專利名稱：一種血漿中利可君濃度的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種血漿中利可君濃度的檢測(cè)方法，特別涉及一種采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析利可君濃度的方法。
背景技術(shù)：
利可君為升白細(xì)胞藥，用于預(yù)防和治療各種原因引起的白細(xì)胞減少、再生障礙性貧血及血小板減少癥等，化學(xué)名為:2- ( α -苯基-α -乙氧羰基-甲基)噻唑烷-4-羧酸。對(duì)利可君的藥理活性研究已有許多，但是生物樣品中利可君的濃度測(cè)定及其藥代動(dòng)力學(xué)研究報(bào)道卻沒有。另外，利可君存在3個(gè)手性中心，有多個(gè)手性中心，因此，提供一種可靠的可檢測(cè)所有這些異構(gòu)體的方法就成為積極困難的事情。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏的測(cè)定血漿中利可君血藥濃度的方法。本發(fā)明提供了一種血漿中利可君濃度的檢測(cè)方法，包含以下步驟:
(a)對(duì)血漿樣品進(jìn)行前處理:取待測(cè)樣品，加入內(nèi)標(biāo)和高氯酸進(jìn)行蛋白沉淀，并取上清液，所述的內(nèi)標(biāo)為替硝唑，其用量為使樣品中含替硝唑濃度為100ng-lmg/ml，所述的高氯酸溶液的用量為每Iml樣品中加入高氯酸重量為10-100mg。

(b)采用液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)聯(lián)用儀測(cè)定上述上清液中利可君的濃度，其中，LC-MS聯(lián)用的色譜條件是:色譜柱是用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；內(nèi)標(biāo)法，以替硝唑作為內(nèi)標(biāo)；流動(dòng)相為乙腈-水-冰乙酸的混合液，其體積比例范圍為20±1:80±5:0.3±0.03) ；LC-MS聯(lián)用的質(zhì)譜條件是:離子源為ESI離子源，正離子檢測(cè)。所述步驟(a)中高氯酸可預(yù)先配置成水溶液，濃度為1_10%，優(yōu)選為3-7%，最優(yōu)選為4% ο所述步驟(a)中替硝唑可預(yù)先配置成水溶液，濃度為1.0-1.5 μ g/ml。 所述的分析血漿中利可君含量的方的檢測(cè)方法，色譜條件流動(dòng)相由乙腈-水-冰乙酸組成，其配比為乙腈-水-冰乙酸=20:80:0.3.
所述的的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟LC-MS聯(lián)用質(zhì)譜條件中，掃描方式為選擇性離子檢測(cè)。上述色譜條件為典型條件，實(shí)際應(yīng)用中根據(jù)所使用儀器的不同特點(diǎn)，可以對(duì)各參數(shù)做出適當(dāng)調(diào)整，以期獲得最佳的效果。本發(fā)明建立了簡(jiǎn)單、靈敏、快速的LC-MS法測(cè)定血漿中利可君的濃度，其高靈敏度、較小的樣品需求量以及相對(duì)較短的分析時(shí)間使得本發(fā)明方法適用于利可君的臨床前和臨床藥代代動(dòng)力學(xué)研究，利用該方法，可以很好的分離檢測(cè)利可君及其非對(duì)映異構(gòu)體。


圖1為利可君的結(jié)構(gòu)式。圖2A為利可君的質(zhì)譜全掃描圖。圖2B為替硝唑的質(zhì)譜全掃描圖。圖3A-3C為實(shí)施例一中利可君和替硝唑的總離子流色譜圖，I代表替硝唑的色譜峰，I1、II1、IV和V分別代表利可君的四種非對(duì)映異構(gòu)體；其中:圖3A代表空白血漿；圖3B代表空白血漿中加入利可君和內(nèi)標(biāo)替硝唑；圖3C代表血漿樣品。圖4A-4C為另一實(shí)施例中利可君和替硝唑的總離子流色譜圖，I代表替硝唑的色譜峰，I1、II1、IV和V分別代表利可君的四種非對(duì)映異構(gòu)體；其中:圖4A代表空白血漿；圖4B代表空白血漿中加入利可君和內(nèi)標(biāo)替硝唑；圖4C代表血漿樣品。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一
I儀器、材料與試劑
1.1儀器LC-MS聯(lián)用儀(島津LC-MS2020)
1.2樣品與試劑利可君(純度為> 99.5%);替硝唑(純度> 99.8%)，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；其他化學(xué)試劑均為分析純。2實(shí)驗(yàn)部分
2.1血漿樣品前處理取靜脈注射給藥后采集的大鼠血漿樣品IOOyL置于1.5mL塑料Ep管中，加入30 μ L內(nèi)標(biāo)溶液(1140ng/mL)，渦旋混合30s，再加入100 μ L4%高氯酸溶液，渦旋混合3min, 4°C條件下20000rpm離心IOmin兩次,取上清液10 μ L進(jìn)行LC-MS分析。2.2 LC-MS 分析條件
2.2.1 色譜條件色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (2.l*150mm,5-Micro);流動(dòng)相:乙腈:水:冰乙酸=20;80;0.3 ;柱溫:30°C ;流速:0-4min為0.3mL/min, 4-5min由0.3mL/min線性升至0.6mL/min,維持0.6mL/min至分析時(shí)間結(jié)束；進(jìn)樣量:
