專利名稱：有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留的免疫檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種農(nóng)藥檢測技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體涉及一種有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留的免疫檢測方法。
背景技術(shù)：
有機(jī)磷殺蟲劑以其殺蟲譜廣、殘效期較短、價(jià)格低廉而被廣泛應(yīng)用，農(nóng)藥使用不當(dāng)，使得有機(jī)磷農(nóng)藥殘留成為我國食品中農(nóng)藥殘留的重要問題。目前，對(duì)該類農(nóng)藥的檢測方法主要有氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、毛細(xì)管電泳法(CE)等，這些檢測技術(shù)相對(duì)成熟，靈敏度高，但是需要昂貴的儀器、測試時(shí)間長且需要專業(yè)的技術(shù)人員，不適合大規(guī)模、快速化的檢測。近年來，各國都在研究快速的有機(jī)磷多殘留檢測方法，目前應(yīng)用最廣的是酶聯(lián)免疫分析方法，利用抗原與抗體反應(yīng)的特異性，酶催化的高效與方法作用，使得其成為一種新型快速檢測方法。磁性納米粒子是近年來發(fā)展起來的一種新型材料，由于其具有超順磁性、大比表面積以及良好的生物相容性等特性而被廣泛地應(yīng)用在生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，目前研究和應(yīng)用最多的是狗304等鐵的氧化物。免疫磁珠合成技術(shù)，是指利用共沉淀法制備!^e3O4并以此作為核，通過在核的表面修飾不同的功能化基團(tuán)如-OH、-COOH、-NH2等，使其與某些生物活性物質(zhì)結(jié)合(如抗原、抗體、酶等)形成新的復(fù)合物。合成的免疫磁珠不但具有磁性，容易在外磁場的作用下分離，而且具有生物活性，可廣泛應(yīng)用于細(xì)胞分離和提純、免疫檢測、核酸分析和基因工程、作為靶向釋藥的載體等領(lǐng)域。基于磁性納米粒子的試紙條檢測技術(shù)指將免疫磁珠應(yīng)用到傳統(tǒng)的試紙條檢測中， 以纖維素膜為載體，將有機(jī)磷通用抗原包被在膜上，封閉后分別滴加樣品和免疫磁珠，最后通過膜上的顏色來判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)現(xiàn)定性和半定量檢測目的。經(jīng)檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，中國專利《快速檢測有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的魚酯酶試劑(公開號(hào) CN1396267))),《殘留有機(jī)磷農(nóng)藥快速測試盒及制造方法(公開號(hào)CN1293363)》、《一種能檢測各種農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留的速測卡(公開號(hào)CN101140236)》、《一種檢測有機(jī)磷農(nóng)藥殘留試紙的制備及其使用方法(公開號(hào)CN101299029)》，其原理均基于有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)動(dòng)植物體內(nèi)的某些酶有抑制作用，通過酶的底物的水解程度(顯色程度)來判斷有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留程度，這些方法的不足之處在于1、容易出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，檢測特異性不強(qiáng)；2、提取生物酶的過程相對(duì)繁瑣，且生物酶易受溫度等因素的影響。