微粒標記的RCT抗體和熒光膠乳微粒標記兔IgG按適當比例混合，以致兩種抗體濃度分別都為5ug/ml，分裝備用。實施例三在該實施例中，熒光定量檢測萊克多巴胺免疫層析試劑盒，包括試紙條和熒光標記液。其中，試紙條由樣品墊、包括檢測區(qū)(T區(qū))和質控區(qū)(C區(qū))的纖維素包被膜、吸水紙按試紙條的常規(guī)方法依次相互搭接地粘貼在底板上。在該實施例中，包被膜的檢測區(qū)T線處用1.5mg/ml RCT-BSA偶聯(lián)物(即萊克多巴胺抗原)包被液，使用量為90ul/35cm。在包被膜的質控區(qū)C線處使用濃度為2mg/ml的抗兔IgG進行包被，使用量同為90ul/35cm，用于結合熒光標記的兔IgG，用于檢測試紙條的有效性。在該實施例中，熒光標記液受490nm激發(fā)，發(fā)射波長為530nm。在該實施例中，熒光標記液的制備采用含硫碳酰氨基的熒光素(本實施例用到的熒光素為異硫氰酸熒光素)的制備方法，步驟如下 用pH8. 0 pH9. 6碳酸緩沖液分別溶解45mgRCT抗體或45mg兔IgG，用pH8. 0 PH9. 6碳酸緩沖液溶解或懸浮20mg異硫氰酸熒光素；邊攪拌邊將上述的異硫氰酸熒光素漸漸加入球蛋白溶液中，加完后，繼續(xù)避光攪拌ι池左右，結合完畢后，裝入透析袋中，用上述碳酸緩沖鹽水在低溫下透析過夜，用熒光保護劑復溶。 將上述制備好的熒光物標記的RCT抗體和熒光膠乳微粒標記兔IgG按適當比例混合，以致兩種抗體濃度分別都為:3ug/ml，分裝備用。本發(fā)明所述的萊克多巴胺免疫層析檢測試劑盒，在具體實例中，半成品通過以下工序組裝而成由樣品墊、包被膜、吸水紙順次搭接粘貼在底板上，構成試紙條，可再用現有技術中的卡外殼7 (如圖3所示)，固定成檢測卡，所述卡外殼涂有可供熒光儀掃描識別的產品信息噴碼。與寫入信息的ID芯片(現有技術中的ID芯片采用的定量計算公式為檢測信號值與計算濃度的半對數直線方程式或其他計算方程式，可自動進行結果判定)。分裝好的熒光標記液和其他配件組裝成試劑盒。本發(fā)明所述熒光定量檢測萊克多巴胺的免疫層析試劑盒，在使用時，組裝在由塑料上殼和塑料下殼扣合而成的塑料卡外殼(檢測卡)中，塑料上殼設有兩個開孔，加樣孔9 和顯示窗8，加樣孔9對應于所述的熒光定量檢測萊克多巴胺的免疫層析試紙條樣品墊，結果顯示窗8對應于所述熒光定量檢測萊克多巴胺的免疫層析試紙條的檢測區(qū)和質控區(qū)，該熒光定量檢測萊克多巴胺的免疫層析試紙條可以從該塑料外殼中取出。用來測試免疫層析試紙條的熒光定量光譜檢測系統(tǒng)(免疫熒光檢測儀)，主要包含熒光光源系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)及自動軟件分析控制系統(tǒng)。本發(fā)明的一個實施例中，檢測樣本需要通過以下操作吸取50 150ul的樣本 (尿樣/提取液)與熒光標記液等量混合，混勻后吸取50 150ul，往水平放置檢測卡加樣孔加入，不要帶入氣泡，開始層析反應。反應15分鐘，由熒光檢測儀讀取測試結果。本發(fā)明的實施例1-3所述的定量萊克多巴胺免疫層析檢測試劑盒與免疫熒光檢測儀對200例樣本(尿樣/提取液)的測定結果比較表明在0. 2ppb 5ppb范圍內測定萊克多巴胺的準確性高定量曲線線性系數均大于0. 99，樣本中含Ippb與2ppb濃度的萊克多巴胺其準確度為80% 120%，試劑盒檢出限為0.2ppb。相對一般采用的膠體金法(定
性)和酶聯(lián)免疫檢測法檢測試劑盒的檢測結果具有更好的靈敏度和特異性。具體如下表。
權利要求
1.一種熒光定量檢測萊克多巴胺的免疫層析試劑盒，其特征是，該試劑盒包括有試紙條和熒光標記液，所述試紙條由樣品墊、硝酸纖維素包被膜、吸水紙順次搭接粘貼在底板上構成；所述硝酸纖維素包被膜包括檢測區(qū)和質控區(qū)；所述檢測區(qū)包被有RCT-BSA偶聯(lián)物，所述質控區(qū)包被抗兔IgG ；所述熒光標記液中含有熒光標記RCT抗體和熒光標記兔IgG。
