專利名稱：兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗體的制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生命科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及為一種兔抗人a-乳清蛋白多克隆抗體的制備及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
a -乳清蛋白作為乳品中重要的營養(yǎng)成分，約占人乳中總蛋白含量的28%，占乳清白蛋白含量的49%，其蛋白質(zhì)效率、凈蛋白質(zhì)利用率都高于酪蛋白，是一種極易消化吸收的蛋白質(zhì)。同時，天然狀態(tài)下的a-乳清白蛋白，在有C18:1脂肪酸存在下，可以轉(zhuǎn)變成具有殺菌活性的形式。而且a-乳清蛋白富含半胱氨酸和蛋氨酸，它們能維持人體內(nèi)抗氧化劑的水平，并可促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，它還富含色氨酸，可促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，并有調(diào)節(jié)睡眠 和食欲的作用，對該基因內(nèi)源表達(dá)的研究表明，該基因的表達(dá)具有很高的組織特異性和發(fā)育時期的特異性。a -乳清蛋白是一種小分子質(zhì)量的酸性鈣結(jié)合蛋白，等電點(diǎn)在4 5之間，幾乎存在于所有的哺乳動物乳汁中，多數(shù)a-乳清蛋白含有123個氨基酸，其中包括人、牛、羊、兔等物種，一般該基因的轉(zhuǎn)錄單元長度都在2Kb左右，包括4個外顯子。a -乳清蛋白在氨基酸序列上與溶菌酶家族同源，X-射線衍射晶體結(jié)構(gòu)分析顯示它的三級結(jié)構(gòu)也與溶菌酶相似。a -乳清蛋白在葡萄糖存在條件下，與半乳糖甘轉(zhuǎn)移酶結(jié)合在一起，調(diào)節(jié)該酶的專一性，它限制著乳糖合成復(fù)合體的速率，是乳糖合成必需的關(guān)鍵基因，因此a-乳清蛋白被認(rèn)為具有通過控制乳糖的合成而間接影響乳產(chǎn)量及乳品質(zhì)的功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種特異性好、純度高、可與人乳腺細(xì)胞的a-乳清蛋白發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的兔抗人a-乳清蛋白多克隆抗體的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的具體實(shí)施步驟如下
步驟(I).經(jīng)DNAStar軟件分析后，將人的a -乳清蛋白N端第122~ 141位的20個氨基酸作為兔抗人a -乳清蛋白多克隆抗體抗原表位，氨基酸序列如下TyrTrpLeuAlaHisLysAlaLeuCysSerGluLysLeuAspGlnTrpLeuCysGluLys ；
步驟(2).用多肽自動合成儀合成人的a-乳清蛋白多肽并純化，純化后與載體蛋白KLH偶聯(lián)，形成人的a-乳清蛋白多肽-KLH復(fù)合蛋白；
步驟(3).將人的a-乳清蛋白多肽-KLH復(fù)合蛋白乳化，乳化后在兔腹部皮下多點(diǎn)注射，先后注射三次，每次間隔7 ~ 10天；
步驟(4).第三次注射10 ~ 12天后，收集、分離得到含有兔抗人a-乳清蛋白多克隆抗體的血清，ELISA檢測血清中兔抗人a -乳清蛋白多克隆抗體的效價，
所述的兔抗人a-乳清蛋白多克隆抗體，其效價在1:60000以上；
步驟(5).將步驟⑵合成并純化后的人的a-乳清蛋白多肽與溴化氰活化的Sepharose 4B偶聯(lián),形成多肽親和層析柱；步驟￠).將含有兔抗人a-乳清蛋白多克隆抗體的血清加入到步驟(5)制備的多肽親和層析柱中，并在4°C孵育過夜后，洗脫抗體，得到兔抗人a-乳清蛋白多克隆抗體；
所述的步驟(2)人的a-乳清蛋白多肽的純化，采用HPLC，可使人的a-乳清蛋白多肽的純度達(dá)到95%以上；
所述的步驟(6)中兔抗人a-乳清蛋白多克隆抗體的純化，采用免疫親和純化的方式。兔抗人a-乳清蛋白多克隆抗體初步應(yīng)用較為廣泛，可與人乳腺細(xì)胞的a-乳清蛋白發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，可用于western-blot、免疫組化等試驗(yàn)的要求。本發(fā)明有益效果如下
本發(fā)明制備的抗a-乳清蛋白多克隆抗體具有特異性好、純度高的特點(diǎn)、可與人乳腺細(xì)胞ct -乳清蛋白發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng),可用于western-blot、免疫組化等實(shí)驗(yàn)的要求。本發(fā)明兔抗人a-乳清蛋白多克隆抗體的制備，為深入研究人a-乳清蛋白的生物學(xué)功能和 在乳腺細(xì)胞水平調(diào)控人的乳汁分泌及品質(zhì)提供了一個重要工具，具有重要的理論意義和生產(chǎn)價值。


圖I為本發(fā)明a -乳清蛋白的western-blot分析結(jié)果 圖2為本發(fā)明在人乳腺癌細(xì)胞中的免疫組化染色圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例I :
步驟(I).經(jīng)DNAStar軟件分析后，將人的a -乳清蛋白N端第122 一 141位的20個氨基酸作為兔抗人a-乳清蛋白多克隆抗體抗原表位，氨基酸序列如下
TyrTrpLeuAlaHisLysAlaLeuCysSerGluLysLeuAspGlnTrpLeuCysGluLys ；
步驟(2).用多肽自動合成儀合成人的a-乳清蛋白多肽并純化，純化后與載體蛋白KLH偶聯(lián)，形成人的a-乳清蛋白多肽-KLH復(fù)合蛋白；
步驟(3).將人的a-乳清蛋白多肽-KLH復(fù)合蛋白乳化，乳化后在兔腹部皮下多點(diǎn)注射，先后注射三次，每次間隔7 ~ 10天；
