專利名稱：有機(jī)磷農(nóng)藥生物標(biāo)志物的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種有機(jī)磷農(nóng)藥生物標(biāo)志物的電化學(xué)檢測(cè)方法。利用肟類復(fù)活劑對(duì)抑制后乙酰膽堿酯酶(AChE)的復(fù)活作用，通過(guò)酶活性的變化測(cè)定有機(jī)磷農(nóng)藥生物標(biāo)志物的含量，用于評(píng)估生物體內(nèi)有機(jī)磷農(nóng)藥暴露的情況。
背景技術(shù)：
大多數(shù)有機(jī)磷農(nóng)藥(organophosphorous pesticides, OPs)顯示出低的環(huán)境持久性，但長(zhǎng)時(shí)間、大面積使用或接觸這類農(nóng)藥已經(jīng)給生態(tài)環(huán)境和人類健康帶來(lái)了巨大威脅，對(duì)其所產(chǎn)生的生物效應(yīng)和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)價(jià)已成為分析化學(xué)和農(nóng)藥化學(xué)領(lǐng)域最重要的研究?jī)?nèi)容之一。OPs的毒作用機(jī)制是它能與機(jī)體內(nèi)的膽堿酯酶(cholinesterase，ChE)的活性位點(diǎn)的絲氨酸羥基共價(jià)結(jié)合，形成磷?；憠A酯酶復(fù)合物(OP-ChE)，導(dǎo)致酶的活性降低而不能催化水解作為神經(jīng)遞質(zhì)的乙酰膽堿，使神經(jīng)傳導(dǎo)受阻。目前的檢測(cè)方法都是通過(guò)測(cè)定酶活性的降低并于標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行比較，來(lái)判斷有機(jī)磷農(nóng)藥的中毒狀況。但是，由于個(gè)體間膽堿酯酶的含量差異，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)值的波動(dòng)很大，從而對(duì)于低劑量有機(jī)磷農(nóng)藥暴露無(wú)法準(zhǔn)確定量。 OP-ChE作為有機(jī)磷農(nóng)藥生物標(biāo)志物，為早期監(jiān)測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的接觸水平和預(yù)測(cè)可能的毒性作用提供了新途徑。因此，發(fā)展快速、靈敏、高效、安全的OP-ChE的檢測(cè)方法對(duì)監(jiān)測(cè)機(jī)磷農(nóng)藥暴露十分必要。肟類化合物，如解磷定(Pralidoxime，PAM-C1/I)、雙復(fù)磷(Obidoxime,DM04)、雙解磷(Trimedoxime，TMB4)，HI-6等，是一類膽堿酯酶復(fù)活劑，它們能使乙磷酰化膽堿酯酶加合物(OP-AChE)中被抑制的酶脫離出來(lái)，完全恢復(fù)酶的活性，即復(fù)活過(guò)程。因此，復(fù)活后的乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)含量可作為個(gè)體的標(biāo)準(zhǔn)值，避免了個(gè)體之間正常AChE的水平差異。基于此思想，申請(qǐng)人提出了一種新的有機(jī)磷農(nóng)藥生物標(biāo)志物的檢測(cè)方法，分別測(cè)量復(fù)活前、后AChE的活性，根據(jù)兩者之間的活性差異，得到對(duì)應(yīng)乙磷酰化膽堿酯酶加合物(OP-AChE)含量，從而判斷農(nóng)藥的接觸水平。