專利文獻(xiàn)《一種檢測有機(jī)磷農(nóng)藥的免疫膠體金測試條及其制備方法(公開號(hào)CN101042405)》中披露的技術(shù)方案提高了檢測特異性，但是試紙條制備步驟仍然很復(fù)雜，且只能定性的通過顏色深淺來判斷結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)目前傳統(tǒng)有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留檢測中存在的不足，提供一種有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留的免疫檢測方法。本檢測方法操作簡便、靈敏、快速、不需要大型儀器，適合現(xiàn)場抽樣檢測以及大批量的檢測任務(wù)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)，本發(fā)明的有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留的免疫檢測方法包括如下步驟
步驟一，設(shè)計(jì)及合成有機(jī)磷通用半抗原，并與蛋白偶聯(lián)制備免疫原與包被原； 步驟二，用上述制備的免疫原進(jìn)行動(dòng)物免疫，得到有機(jī)磷農(nóng)藥通用抗體； 步驟三，通過化學(xué)方法合成!^e3O4磁性納米粒子，并進(jìn)行表面修飾； 步驟四，將表面修飾后的狗304磁性納米粒子與有機(jī)磷農(nóng)藥通用抗體偶聯(lián)，并與膠體金結(jié)合，得到免疫磁珠；
步驟五，在試紙條的底板上加上硝酸纖維素膜，將有機(jī)磷通用半抗原與蛋白偶聯(lián)制備免疫原包被在膜上，封閉后成為檢測部分，確定最佳包被、封閉條件以及金標(biāo)免疫磁珠的用量；
步驟六，利用免疫磁珠以及第五步中裝配的檢測試紙條對(duì)樣品進(jìn)行檢測，獲得定性結(jié)果和定量結(jié)果。優(yōu)選地，步驟一中，所述有機(jī)磷通用半抗原分別與牛血清白蛋白和雞卵清白蛋白偶聯(lián)，得到免疫原與包被原。優(yōu)選地，步驟二中，所述動(dòng)物為小白鼠或新西蘭大白兔。優(yōu)選地，步驟三中，所述化學(xué)方法為共沉淀法，所述表面修飾為用3-氨丙基三乙氧基硅烷對(duì)!^e3O4磁性納米粒子進(jìn)行表面氨基硅烷化修飾。優(yōu)選地，步驟四中，所述形成免疫磁珠具體為將表面修飾后的!^e3O4磁性納米粒子分散在乙醇溶液中，用戊二醛法將其與制備得到的有機(jī)磷農(nóng)藥通用抗體偶聯(lián)，磁分離，用 PBS和超純水分別洗滌3次，得到免疫磁珠。本發(fā)明的方法利用磁性納米粒子的大比表面積以及易磁性分離的特點(diǎn)，對(duì)磁性納米粒子表面進(jìn)行氨基硅烷化修飾，通過戊二醛偶聯(lián)有機(jī)磷農(nóng)藥通用抗體，在外磁場作用下， 分離得到免疫磁珠；采用直接競爭免疫分析方法，在試紙條的檢測部分包被有機(jī)磷農(nóng)藥通用抗原，隨后分別加入樣品和免疫磁珠，利用顏色判斷樣品中有機(jī)磷農(nóng)藥的存在。本發(fā)明與傳統(tǒng)的膠體金試紙條檢測技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)1、磁性納米粒子的制備成本低廉；2、試紙條的制作更為簡單，省略了樣品墊、吸水墊和金標(biāo)墊，成本更低，裝配更加簡單；3、磁性納米粒子其大比表面積可以吸附更多的抗體，達(dá)到一個(gè)信號(hào)放大的作用， 檢測靈敏度提高；4、制得的免疫磁珠在外磁場的作用下容易分離，純化；5、本檢測方法操作簡便、靈敏、快速、不需要大型儀器，適合現(xiàn)場抽樣檢測以及大批量的檢測任務(wù)。


