專利名稱：篩選和/或分析目標(biāo)配體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分析方法，具體而言，本發(fā)明涉及一種篩選和/或分析目標(biāo)配體的方法。
背景技術(shù)：
高通量篩選(High throughput screening,HTS)技術(shù)是指以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)，以微板形式作為實(shí)驗(yàn)工具載體，以自動(dòng)化操作系統(tǒng)執(zhí)行試驗(yàn)過程，以靈敏快速的檢測儀器采集實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)，以計(jì)算機(jī)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，同一時(shí)間對(duì)數(shù)以千萬樣品檢測，并以相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫支持整體系運(yùn)轉(zhuǎn)的技術(shù)體系。常用的篩選模型都在分子水平和細(xì)胞水平，觀察的是藥物與分子靶點(diǎn)(也稱為靶蛋白)的結(jié)合作用，能夠直接認(rèn)識(shí)藥物的基本作用機(jī)制。目前這些模型主要集中在受體、酶、通道以及各種細(xì)胞反應(yīng)方面。近年也出現(xiàn)了基因水平的藥物篩選模型，使藥物篩選模型的范圍更為廣泛。舉例而言，以酶為作用靶的高通量篩選方法，絕大多數(shù)是使用放射性或者比色、熒光的方法來直接檢測酶活性，從而評(píng)價(jià)各種待測試的化合物分子對(duì)酶活性的影響(抑制或增強(qiáng))。多數(shù)情況下，篩選靶標(biāo)酶的小分子抑制劑是為發(fā)現(xiàn)藥物前體分子而廣泛采用的途徑。但是高通量篩選方法也具有以下缺點(diǎn):I)根據(jù)靶蛋白的功能發(fā)展一套特定的HTS方法，往往是費(fèi)時(shí)費(fèi)力的過程。通常需要對(duì)測定該蛋白的酶活性的常規(guī)生化方法進(jìn)行很多的改變和優(yōu)化才能達(dá)到建立HTS方法的要求。而且，一旦改換待研究的靶蛋白，就需要重新設(shè)計(jì)一套HTS方法。2) HTS篩選體系會(huì)產(chǎn)生一定的假陽性結(jié)果。例如蛋白質(zhì)的非特異性聚合、降解會(huì)導(dǎo)致其自身活性的改變，產(chǎn)生假陽性的篩選結(jié)果。有研究報(bào)道，常規(guī)HTS技術(shù)所得到的候選分子其中60-80%能夠被其他獨(dú)立的技術(shù)所確認(rèn)，剩余的20-40%的結(jié)果無法被重復(fù)；對(duì)于形式較復(fù)雜的HTS篩選體系，只有25%的結(jié)果可以被其他技術(shù)所重現(xiàn)和確認(rèn)。3)HTS技術(shù)通常篩選的對(duì)象是純化的化合物單體。如果帶測試的對(duì)象為混合物(例如天然產(chǎn)物粗分得到的不同組分)，則給出的數(shù)據(jù)代表的是多組分共同干擾酶活性的整體結(jié)果，單由這一結(jié)果無法得知是混合物中的何種成分真正起到作用。蛋白質(zhì)復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)解析是在原子層面上獲得關(guān)于蛋白質(zhì)復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)信息的技術(shù)手段。通常需要得到蛋白質(zhì)復(fù)合物的晶體，而后使用X射線衍射技術(shù)解析其三維結(jié)構(gòu)。一旦該方法成功得應(yīng)用于待研究的靶蛋白和藥物分子，便能夠詳細(xì)得了解藥物分子與靶標(biāo)蛋白結(jié)合作用的分子機(jī)制。對(duì)于待篩選的化合物分子，可將它與靶蛋白的晶體浸泡之后形成共晶(即復(fù)合物的晶體)，而后解析該復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，準(zhǔn)確得了解配體分子的結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合的空間模式。但是蛋白質(zhì)復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)解析方法具有以下缺點(diǎn):I)整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程周期長，成本高。