該方法無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)AChE含量作為基線，克服了個(gè)體差異的影響，為監(jiān)測(cè)低劑量有機(jī)磷農(nóng)藥暴露提供了新途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出了一種新的有機(jī)磷農(nóng)藥生物標(biāo)志物的檢測(cè)方法。該方法分別測(cè)量復(fù)活前、后乙酰膽堿酯酶(AChE)的活性，根據(jù)兩者之間的活性差異，得到對(duì)應(yīng)乙磷酰化膽堿酯酶加合物(OP-AChE)含量，從而判斷農(nóng)藥的接觸水平。該方法以復(fù)活后AChE含量作為個(gè)體自身的基準(zhǔn)，消除了個(gè)體間正常水平AChE的變異性。本發(fā)明的技術(shù)方案有機(jī)磷農(nóng)藥的電化學(xué)檢測(cè)方法第一步四氧化三鐵與金納米(Fe304/AuNPs)磁性納米粒子制備1)將0. Olwt %的四氯化金IOOmL溶液在攪拌的條件下加熱煮沸，隨后一次性加入 1. 0襯％檸檬酸三鈉溶液2. 5mL，待溶液顏色變成酒紅色金膠溶液后，使金膠溶液繼續(xù)攪拌lOmin，再停止加熱使其冷卻至室溫，保存于4°C冰箱中備用；2)取IOmg羧基化磁性納米粒子(Fe3O4-COOH)加入到IOmL含O. 20wt%聚二甲基二烯丙基氯化銨(Poly(diallyldimethylammonium chloride, PDDA)的 2OmM Tris/NaCl 溶液中，超聲振蕩30min，用磁鐵進(jìn)行磁分離、蒸餾水洗滌，棄去多余的PDDA，得到潔凈的 PDDA-Fe3O4磁性納米粒子；再把PDDA-Fe3O4和50mL步驟1)制備的金膠溶液進(jìn)行混合攪拌 30min，帶負(fù)電的金納米粒子自組裝到帶正電的PDDA-Fe3O4納米粒子表面，磁鐵磁分離，蒸餾水洗滌，配成lmg/mL核殼式Fe304/AuNPs磁性納米粒子。第二步磷酰化乙酰膽堿酯酶加合物OP-AChE的制備對(duì)氧磷(paraoxon，OP)作為有機(jī)磷農(nóng)藥的模型分子，制備乙酰膽堿酯酶加合物 (OP-AChE)。將對(duì)氧磷溶解在乙醇溶液中，用pH 7.0磷酸緩沖溶液(PBS)稀釋成不同濃度的溶液；取1. OmL含有3nM AChE的PBS溶液與一系列不同濃度的對(duì)氧磷(對(duì)氧磷的最終濃度分別為0. Ing/mL, 0. 2ng/mL, 0. 5ng/mL, Ing/mL, 2ng/mL, 5ng/mL, lOng/mL, 15ng/mL)混合， 在37°C下溫浴反應(yīng)30min，得到不同抑制程度的乙酰膽堿酯酶(AChE)，即生成了不同濃度的 OP-AChE。第三步=OP-AChE的復(fù)活及吸附取制備好的不同濃度的1. OmLOP-AChE與等體積的5mM碘解磷定(Pralidoxime iodide, 2-PAM)混合反應(yīng)15min，讓抑制的AChE完全恢復(fù)活性，然后加入50 μ L氯化乙酰硫代膽堿(Acetylthiocholine chloride, ATC1)，ATCl 最終濃度為 3mM，溫浴反應(yīng) 5min，使其充分反應(yīng)，產(chǎn)生硫代膽堿(thiochline)，再加入制備好的250 μ L濃度為lmg/mLFe304/AuNPS 磁性納米粒子，震蕩搖勻30min，磁鐵磁分離，蒸餾水洗滌，形成待檢測(cè)的Fe304/AuNPS-硫代膽堿納米復(fù)合物；作為對(duì)照，未受對(duì)氧磷抑制的3nM乙酰膽堿酯酶(AChE)與同樣濃度的氯化乙酰硫代膽堿混合后加入同樣的Fe3O4AuNPs磁性納米粒子；第四步線性掃描法測(cè)定取20 μ L上述自組裝好的Fe304/AuNPs-硫代膽堿懸液滴于工作電極表面，印刷電極下放置一塊磁鐵，在外加磁場(chǎng)的作用下，F(xiàn)e304/AuNPS-硫代膽堿緊附于工作電極表面，再滴加50 μ L磷酸緩沖溶液(PBS)，用線性掃描法進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，在掃速為50mV/s，電位掃描范圍0. 