圖1為有機(jī)磷農(nóng)藥通用免疫原及包被原的合成的路線圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件， 例如 Sambrook 等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York: Co Id Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1
一、有機(jī)磷農(nóng)藥通用免疫原及包被原的合成在G 二乙基硫代磷酰氯分子結(jié)構(gòu)上引入氨基酸后，即可得到含有羧基團(tuán)的通用半抗原DENP，利用羧基與蛋白質(zhì)中氨基的結(jié)合反應(yīng)，將通用半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到免疫原及包被原，合成路線如圖1所示。具體步驟如下取52mg DENP (0. 2mmol)溶于3mL無水DMF，加入46mg NHS (0. 4mmol),78mg EDC(0. 4mmol)。室溫(10°C )攪拌反應(yīng)過夜。取13!3mg牛血清白蛋白(BSA) 溶于15mL硼酸鹽緩沖液(0. 2mol/L, pH8. 7)，然后將活化半抗原溶液加入BSA溶液中，使半抗原與BSA的摩爾比約為100:1。室溫(10°C)反應(yīng)池后，于4°C反應(yīng)過夜。用蒸餾水透析 3天，每天換水3次，然后將人工抗原分裝保存于-20°C，此即免疫原DENP-BSA。將DENP偶聯(lián)雞卵清白蛋白(OVA)得包被原，方法同上。二、有機(jī)磷農(nóng)藥通用抗體的制備
初次免疫時(shí)，將免疫原與弗氏完全佐劑混合，在新西蘭大白兔背部進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射， 兩周后換用弗氏不完全佐劑進(jìn)行免疫，之后每隔兩周進(jìn)行基礎(chǔ)免疫1次，并在基礎(chǔ)免疫7天后采血，用ELISA法測抗血清的效價(jià)。待血清抗體達(dá)到一定效價(jià)后進(jìn)行最后一次加強(qiáng)免疫， 并在7天后，采用心臟采血，分離提純血清，-20°C保存?zhèn)溆?。三、Fe3O4磁性納米粒子的制備及表面氨基化
采用共沉淀法制備Fe3O4磁性納米粒子，分別取5. 2g FeCl3 · 6H20、2. 7969 g FeSO4 · 7H20,0. 85 mL 12.1 mol/L的濃鹽酸溶解于200 mL水中，超聲脫氧，后將以上溶液滴入250 mL、0. 75 mol/L NaOH溶液。所有反應(yīng)在80°C、攪拌、隔絕空氣條件下進(jìn)行。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)液中出現(xiàn)黑色的沉淀。反應(yīng)結(jié)束后，利用磁分離器將所得沉淀從反應(yīng)介質(zhì)中分離出來，先后用去離子水清洗3次，無水乙醇清洗2次，并配成5 g/mL的!^e3O4磁性納米粒子無水乙醇溶液。取25mL Fe3O4磁性納米粒子無水乙醇溶液，加入ImL水，再用無水乙醇稀釋到 150mL，超聲振蕩30 min。滴加0. 4mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，室溫下攪拌7 h。 反應(yīng)完畢，用磁分離器將APTES修飾的!^e3O4磁性納米粒子從反應(yīng)介質(zhì)中分離，并用無水乙醇溶液清洗3次，最后配成10. 5 mg/mL的氨基化!^e3O4納米磁珠無水乙醇溶液。四、免疫磁珠的制備