2.根據權利要求1所述的熒光定量檢測萊克多巴胺的免疫層析試劑盒，其特征是，所述硝酸纖維素包被膜質控區(qū)，抗兔IgG的包被液濃度為0. 2 ％ig/ml，用量為 90 μ l/27-35cm0
3.根據權利要求1所述的熒光定量檢測萊克多巴胺的免疫層析試劑盒，其特征是， 所述硝酸纖維素包被膜檢測區(qū)，RCT-BSA偶聯(lián)物的包被液濃度為0. 2 ％ig/ml，用量為 90 μ l/27-35cm0
4.根據權利要求1-3任一項所述的熒光定量檢測萊克多巴胺的免疫層析試劑盒，其特征是，所述硝酸纖維素包被膜質控區(qū)，抗兔IgG的包被液濃度為0. 5 1. 5mg/ml，用量為 90 μ l/27-35cm ；RCT-BSA偶聯(lián)物的包被液濃度為1 ang/ml，用量為90 μ l/27_35cm。
5.根據權利要求1-3任一項所述的熒光定量檢測萊克多巴胺的免疫層析試劑盒，其特征是，所述熒光標記液中的熒光標記RCT抗體的濃度為2 5ug/ml，熒光標記兔IgG的濃度為 2 5ug/ml。
6.根據權利要求5所述的熒光定量檢測萊克多巴胺的免疫層析試劑盒，其特征是，所述熒光標記液的激發(fā)波長為310 550nm，發(fā)射波長為340 620nm。
7.一種熒光標記液的制備方法，其特征是，其步驟如下A.含羧基的熒光素或熒光膠乳標記液的制備方法將18-22mg的熒光素或480-520mg熒光膠乳標記物與50mgRCT抗體或兔IgG混合后， 邊攪拌邊緩慢加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，使其整個反應體系中1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺含量為0. 1-0. :3mg，N-羥基琥珀酰亞胺的含量為0. 1-0. ang，在2 8°C避光反應過夜；去除雜質，用熒光保護劑復溶； 或B.含氨基的熒光素或熒光膠乳標記液的制備方法將18-22mg的熒光素或480-520mg熒光膠乳標記物與65mgRCT抗體或兔IgG混合后， 置于4 40°C，調節(jié)體系pH6. 8 9. 0，一邊攪拌一邊緩慢加入0. 2 1 %戊二醛；反應2 5小時，去除雜質，用熒光保護劑復溶；或C.含硫碳酰胺鍵的熒光素或熒光膠乳標記液的制備方法用pH8. 0 pH9. 6碳酸緩沖液分別溶解45mg RCT抗體或兔IgG，用pH8. 0 pH9. 6碳酸緩沖液溶解或懸浮18-2aiig熒光素或480-520mg熒光膠乳；邊攪拌邊將上述溶解的熒光素或熒光膠乳漸漸加入球蛋白溶液中，加完后，繼續(xù)避光攪拌10-14小時，結合完畢后，裝入透析袋中，用上述碳酸緩沖鹽水透析過夜，用熒光保護劑復溶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種熒光定量檢測萊克多巴胺的免疫層析試劑盒以及熒光標記液的制備方法，該試劑盒包括有試紙條和熒光標記液，所述試紙條由樣品墊、硝酸纖維素包被膜、吸水紙順次搭接粘貼在底板上構成；所述硝酸纖維素包被膜包括檢測區(qū)和質控區(qū)；所述檢測區(qū)包被有RCT-BSA偶聯(lián)物，所述質控區(qū)包被抗兔IgG；所述熒光標記液中含有熒光標記RCT抗體和熒光標記兔IgG。與免疫膠體金標記試紙條相比，本發(fā)明具有靈敏度更高、準確定量等優(yōu)點，而操作比酶聯(lián)法更加快速和簡便。
文檔編號G01N21/64GK102323406SQ20111032237
公開日2012年1月18日 申請日期2011年10月21日 優(yōu)先權日2011年10月21日
發(fā)明者劉曉云, 唐海波, 王繼華 申請人:廣州萬孚生物技術有限公司