2 1. 2V條件下電化學(xué)檢測(cè)；作為對(duì)照，未受對(duì)氧磷抑制的3nM乙酰膽堿酯酶與同樣濃度的氯代乙酰硫代膽堿混合后反應(yīng)，用上述同樣的方式進(jìn)行檢測(cè)，抑制率和復(fù)活率按如下公式計(jì)算1%= (io-it)/ioX100%I1V0= (ir-it)/irX100%R%= (ir-it)/(i0-it) X100%其中i。和it分別來(lái)自未經(jīng)過(guò)農(nóng)藥抑制和經(jīng)過(guò)農(nóng)藥抑制后的乙酰膽堿酯酶和氯代乙酰硫代膽堿溶液反應(yīng)的峰電流，i,為乙酰膽堿酯酶復(fù)活后測(cè)得的峰電流。本發(fā)明有益效果1、核殼式Fe3O4AuNPs磁性納米粒子。一方面，由于其磁性核的存在，可以通過(guò)磁分離進(jìn)行分離、純化。另一方面，AuNPs附著于Fe3O4表面有較大的比表面積，對(duì)硫代膽堿有更強(qiáng)的富集能力，并加速了電子的傳遞。2、被抑制的AChE被肟類完全復(fù)活，樣品復(fù)活后的ChE含量減去復(fù)活前活性ChE含量，即可得到OP-AChE的含量。3、以樣品自身復(fù)活后的AChE為基準(zhǔn)，無(wú)需基線對(duì)照，避免了個(gè)體間正常AChE水平的差異，使得檢測(cè)更加可靠和精準(zhǔn)。


圖1核殼式Fe304/AuNPs磁性納米粒子組裝和硫代膽堿檢測(cè)的原理示意2四氧化三鐵(Fe3O4)和Fe304/AuNPs磁性納米粒子的透射/掃描電鏡圖中圖a與圖c是Fe3O4和Fe304/AuNPs磁性納米粒子的透射電鏡圖，說(shuō)明諸多顆粒狀金納米AuNPs存在；圖b與圖d是Fe3O4和Fe304/AuNPs的掃描射電鏡圖，顯示了金納米(AuNPs)均勻的包裹在四氧化三鐵(Fe3O4)的表面。圖30P_AChE加合物的檢測(cè)原理有機(jī)磷農(nóng)藥和AChE結(jié)合形成加合物OP-AChE，抑制了酶的活性。使用碘解磷定 (Pralidoxime iodide, 2-PAM)后，被抑制的AChE的活性得以恢復(fù)。通過(guò)反應(yīng)途徑①，測(cè)定被有機(jī)磷抑制的AChE樣品經(jīng)2-PAM復(fù)活后酶的活性，得到AChE的總量；通過(guò)反應(yīng)途徑②， 測(cè)定被農(nóng)藥抑制后樣品中酶的活性。那么，被抑制的AChE的量，即形成加合物OP-AChE的含量，就等于總酶量減去活性酶量的差值。這種檢測(cè)機(jī)制是建立在復(fù)活劑對(duì)酶活恢復(fù)效率很高且可以把復(fù)活后的酶活作為基準(zhǔn)的基礎(chǔ)上的。表IOP-AChE 的檢測(cè)通過(guò)AChE酶活的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的受不同濃度對(duì)氧磷抑制和復(fù)活后的樣品中 AChE的濃度，從而計(jì)算得到OP-AChE加合物的含量。測(cè)得結(jié)果如表1。表 權(quán)利要求