取0. 5mL氨基化!^e3O4磁性納米粒子的無水乙醇溶液，用ImL PBS清洗3次，磁分離器棄上清液。加入5% (體積分?jǐn)?shù))戊二醛溶液2 mL，室溫振蕩交聯(lián)2 h，磁分離，棄上清液。用 PBS洗滌3次并棄上清液后，分別采用0. 5mL不同稀釋度的抗體包被氨基化!^e3O4磁性納米粒子，室溫下振蕩固定池。磁分離，用PBS和超純水分別洗滌3次，得到具有最佳吸附量的免疫磁珠。取制備好的IOmL膠體金溶液于50mL燒杯中，用0. 2 mol/L的K2CO3溶液調(diào)節(jié)pH 至8.0。在磁力攪拌器上邊攪拌邊緩慢加入適量上述方法制備的免疫磁珠，攪拌30 min后加入10% BSA至終濃度1%，繼續(xù)攪拌30 min，轉(zhuǎn)移燒杯于4°C環(huán)境靜置2 h。然后4°C 1500 rpm離心20 min,棄沉淀，再10000 rpm離心60 min,棄上清，沉淀用PBS重懸至原體積，重復(fù)以上步驟2次，最后沉淀重懸于1/10體積的PBS里，4°C保存?zhèn)溆谩?br> 五、簡易磁珠試紙條的制備
第一步，包被原吸附于硝酸纖維素膜上條件摸索，確定最佳包被原稀釋度、包被溫度和包被時(shí)間。具體設(shè)計(jì)如下
在 37°C條件下用稀釋度為 1:1,1:10,1:20,1:50,1:100 的 DENP-0VA，按照 10 μ L/cm2 用量包被反應(yīng)lOmin，然后用蒸餾水洗凈，再用1%脫脂奶-PB溶液37°C封閉IOmin后洗凈晾干，與500 μ L稀釋后的免疫磁珠溶液37。C反應(yīng)20 min,比較幾個(gè)NC膜的顏色，確定最佳包被原稀釋度。采用最佳包被稀釋度，設(shè)置包被溫度為4°C、20°C和37°C，其他條件不變，比較NC 膜的顏色，確定最佳包被溫度。采用最佳包被稀釋度和最佳包被溫度，設(shè)置包被時(shí)間為1、5、10、15和20 min，其他條件不變，比較NC膜的顏色，確定最佳包被時(shí)間。第二步，硝酸纖維素膜的封閉條件摸索，確定最佳封閉液濃度，封閉時(shí)間和溫度。 具體設(shè)計(jì)如下
選用脫脂奶-PB緩沖液為封閉液，試驗(yàn)選取0、0. 1%、0. 5%、1%和21五個(gè)濃度的脫脂奶-PB緩沖液分別封閉已包被的NC膜，包被條件采用第一步中的結(jié)果，確定最佳封閉液濃度。采用最佳封閉液濃度，設(shè)置封閉溫度為4°C、20°C和37°C，其他條件不變，比較NC 膜的顏色，確定最佳封閉溫度。采用最佳封閉液濃度和最佳封閉溫度，設(shè)置封閉時(shí)間為1、5、10、15和20 min，其他條件不變，比較NC膜的顏色，確定最佳封閉時(shí)間。第三步，免疫磁珠與NC膜反應(yīng)條件摸索，確定免疫磁珠最佳稀釋度，反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間，具體設(shè)計(jì)如下
采用最佳包被條件和封閉條件，試驗(yàn)選取稀釋度為1:1，1:2，1:5，1:10和1:20的免疫磁珠溶液500 μ L與包被并封閉后的NC膜反應(yīng)，37°C下反應(yīng)20 min。比較NC膜的顏色，確定免疫磁珠的最佳稀釋度。采用免疫磁珠的最佳稀釋度，設(shè)置反應(yīng)溫度為4°C、20°C和37°C，其他條件不變， 比較NC膜的顏色，確定最佳反應(yīng)溫度。采用免疫磁珠的最佳稀釋度和最佳反應(yīng)溫度，設(shè)置反應(yīng)時(shí)間為1、5、10、15和20 min，其他條件不變，比較NC膜的顏色，確定最佳反應(yīng)時(shí)間。第四步，試紙條的組裝
試紙條依上述得出的最適條件制備取PVC底板，裁剪成IcmX5cm大小，一端揭開 IcmXlcm大小的粘面，粘貼包被有DENP-OVA并封閉后的NC膜，即為磁性納米粒子的有機(jī)磷農(nóng)藥簡易試紙條。六、比色卡的制作及樣品檢測
取5個(gè)裝有500 μ L免疫磁珠溶液的離心管，將濃度為0、20、50、100、200 μ g/mL毒死蜱(ΙΟΟμ L)分別加入離心管，同時(shí)插入組裝好的試紙條，反應(yīng)lOmin，根據(jù)不同濃度下試紙條的顯色程度差異，制作比色卡。用于樣品的半定量檢測。取裝有500 μ L免疫磁珠溶液的離心管，加入100 μ L待測樣品提取液，同時(shí)插入試紙條，反應(yīng)lOmin，觀察試紙條的顯色結(jié)果，不顯色為陽性樣品，否則為陰性樣品。對(duì)照比色卡，試紙條顏色越淺，樣品中有機(jī)磷農(nóng)藥含量越高。實(shí)施例2