步驟(4).第三次注射10 ~ 12天后，收集、分離得到含有兔抗人a-乳清蛋白多克隆抗體的血清，ELISA檢測血清中兔抗人a -乳清蛋白多克隆抗體的效價，
所述的兔抗人a-乳清蛋白多克隆抗體，其效價在1:60000以上；
步驟(5).將步驟⑵合成并純化后的人的a-乳清蛋白多肽與溴化氰活化的Sepharose 4B偶聯(lián),形成多肽親和層析柱；
步驟出).將含有兔抗人a-乳清蛋白多克隆抗體的血清加入到步驟(5)制備的多肽親和層析柱中，并在4°C孵育過夜后，洗脫抗體，得到兔抗人a -乳清蛋白多克隆抗體；
所述的步驟(2)人的a-乳清蛋白多肽的純化，采用HPLC，可使人的a-乳清蛋白多肽的純度達(dá)到95%以上；
所述的步驟(6)中兔抗人a-乳清蛋白多克隆抗體的純化，采用免疫親和純化的方式。兔抗人a -乳清蛋白多克隆抗體應(yīng)用I步驟如下步驟(I).蛋白裂解液裂解人乳腺癌組織樣品，冰上孵育30 min后，13500g離心45min，獲得乳腺癌組織總蛋白；
步驟(2).取5 Ug總蛋白裂解液并加入等體積2 X SDS加樣緩沖液，于100°C加熱5 min后，進(jìn)行常規(guī)SDS-PAGE電泳，分離膠濃度為100 g/L ；
步驟(3).電泳結(jié)束后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用50 g/L脫脂奶粉室溫下封閉I h;
步驟(4).加入I : I 000稀釋的兔抗人a-乳清蛋白多克隆抗體，室溫下孵育2 h；步驟(5).圖I所示，TBST緩沖液洗膜后，加入羊抗兔IgG-HRP抗體，室溫下孵育I h，TBST緩沖液洗膜后的圖。兔抗人a -乳清蛋白多克隆抗體應(yīng)用2步驟如下
步驟(I).取人乳腺癌組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟入水，0. 3%H202-甲醇浸泡30 40分鐘，PBS浸洗3次后，0. 1%的凝膠封閉，30 ~ 60分鐘后除去多余封閉液； 步驟(2).加入a-乳清蛋白多克隆抗體，37°C I小時或4°C孵育過夜；
步驟(3). PBS洗片3次，每次5分鐘，加入羊抗兔IgG-HRP，37°C孵育I小時；
步驟(4).如圖2所示，PBS洗片后進(jìn)行DAB顯色，蘇木素復(fù)染，返藍(lán)后封片鏡檢，放大400倍拍照記錄結(jié)果。
權(quán)利要求
1.兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗體的制備，其特征在于如下步驟 步驟(I).經(jīng)DNAStar軟件分析后，將人的α -乳清蛋白N端第122~ 141位的20個氨基酸作為兔抗人α -乳清蛋白多克隆抗體抗原表位，氨基酸序列如下TyrTrpLeuAlaHisLysAlaLeuCysSerGluLysLeuAspGlnTrpLeuCysGluLys ； 步驟(2).用多肽自動合成儀合成人的α-乳清蛋白多肽并純化，純化后與載體蛋白KLH偶聯(lián)，形成人的α-乳清蛋白多肽-KLH復(fù)合蛋白； 步驟(3).將人的α-乳清蛋白多肽-KLH復(fù)合蛋白乳化，乳化后在兔腹部皮下多點(diǎn)注射，先后注射三次，每次間隔7 ~ 10天； 步驟(4).第三次注射10 12天后，收集、分離得到含有兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗體的血清，ELISA檢測血清中兔抗人α -乳清蛋白多克隆抗體的效價， 所述的兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗體，其效價在1:60000以上； 步驟(5).將步驟(2)合成并純化后的人的α-乳清蛋白多肽與溴化氰活化的Sepharose 4Β偶聯(lián),形成多肽親和層析柱； 步驟(6).將含有兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗體的血清加入到步驟(5)制備的多肽親和層析柱中，并在4°C孵育過夜后，洗脫抗體，得到兔抗人α -乳清蛋白多克隆抗體； 所述的步驟(2)人的α-乳清蛋白多肽的純化，采用HPLC，可使人的α-乳清蛋白多肽的純度達(dá)到95%以上； 所述的步驟(6)中兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗體的純化，采用免疫親和純化的方式。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗體的制備后的應(yīng)用，其特征在于該抗體可與人乳腺細(xì)胞的α -乳清蛋白發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，可用于western-blot、免疫組化試驗(yàn)的要求。
全文摘要
本發(fā)明公開了兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗體的制備與應(yīng)用。目前沒有兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗體的制備，本發(fā)明方法通過如下步驟制備1)α-乳清蛋白分子N端多肽抗原的合成；2)兔抗人α-乳清蛋白分子多克隆抗體的制備；3)ELISA檢測抗血清效價；4)抗血清的純化；5)α-乳清蛋白多抗的western-blot分析；6)多克隆抗體的免疫組化染色。本發(fā)明具有特異性好、純度高的特點(diǎn)，可與人乳腺細(xì)胞的α-乳清蛋白發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，可用于western-blot、免疫組化等試驗(yàn)的要求。
文檔編號G01N33/68GK102633879SQ201110449770
公開日2012年8月15日 申請日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者徐寧迎, 沈一飛, 王穎, 郝柱 申請人:浙江大學(xué)