1.有機(jī)磷農(nóng)藥生物標(biāo)志物的檢測(cè)方法，其特征是電化學(xué)檢測(cè)方法，測(cè)定分兩個(gè)步驟 第一步乙酰膽堿酯酶加合物的復(fù)活及吸附分別取1. OmL濃度為0. lng/mL,0. 2ng/mL、0. 5ng/mL、lng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL 和 15ng/mL 的對(duì)氧磷抑制的乙酰膽堿酯酶混合液，與等體積的5mM碘解磷定混合反應(yīng)15mi n，讓抑制的乙酰膽堿酯酶完全恢復(fù)活性， 然后加入50 μ L氯化乙酰硫代膽堿，氯化乙酰硫代膽堿的最終濃度為3mM，溫浴反應(yīng)5min， 使其充分反應(yīng)，產(chǎn)生硫代膽堿，再加入制備好的250 μ L濃度為lmg/mL Fe3O4AuNPs磁性納米粒子，震蕩搖勻30min，磁鐵磁分離，蒸餾水洗滌，形成待檢測(cè)的Fe304/AuNPS-硫代膽堿納米復(fù)合物；作為對(duì)照，未受對(duì)氧磷抑制的3nM乙酰膽堿酯酶與同樣濃度的氯化乙酰硫代膽堿混合后加入同樣的Fe304/AuNPs磁性納米粒子；第二步線性掃描法測(cè)定取20 μ L上述自組裝好的Fe304/AuNPS-硫代膽堿懸液滴于工作電極表面，印刷電極下放置一塊磁鐵，在外加磁場(chǎng)的作用下，F(xiàn)e304/AuNPS-硫代膽堿緊附于工作電極表面，再滴加50 μ L磷酸緩沖溶液，用線性掃描法進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，在掃速為 50mV/s,電位掃描范圍0. 2 1. 2V條件下電化學(xué)進(jìn)行檢測(cè)；作為對(duì)照，未受對(duì)氧磷抑制的 3nM乙酰膽堿酯酶與同樣濃度的氯代乙酰硫代膽堿混合后反應(yīng)，用上述同樣的方式進(jìn)行檢測(cè)，抑制率和復(fù)活率按如下公式計(jì)算 1%= (io-it)/ioX100% I1V0= (ir-it)/irX100% R%= (ir-it)/(i0-it) X100%其中i。和it分別來(lái)自未經(jīng)過(guò)農(nóng)藥抑制和經(jīng)過(guò)農(nóng)藥抑制后的乙酰膽堿酯酶和氯代乙酰硫代膽堿溶液反應(yīng)的峰電流，k為乙酰膽堿酯酶復(fù)活后測(cè)得的峰電流。
2.權(quán)利要求1中所用Fe304/AuNPS磁性納米粒子制備方法，其特征在于，制備步驟如下1)將0.Olwt %的四氯化金IOOmL溶液在攪拌的條件下加熱煮沸，隨后一次性加入 1. Owt %檸檬酸三鈉溶液2. 5mL，待溶液顏色變成酒紅色金膠溶液后，使金膠溶液繼續(xù)攪拌 lOmin，再停止加熱使其冷卻至室溫，保存于4°C冰箱中備用；2)取IOmg羧基化磁性納米粒子加入到IOmL含0.20wt %聚二甲基二烯丙基氯化銨溶液的20mM Tris/NaCl溶液中，超聲振蕩30min，磁鐵磁分離、蒸餾水洗滌，棄去多余的PDDA， 得到潔凈的PDDA-Fe3O4磁性納米粒子；再把PDDA-Fe3O4和50mL步驟1)制備的金膠溶液進(jìn)行混合攪拌30min，帶負(fù)電的金納米粒子自組裝到帶正電的PDDA-Fe3O4納米粒子表面，磁鐵磁分離，蒸餾水洗滌重懸浮，配成lmg/mLFe304/AuNPS核殼式磁性納米粒子。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了有機(jī)磷農(nóng)藥生物標(biāo)志物的檢測(cè)方法。該方法利用肟類復(fù)活劑對(duì)抑制后乙酰膽堿酯酶(AChE)的復(fù)活作用，用線性掃描法分別測(cè)量復(fù)活前、后AChE的活性，根據(jù)兩者之間的活性差異，得到對(duì)應(yīng)乙酰膽堿酯酶加合物OP-AChE含量，從而判斷農(nóng)藥的接觸水平。該方法以復(fù)活后AChE含量作為個(gè)體自身的基準(zhǔn)，消除了個(gè)體間正常水平AChE的變異性。
文檔編號(hào)G01N27/48GK102507714SQ20111034957
公開(kāi)日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月7日
發(fā)明者張愛(ài)東, 杜丹, 陶媛 申請(qǐng)人:華中師范大學(xué)