一、有機(jī)磷農(nóng)藥通用免疫原及包被原的合成
在G 二乙基硫代磷酰氯分子結(jié)構(gòu)上引入氨基酸后，即可得到含有羧基團(tuán)的通用半抗原DENP，利用羧基與蛋白質(zhì)中氨基的結(jié)合反應(yīng)，將通用半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到免疫原及包被原，合成路線如圖1所示。具體步驟如下取DENP (0. 2mmol)溶于3mL無水DMF，加入46mg NHS (0. 4mmol),78mg EDC(0. 4mmol)。室溫(10°C )攪拌反應(yīng)過夜。取13!3mg牛血清白蛋白(BSA) 溶于15mL硼酸鹽緩沖液(0. 2mol/L, pH8. 7)，然后將活化半抗原溶液加入BSA溶液中，使半抗原與BSA的摩爾比約為100:1。室溫(10°C)反應(yīng)池后，于4°C反應(yīng)過夜。用蒸餾水透析 3天，每天換水3次，然后將人工抗原分裝保存于-20°C，此即免疫原DENP-BSA。將DENP偶聯(lián)雞卵清白蛋白(OVA)得包被原，方法同上。二、有機(jī)磷農(nóng)藥通用抗體的制備
初次免疫時(shí)，將免疫原與弗氏完全佐劑混合，對(duì)小白鼠進(jìn)行腹部皮下注射，兩周后換用弗氏不完全佐劑進(jìn)行免疫，之后每隔兩周進(jìn)行基礎(chǔ)免疫1次，并在基礎(chǔ)免疫7天后采血，用 ELISA法測抗血清的效價(jià)。待血清抗體達(dá)到一定效價(jià)后進(jìn)行最后一次加強(qiáng)免疫，通過手術(shù)取小鼠脾細(xì)胞并與骨髓瘤細(xì)胞雜交，篩選出能穩(wěn)定分泌有機(jī)磷農(nóng)藥通用單克隆抗體的細(xì)胞株，將其注入小鼠腹腔，取小鼠腹水制備單克隆抗體。三、狗304磁性納米粒子的制備及表面氨基化
采用共沉淀法制備1 磁性納米粒子，分別取5. 2 g FeCl3 · 6H20、2. 7969 g FeSO4 ·7Η20,0. 85mL 12. 1 mol/L的濃鹽酸溶解于200mL水中，超聲脫氧，后將以上溶液滴入 250 mL、0. 75 mol/L NaOH溶液。所有反應(yīng)在80 °C、攪拌、隔絕空氣條件下進(jìn)行。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)液中出現(xiàn)黑色的沉淀。反應(yīng)結(jié)束后，利用磁分離器將所得沉淀從反應(yīng)介質(zhì)中分離出來，先后用去離子水清洗3次，無水乙醇清洗2次，并配成5 g/mL的!^e3O4磁性納米粒子無水乙醇溶液。取25 mL !^e3O4磁性納米粒子無水乙醇溶液，加入ImL水，再用無水乙醇稀釋到150 mL，超聲振蕩30 min。滴加0. 4mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，室溫下攪拌7 h。反應(yīng)完畢，用磁分離器將APTES修飾的!^e3O4磁性納米粒子從反應(yīng)介質(zhì)中分離，并用無水乙醇溶液清洗3次，最后配成10. 5 mg/mL的氨基化!^e3O4納米磁珠無水乙醇溶液。四、免疫磁珠的制備
取0. 5mL氨基化!^e3O4磁性納米粒子的無水乙醇溶液，用ImL PBS清洗3次，磁分離器棄上清液。加入5% (體積分?jǐn)?shù))戊二醛溶液2mL，室溫振蕩交聯(lián)2 h，磁分離，棄上清液。用 PBS洗滌3次并棄上清液后，分別采用0. 5mL不同稀釋度的抗體包被氨基化!^e3O4磁性納米粒子，室溫下振蕩固定2 h。磁分離，用PBS和超純水分別洗滌3次，得到具有最佳吸附量的免疫磁珠。 取制備好的10 mL膠體金溶液于50 mL燒杯中，用0. 2 mol/L的K2CO3溶液調(diào)節(jié)pH 至8.0。在磁力攪拌器上邊攪拌邊緩慢加入適量上述方法制備的免疫磁珠，攪拌30 min后加入10% BSA至終濃度1%，繼續(xù)攪拌30 min，轉(zhuǎn)移燒杯于4°C環(huán)境靜置2 h。然后4°C 1500 rpm離心20 min,棄沉淀，再10000 rpm離心60 min,棄上清，沉淀用PBS重懸至原體積，重復(fù)以上步驟2次，最后沉淀重懸于1/10體積的PBS里，4°C保存?zhèn)溆谩Ｎ?、簡易磁珠試紙條的制備