對(duì)于靶蛋白及其復(fù)合物，摸索合適的結(jié)晶條件往往需要幾個(gè)月甚至幾年的努力，消耗大量的人力物力；在許多情況下，無論如何優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件都難以得到需要的蛋白質(zhì)晶體。2)通常情況下，這一技術(shù)僅用于分析與單一的配體(同靶蛋白結(jié)合的任何分子都稱為配體)有結(jié)合作用的蛋白質(zhì)，要求配體分子達(dá)到很高的純度。因此，對(duì)于篩選由天然產(chǎn)物/中藥提取出的組成復(fù)雜的混合物，必須進(jìn)行多步純化得到近乎單一的組分，才能使用該方法逐一得研究特定的小分子化合物和靶蛋白的結(jié)合作用。因此，需要發(fā)展一種普適性高，能夠排除HTS的假陽性結(jié)果，以及能夠適用于含有多種小分子化合物的混合物(例如天然產(chǎn)物提取物的初級(jí)分離產(chǎn)物)的分析配體和靶蛋白之間的結(jié)合作用的方法。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有問題，本發(fā)明提供了一種普適性高，能夠排除HTS的假陽性結(jié)果，以及能夠適用于含有多種小分子化合物的混合物的分析配體和靶蛋白之間的結(jié)合作用的方法。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供的分析方法包括以下步驟:I)對(duì)靶蛋白進(jìn)行純化由于通過生物工程技術(shù)制備的靶蛋白的溶液不適用于直接的質(zhì)譜分析，我們首先需要對(duì)該蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行緩沖液的置換，去除其中所含的對(duì)質(zhì)譜分析有嚴(yán)重干擾性的鹽類小分子。該步驟可以使用離心式濃縮管、微透析或者微型色譜柱來實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選的靶蛋白是特定病毒合成的蛋白酶(例如HIV蛋白酶和SARS冠狀病毒主蛋白酶)或核酸內(nèi)切酶，該蛋白靶標(biāo)對(duì)病毒的繁殖和侵襲宿主具有關(guān)鍵作用。2)利用高通量酶活性測試系統(tǒng)篩選出對(duì)靶蛋白的活性具有抑制效果的候選抑制劑抑制劑是指能夠結(jié)合特定的蛋白質(zhì)并抑制其活性的物質(zhì)。利用高通量酶活性測試系統(tǒng)(HTS)，我們能夠快速的篩選對(duì)某種靶蛋白的活性有特異性抑制效果的化合物分子或者天然產(chǎn)物的提取組分。這些由HTS篩選出的候選抑制劑(可以是單一成分或者是多組分的混合物)，將被用于下一步的生物質(zhì)譜分析以便確認(rèn)它們是否為真正結(jié)合靶蛋白的配體，配體為與靶蛋白結(jié)合的任何分子。其中天然產(chǎn)物(例如生藥)的化學(xué)成分相當(dāng)復(fù)雜，通過提取得到的提取物往往是大量單體組成的混合物，所以篩選前需要對(duì)天然產(chǎn)物的提取物進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆蛛x。本發(fā)明選擇制備型HPLC獲取天然產(chǎn)物的逐級(jí)分離的提取物。對(duì)于下游的質(zhì)譜分析，該提取物可以是十幾種或幾十種單體組成的混合物，如此可以顯著降低對(duì)天然產(chǎn)物組分分離的成本投入。利用高通量酶活性測試系統(tǒng)(HTS)，能夠快速地篩選對(duì)某種靶蛋白的活性具有特異性抑制效果的天然產(chǎn)物的提取組分。3)制備靶蛋白-配體復(fù)合物將候選抑制劑與靶蛋白浸泡，使用溶解蛋白質(zhì)的緩沖液稀釋候選抑制劑的儲(chǔ)液，使得蛋白質(zhì)與抑制劑分子的終濃度配比在1: 5 1: 10(摩爾比)范圍內(nèi)。二者通常在室溫條件下浸泡10-15分鐘，形成可能的靶蛋白-配體復(fù)合物。由天然產(chǎn)物中提取出的提取物組分，其水溶性和脂溶性變化范圍很大。脂溶性過高的提取物組分不適合于直接的質(zhì)譜分析。為此，本發(fā)明采用特定的方法來考察和增強(qiáng)候選提取物組分在蛋白質(zhì)緩沖液中的溶解性。首先，對(duì)于能夠使用HPLC級(jí)甲醇或乙醇完全溶解的提取物組分，將其先用溶解蛋白質(zhì)的緩沖液進(jìn)行稀釋，而后與靶蛋白浸泡，使其在合適條件下形成可能的靶蛋白-配體復(fù)合物；其次，對(duì)于無法完全溶解于甲醇或乙腈的組分，使用DMSO將其配置成高濃度的儲(chǔ)液，而后用用于溶解蛋白質(zhì)的緩沖液逐級(jí)稀釋到合適的濃度，確定其均勻分散于溶液之中，再與靶蛋白浸泡形成復(fù)合物。