10μ L02.2.2質(zhì)譜條件ESI離子源，正離子檢測(cè)；掃描方式:選擇性離子檢測(cè)；定量分析的離子分別為:m/z 296.2 (利可君)和m/z 248.1 (替硝唑，內(nèi)標(biāo))。2.3 LC-MS 分析結(jié)果
對(duì)樣品利可君和內(nèi)標(biāo)替硝唑的質(zhì)譜掃描圖參見圖2A和圖2B。3方法確證
3.1專屬性本方法中待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的專屬性以標(biāo)準(zhǔn)曲線中一個(gè)濃度點(diǎn)與同法操作的空白血漿進(jìn)行對(duì)比來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)?？瞻籽獫{、空白血漿中加入利可君和內(nèi)標(biāo)替硝唑、血漿樣品的色譜圖分別見圖3A、3B和3C，從圖中可以看出，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾利可君和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定，內(nèi)標(biāo)替硝唑的保留時(shí)間為3.2min,利可君四個(gè)非對(duì)映異構(gòu)體的保留時(shí)間分別為9.5min、10.6min、
11.9min 和 13.2min。3.2線性與靈敏度利可君的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液 由乙腈配制。取空白血漿lOOyL，加入內(nèi)標(biāo)溶液30 μ L，再依次加入利可君標(biāo)準(zhǔn)系列工作液指定體積，配制成相當(dāng)于血漿濃度為50、100、200、400、1000、2000、5000 和 10000ng/mL 的血漿樣品，按 2.I 項(xiàng)下操作，進(jìn)行 LC-MS分析，求得直線回歸方程，即為工作曲線。其測(cè)定和分析結(jié)果見表I。表I利可君的標(biāo)準(zhǔn)曲線
權(quán)利要求
1.一種血漿中利可君濃度的檢測(cè)方法，其特征在于包含以下步驟: (a)對(duì)血漿樣品進(jìn)行前處理:取待測(cè)樣品，加入內(nèi)標(biāo)和高氯酸進(jìn)行蛋白沉淀，并取上清液，所述的內(nèi)標(biāo)為替硝唑，其用量為使樣品中含替硝唑濃度為100ng-lmg/ml，所述的高氯酸溶液的用量為每Iml樣品中加入高氯酸重量為10-100mg。
2.(b)采用LC-MS聯(lián)用儀測(cè)定上述上清液中利可君的濃度，其中，LC-MS聯(lián)用的色譜條件是:色譜柱是用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；內(nèi)標(biāo)法，以替硝唑作為內(nèi)標(biāo)；流動(dòng)相為乙腈-7K -冰乙酸的混合液，其比例范圍為20 ± 1:80 ± 5:0.3 ± 0.03 );LC-MS聯(lián)用的質(zhì)譜條件是:離子源為ESI離子源，正離子檢測(cè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(a)中高氯酸可預(yù)先配置成水溶液，濃度為1-10%，優(yōu)選為3-7%，最優(yōu)選為4%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(a)中替硝唑可預(yù)先配置成水溶液，濃度為l.0-l.Syg/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析血漿中利可君含量的方的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的色譜條件流動(dòng)相由乙腈-水-冰乙酸組成，其體積比為乙腈-水-冰乙酸=20:80:0.3。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的的檢測(cè)方法，其特征在于，LC-MS聯(lián)用質(zhì)譜條件中，掃描方式為選 擇性離子檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種血漿中利可君濃度的檢測(cè)方法。該方法將血漿中利可君與替硝唑經(jīng)高氯酸沉淀蛋白后采用LC-MS法進(jìn)行分離測(cè)定。本發(fā)明的方法經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證準(zhǔn)確可靠，可用于血漿中利可君的濃度測(cè)定。
文檔編號(hào)G01N30/88GK103226142SQ20111040501
公開日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2012年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月30日
發(fā)明者謝少斐, 韓亮, 范婧, 霍立茹, 楊曉兵, 余麗麗, 曾瀅 申請(qǐng)人:南京長(zhǎng)澳醫(yī)藥科技有限公司