第一步，包被原吸附于硝酸纖維素膜上條件摸索，確定最佳包被原稀釋度、包被溫度和包被時(shí)間。具體設(shè)計(jì)如下
在 37°C條件下用稀釋度為 1 1，1 10，1 20，1 50，1 100 的 DENP-OVA,按照 10 μ L/cm2 用量包被反應(yīng)lOmin，然后用蒸餾水洗凈，再用1%脫脂奶-PB溶液37°C封閉IOmin后洗凈晾干，與500 μ L稀釋后的免疫磁珠溶液37。C反應(yīng)20 min,比較幾個(gè)NC膜的顏色，確定最佳包被原稀釋度。采用最佳包被稀釋度，設(shè)置包被溫度為4°C、20°C和37°C，其他條件不變，比較NC 膜的顏色，確定最佳包被溫度。采用最佳包被稀釋度和最佳包被溫度，設(shè)置包被時(shí)間為1、5、10、15和20 min，其他條件不變，比較NC膜的顏色，確定最佳包被時(shí)間。第二步，硝酸纖維素膜的封閉條件摸索，確定最佳封閉液濃度，封閉時(shí)間和溫度。 具體設(shè)計(jì)如下
選用脫脂奶-PB緩沖液為封閉液，試驗(yàn)選取0、0. 1%、0. 5%、1%和21五個(gè)濃度的脫脂奶-PB緩沖液分別封閉已包被的NC膜，包被條件采用第一步中的結(jié)果，確定最佳封閉液濃度。采用最佳封閉液濃度，設(shè)置封閉溫度為4°C、20°C和37°C，其他條件不變，比較NC 膜的顏色，確定最佳封閉溫度。采用最佳封閉液濃度和最佳封閉溫度，設(shè)置封閉時(shí)間為1、5、10、15和20 min，其他條件不變，比較NC膜的顏色，確定最佳封閉時(shí)間。第三步，免疫磁珠與NC膜反應(yīng)條件摸索，確定免疫磁珠最佳稀釋度，反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間，具體設(shè)計(jì)如下
采用最佳包被條件和封閉條件，試驗(yàn)選取稀釋度為1:1，1:2，1:5，1:10和1:20的免疫磁珠溶液500 μ L與包被并封閉后的NC膜反應(yīng)，37°C下反應(yīng)20 min。比較NC膜的顏色，確定免疫磁珠最佳稀釋度。采用免疫磁珠最佳稀釋度，設(shè)置反應(yīng)溫度為4°C、20°C和37°C，其他條件不變，比較NC膜的顏色，確定最佳反應(yīng)溫度。采用免疫磁珠最佳稀釋度和最佳反應(yīng)溫度，設(shè)置反應(yīng)時(shí)間為1、5、10、15和20 min，其他條件不變，比較NC膜的顏色，確定最佳反應(yīng)時(shí)間。第四步，試紙條的組裝
試紙條依上述得出的最適條件制備取PVC底板，裁剪成IcmX5cm大小，一端揭開 IcmXlcm大小的粘面，粘貼包被有DENP-OVA并封閉后的NC膜，即為磁性納米粒子的有機(jī)磷農(nóng)藥簡易試紙條。六、比色卡的制作及樣品檢測
取5個(gè)裝有500 μ L免疫磁珠溶液的離心管，將濃度為0、20、50、100、200 μ g/mL毒死蜱(ΙΟΟμ L)分別加入離心管，同時(shí)插入組裝好的試紙條，反應(yīng)lOmin，根據(jù)不同濃度下試紙條的顯色程度差異，制作比色卡。用于樣品的半定量檢測。取裝有500 μ L免疫磁珠溶液的離心管，加入100 μ L待測樣品提取液，同時(shí)插入試紙條，反應(yīng)lOmin，觀察試紙條的顯色結(jié)果，不顯色為陽性樣品，否則為陰性樣品。對(duì)照比色卡，試紙條顏色越淺，樣品中有機(jī)磷農(nóng)藥含量越高。 綜上所述，本發(fā)明的方法利用磁性納米粒子的大比表面積以及易磁性分離的特點(diǎn)，對(duì)磁性納米粒子表面進(jìn)行氨基硅烷化修飾，通過戊二醛偶聯(lián)有機(jī)磷農(nóng)藥通用抗體，在外磁場作用下，分離得到免疫磁珠；采用直接競爭免疫分析方法，在試紙條的檢測部分包被有機(jī)磷農(nóng)藥通用抗原，隨后分別加入樣品和免疫磁珠，利用磁性納米粒子的顏色判斷樣品中有機(jī)磷農(nóng)藥的存在。本檢測方法操作簡便、靈敏、快速、不需要大型儀器，適合現(xiàn)場抽樣檢測以及大批量的檢測任務(wù)。