再次，對(duì)于那些經(jīng)過逐級(jí)稀釋仍舊生成沉淀的組分，我們會(huì)獲取其中的上清(含有水溶性較高的單體成分)與靶蛋白浸泡形成可能的復(fù)合物。4)利用質(zhì)譜分析靶蛋白與配體的結(jié)合作用使用高分辨的電噴霧離子化質(zhì)譜(ES1-MS)來研究上一步驟得到的靶蛋白-配體復(fù)合物。為得到高信號(hào)強(qiáng)度、高分別率的質(zhì)譜圖，可以對(duì)質(zhì)譜儀的若干電壓參數(shù)和真空度值進(jìn)行優(yōu)化。通過適當(dāng)?shù)拇蜷_離子源內(nèi)的隔離閥來調(diào)整質(zhì)譜儀的前級(jí)壓力，使其在4-6mbar之內(nèi)變動(dòng)，可以提高蛋白質(zhì)復(fù)合物在源內(nèi)的去溶劑化效率，最終增強(qiáng)復(fù)合物的質(zhì)譜信號(hào)，使分析較低濃度的樣品成為可能。通過精確測量靶蛋白及其與配體形成的復(fù)合物的整體分子量(質(zhì)量偏差通常小于OTa)，可以準(zhǔn)確的判斷該抑制劑分子是否與靶蛋白發(fā)生直接的結(jié)合作用，并獲知結(jié)合的配比數(shù)。一旦確認(rèn)靶蛋白與配體的結(jié)合，可以進(jìn)行滴定實(shí)驗(yàn)測量出能夠反映結(jié)合強(qiáng)度的解離常數(shù)值(Kd)，解離常數(shù)是直接反映結(jié)合強(qiáng)度的物理參數(shù)。如果待檢測的是多組分的混合物，其中真正有抑制效果的配體分子將與靶蛋白發(fā)生結(jié)合，從而在質(zhì)譜分析中顯現(xiàn)出特異的信號(hào)。根據(jù)所形成的復(fù)合物的整體分子量，我們可獲得關(guān)于未知的配體分子的精確分子量信息，指導(dǎo)下一步的結(jié)構(gòu)鑒定工作。相比之下，存在于該混合物中的非抑制劑分子無法結(jié)合靶蛋白，也就不會(huì)產(chǎn)生特定的質(zhì)譜信號(hào)。因而，本技術(shù)方案能夠區(qū)分混合物中的真實(shí)配體和雜質(zhì)成分，降低對(duì)候選化合物純度的要求?，F(xiàn)代生物質(zhì)譜分析方法具有靈敏度和特異性高，以及分析速度快的優(yōu)點(diǎn)，能夠發(fā)展成為研究生物大分子尤其是蛋白質(zhì)復(fù)合物的關(guān)鍵技術(shù)手段。與廣泛應(yīng)用的高通量篩選技術(shù)(HTS)和其他常見的表征蛋白質(zhì)-配體結(jié)合作用的技術(shù)相比，質(zhì)譜分析具有以下的獨(dú)特優(yōu)勢:I)利用質(zhì)譜研究藥物候選分子和靶蛋白的結(jié)合作用是一種普適性很高的方法，即研究不同的靶蛋白可以采用基本相同的技術(shù)路線；2)無需標(biāo)記底物和靶蛋白，減少化學(xué)標(biāo)記可能對(duì)蛋白的結(jié)合性質(zhì)產(chǎn)生的影響；3)質(zhì)譜的高靈敏度使靶蛋白的消耗量可降至微克級(jí)；4)對(duì)配體分子和靶蛋白的純度要求明顯降低，質(zhì)譜能夠區(qū)分混合底物中的不同成分，對(duì)它們各自的結(jié)合性質(zhì)同時(shí)進(jìn)行表征。本發(fā)明提供的分析配體和靶蛋白之間的結(jié)合作用的方法是一種普適性高的分析方法，對(duì)于不同的靶蛋白和從天然產(chǎn)物中提取出的結(jié)構(gòu)各異的小分子配體，都能采用該方法快速地檢測配體與蛋白質(zhì)的結(jié)合作用本發(fā)明提供的分析方法可以用于驗(yàn)證通過HTS得到的候選抑制劑，確認(rèn)該候選抑制劑與靶蛋白是否發(fā)生直接的結(jié)合(成為靶蛋白的配體分子)，排除HTS的假陽性結(jié)果。
本發(fā)明提供的分析方法可以用于測量靶蛋白與配體的結(jié)合配比、結(jié)合強(qiáng)度等熱力學(xué)參數(shù)。對(duì)于從天然產(chǎn)物中初步提取得到的含有多種小分子化合物的混合物，能夠通過本發(fā)明提供的分析方法檢測混合物中與靶蛋白發(fā)生結(jié)合作用的配體，加快候選抑制劑分子的篩選流程。


圖1是示出靶蛋白(HIV病毒蛋白酶)分別與兩種從天然產(chǎn)物提取出的不同組分A和B浸泡后的得到的靶蛋白-配體的質(zhì)譜圖。圖2是把圖1中靶蛋白與天然產(chǎn)物組分A中的某一單體結(jié)合后得到的靶蛋白-配體的質(zhì)譜圖。圖3是示出靶蛋白結(jié)合圖1中天然產(chǎn)物組分B中存在的化合物單體得到的靶蛋白-配體的質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。以下實(shí)例說明本實(shí)驗(yàn)流程能夠從多組分混合物中有效得檢測與靶蛋白發(fā)生直接結(jié)合作用的小分子配體，得出關(guān)于配體數(shù)和結(jié)合強(qiáng)度(由解離常數(shù)來衡量)的具體信息。將重組蛋白HIV病毒蛋白酶首先進(jìn)行緩沖液置換,使之溶解于IOmM醋酸銨溶液(pH 6.9)，濃度為20 ii M。由HTS篩選得到的若干抑制劑組分使用與溶解蛋白質(zhì)的緩沖液相同的緩沖液稀釋到100 U M(可溶于甲醇的提取物，使用蛋白的緩沖液稀釋)，而后分別與靶蛋白溶液1:1 (體積比)混合(使得蛋白質(zhì)與抑制劑分子的終濃度配比為1: 5)，在室溫放置15分鐘。使用生物質(zhì)譜直接分析混合液中存在的蛋白質(zhì)復(fù)合物。質(zhì)譜分析條件:掃描范圍m/z為2500-5000，噴霧電壓為2.2 2.5kV，鞘氣流速為30 50L/h，采集時(shí)間間隔為1.0 1.5sec。質(zhì)譜儀選擇高分辨的電噴霧四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(ES1-Q-TOF MS)。圖1是示出靶蛋白(HIV病毒蛋白酶)分別與兩種從天然產(chǎn)物提取出的不同組分A和B浸泡后得到的靶蛋白-配體的質(zhì)譜圖。與靶蛋白自身產(chǎn)生的質(zhì)譜峰相比較，在每一簇蛋白峰的右側(cè)都能見到幾簇新的質(zhì)譜峰，這是靶蛋白結(jié)合了小分子配體生成復(fù)合物而發(fā)生質(zhì)量遷移所造成的，說明這兩種天然產(chǎn)物組分中確實(shí)存在能夠特異性結(jié)合該靶蛋白的化合物單體。將譜圖中的特定質(zhì)譜峰解析成對(duì)應(yīng)的大分子的精確分子量，能夠得到如圖2和圖3所示的代表性的結(jié)果。圖2是圖1中靶蛋白與天然組分A中某一單體結(jié)合的復(fù)合物對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜峰經(jīng)過解析后得到的質(zhì)譜圖。圖2左側(cè)顯示的是靶蛋白自身測得的分子量(21641，21683，21726Da，有三種形式存在)，右側(cè)的則是結(jié)合了小分子配體的復(fù)合物的整體分子量(21969,22012，22054Da)，由此得出復(fù)合物與靶蛋白的平均質(zhì)量差異是328Da，與該組分含有的化合物單體的分子量(328Da)完全相符，說明靶蛋白的三種形式均結(jié)合了一個(gè)小分子配體(配比數(shù)是1:1)。圖3顯示的是靶蛋白結(jié)合圖1顯示的天然產(chǎn)物B中的某一單體形成的復(fù)合物經(jīng)過分子量解析后得到了幾組質(zhì)量數(shù)。舉其中信號(hào)較強(qiáng)的一組數(shù)值為例:靶蛋白自身的某種形式測量得到的精確分子量為21688Da，我們同時(shí)又得到分別結(jié)合了一個(gè)、兩個(gè)和三個(gè)的復(fù)合物的分子量(分別為22095，22501，22907Da)，因而我們了解到該種小分子配體質(zhì)量數(shù)為407Da，可以不同的配比數(shù)1: 1，1: 2，1: 3與靶蛋白發(fā)生結(jié)合作用。考慮到浸泡時(shí)所用的靶蛋白和小分子配體的實(shí)際濃度，根據(jù)蛋白質(zhì)復(fù)合物產(chǎn)生的質(zhì)譜信號(hào)的強(qiáng)度，我們能夠通過公式進(jìn)一步估算出不同的配體分子與靶蛋白形成復(fù)合物的解離常數(shù)Kd。本例中，經(jīng)計(jì)算得知配比數(shù)為1: 1，1: 2和1: 3的復(fù)合物的解離常數(shù)分別是50 iiM，40 ii M和IlOii M。上文中提到的天然產(chǎn)物A組分是用95%乙醇提取原藥材厚樸，提取物用乙酸乙酯萃取，然后分離純化，含有新木質(zhì)素類化合物。天然產(chǎn)物B組分是用95%乙醇提取原藥材夜關(guān)門，提取物用乙酸乙酯萃取，然后分離純化，含有黃酮的糖苷類化合物。盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。
權(quán)利要求