權(quán)利要求
1.一種有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留的免疫檢測方法，其特征在于，包括如下步驟 步驟一，設(shè)計(jì)及合成有機(jī)磷通用半抗原，并與蛋白偶聯(lián)制備免疫原與包被原； 步驟二，用上述制備的免疫原進(jìn)行動(dòng)物免疫，得到有機(jī)磷農(nóng)藥通用抗體；步驟三，通過化學(xué)方法合成!^e3O4磁性納米粒子，并進(jìn)行表面修飾；步驟四，將表面修飾后的狗304磁性納米粒子與有機(jī)磷農(nóng)藥通用抗體偶聯(lián)，形成免疫磁珠；步驟五，在試紙條的底板上加上硝酸纖維素膜，將有機(jī)磷通用半抗原與蛋白偶聯(lián)制備免疫原包被在膜上，封閉后成為檢測部分，確定最佳包被、封閉條件以及免疫磁珠的用量；步驟六，利用免疫磁珠以及第五步中裝配的檢測試紙條對(duì)樣品進(jìn)行檢測，獲得定性結(jié)果和定量結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留的免疫檢測方法，其特征在于，步驟一中， 所述有機(jī)磷通用半抗原分別與牛血清白蛋白和雞卵清白蛋白偶聯(lián)，得到免疫原與包被原。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留的免疫檢測方法，其特征在于，步驟二中， 所述動(dòng)物為小白鼠或新西蘭大白兔。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留的免疫檢測方法，其特征在于，步驟三中， 所述化學(xué)方法為共沉淀法，所述表面修飾為用3-氨丙基三乙氧基硅烷對(duì)!^e3O4磁性納米粒子進(jìn)行表面氨基硅烷化修飾。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留的免疫檢測方法，其特征在于，步驟四中， 所述形成免疫磁珠具體為將表面修飾后的I^e3O4磁性納米粒子分散在乙醇溶液中，用戊二醛法將其與制備得到的有機(jī)磷農(nóng)藥通用抗體偶聯(lián)，磁分離，用PBS和超純水分別洗滌3次， 加入膠體金后，得到免疫磁珠。
全文摘要
一種農(nóng)藥檢測技術(shù)領(lǐng)域的有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留的免疫檢測方法，包括如下步驟合成有機(jī)磷通用半抗原，并與蛋白偶聯(lián)制備免疫原與包被原；用免疫原進(jìn)行動(dòng)物免疫，得到有機(jī)磷農(nóng)藥通用抗體；合成Fe3O4磁性納米粒子，并進(jìn)行表面修飾；將表面修飾后的Fe3O4磁性納米粒子與有機(jī)磷農(nóng)藥通用抗體偶聯(lián)，形成免疫磁珠；在試紙條的底板上加上硝酸纖維素膜，將有機(jī)磷通用半抗原與蛋白偶聯(lián)制備免疫原包被在膜上，封閉后成為檢測部分，確定最佳包被、封閉條件以及免疫磁珠的用量；進(jìn)行定性和半定量檢測。本檢測方法操作簡便、靈敏、快速、不需要大型儀器，適合現(xiàn)場抽樣檢測以及大批量的檢測任務(wù)。
文檔編號(hào)H01F1/11GK102411051SQ20111021971
公開日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2011年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月2日
發(fā)明者姜官鑫, 朱鴻林, 沈國清, 胡寅 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)