1.一種篩選和/或分析目標(biāo)配體的方法，包括如下步驟: a.制備受試品與目標(biāo)靶點(diǎn)的復(fù)合物； b.利用質(zhì)譜分析上述復(fù)合物是否制備成功。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，當(dāng)步驟b的分析結(jié)果為復(fù)合物制備成功時(shí)，所述方法還包括:c.進(jìn)一步分析復(fù)合物中受試品與目標(biāo)祀點(diǎn)結(jié)合的配比數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟b通過以下方式實(shí)施:通過質(zhì)譜精確測量的結(jié)果判斷是否存在目標(biāo)靶點(diǎn)與受試品形成的復(fù)合物的整體分子量，從而判斷復(fù)合物是否制備成功。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟c通過以下方式實(shí)施:將目標(biāo)靶點(diǎn)與受試品形成的復(fù)合物的整體分子量，減去目標(biāo)靶點(diǎn)的分子量，獲得的差值與受試品的分子量進(jìn)行比較，通過兩者之間的倍數(shù)關(guān)系來分析受試品與目標(biāo)靶點(diǎn)結(jié)合的配比數(shù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中在c步驟之后，還包括:d.利用滴定實(shí)驗(yàn)測量反映目標(biāo)靶點(diǎn)與目標(biāo)配體之間的結(jié)合強(qiáng)度的解離常數(shù)值的步驟。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述目標(biāo)配體是與目標(biāo)靶點(diǎn)形成復(fù)合物的受試品。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述受試品是利用高通量酶活性測試系統(tǒng)篩選獲得的所述目標(biāo)靶點(diǎn)的候選抑制劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述候選抑制劑是單一的成分，或者是包含多組分的混合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述包含多組分的混合物是天然產(chǎn)物的提取物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在制備受試品與目標(biāo)靶點(diǎn)的復(fù)合物的步驟之前還包括通過離心式濃縮管、微透析或者微型色譜柱純化目標(biāo)靶點(diǎn)的步驟。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中制備受試品與目標(biāo)靶點(diǎn)的復(fù)合物的步驟通過將所述目標(biāo)靶點(diǎn)與受試品一起浸泡實(shí)施。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟b的質(zhì)譜分析通過高分辨的電噴霧離子化質(zhì)譜(ES1-MS)實(shí)施。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中步驟b的質(zhì)譜分析包括打開離子源內(nèi)的隔離閥來調(diào)整質(zhì)譜儀的前級(jí)壓力，使其在4-6mbar的范圍內(nèi)變動(dòng)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述目標(biāo)靶點(diǎn)是病毒合成的蛋白酶，或者是核酸內(nèi)切酶。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述病毒合成的蛋白酶是HIV蛋白酶或SARS冠狀病毒主蛋白酶。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種篩選和/或分析目標(biāo)配體的方法，包括如下步驟a.制備受試品與目標(biāo)靶點(diǎn)的復(fù)合物；b.利用質(zhì)譜分析上述復(fù)合物是否制備成功；以及可選地包括c.進(jìn)一步分析復(fù)合物中受試品與目標(biāo)靶點(diǎn)結(jié)合的配比數(shù)。該方法普適性高，能夠排除HTS的假陽性結(jié)果，以及能夠適用于含有多種小分子化合物的混合物。
文檔編號(hào)G01N27/62GK103163205SQ201110412780
公開日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2011年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月12日
發(fā)明者水雯箐, 饒子和, 李偉, 郭宇, 楊誠 申請(qǐng)人:天津市國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院, 南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院