一種胎球蛋白a重組蛋白及多克隆抗體的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及本生物科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種重組胎球蛋白A重組蛋白及其多 克隆抗體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 胎球蛋白A(fetuin_A/AHSG)也稱之為a-2-HS糖蛋白，是由兩個(gè)氨基末端抑制 域和一個(gè)較小的羧基末端域組成的59kDa分子量的糖蛋白；由肝臟合成，分泌至血流，成年 哺乳動(dòng)物體內(nèi)的濃度范圍在〇.5-1.Og/L;嬰兒期的血清胎球蛋白A含量高，參與蛋白酶抑 制活性，與鈣代謝和骨生成調(diào)節(jié)相關(guān)；累積于骨和牙齒內(nèi)，作為生物學(xué)上非膠原骨蛋白的主 要部分，它在人體血液中的含量與外傷感染、心血管疾病、結(jié)石、SARS等疾病相關(guān)。AHSG具 有高度的遺傳多態(tài)性，其基因的多態(tài)性位點(diǎn)與II型糖尿病、血管鈣化和SARS的易感性等相 關(guān)，研究表明，胎球蛋白A是循環(huán)中主要的鈣化抑制劑；干涉鈣鹽沉淀；近期研究顯示低水 平胎球蛋白A的慢性腎臟衰竭患者與心血管病的高死亡率顯著相關(guān)；另一方面，糖尿病老 年人血清胎球蛋白A含量比正常人高，這是獨(dú)立于胰島素抑制劑的其他標(biāo)記物；另外，高胎 球蛋白A水平還可作為心血管疾病的的危險(xiǎn)標(biāo)記物。
[0003]AHSG有多種生物學(xué)功能：能夠抑制堿性磷酸I丐（basiccalciumphosphate,BCP) 沉淀，維持體液中鈣含量；能夠參與巨噬細(xì)胞失活，調(diào)控炎癥程度；能夠抑制胰島素受體自 身磷酸化和其酪氨酸激酶的活性，導(dǎo)致產(chǎn)生胰島素抵抗和II型糖尿?。荒軌蚺c轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因 子-0(transforminggrowthfactor,TGF-0)結(jié)合，進(jìn)而抑制腸腫瘤的生長(zhǎng)。因此，測(cè)定 胎球蛋白A的表達(dá)量，有很大的價(jià)值，通常測(cè)定蛋白濃度的方法是通過(guò)ELISA等免疫檢測(cè)方 法來(lái)實(shí)現(xiàn)的，這就需要效價(jià)很高的可用于診斷原料的胎球蛋白抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種胎球蛋白A重組蛋白及多克隆抗體的制備方法，該方法 制備的胎球蛋白A重組蛋白表達(dá)產(chǎn)量高，抗體干粉可作為血清學(xué)檢查的診斷原料。
[0005] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0006] -種胎球蛋白A重組蛋白的制備方法，包括如下步驟：
[0007] (1)胎球蛋白A抗原表位分析：通過(guò)抗原表位分析選擇目的片段用作胎球蛋白A 的重組表達(dá)，所述目的片段的基因序列如序列表中SEQIDNO. 1所示；
[0008] (2)重組胎球蛋白A的合成：將選定的目的片段的DNA通過(guò)PCR擴(kuò)增后插入到表 達(dá)載體，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，大腸桿菌在生長(zhǎng)的同時(shí)，目的蛋白也將得到表達(dá)。
[0009] 進(jìn)一步地，步驟（2)中所述的PCR擴(kuò)增的引物序列為SEQIDNo. 2和SEQIDNo. 3 所示。
[0010] 一種胎球蛋白A重組蛋白抗體的制備方法，將分離純化后的權(quán)利要求1制備的重 組胎球蛋白A作為抗原去免疫兔子，得到含抗重組胎球蛋白A抗體的抗血清。
[0011] 進(jìn)一步地，得到含抗重組胎球蛋白A抗體的抗血清后，進(jìn)行分離純化，得到抗重組 胎球蛋白A抗體干粉。
[0012] 進(jìn)一步地，所述的重組胎球蛋白A的分離純化包括：
[0013] 分離，收集培養(yǎng)的大腸桿菌，離心棄上清；冰上在細(xì)胞中加入1/20細(xì)胞生長(zhǎng)體積 的NTA-OBuffer和PMSF，然后向緩沖體系中加入溶菌酶，置冰上冷卻處理；將細(xì)胞懸浮起 來(lái)，加入10%TritonX-100,使TritonX-100的終濃度為0? 05%，充分混勻，冰上放置15 分鐘，間或混勻；冰上超聲破碎細(xì)胞，后用離心機(jī)離心取上清再離心一次，再過(guò)0. 22ym的 濾膜過(guò)濾；
[0014] 純化，將Ni-NTA樹(shù)脂裝入合適的層析柱，用10倍柱床體積的NTA-OBuffer沖洗， 然后將樣品加到Ni-NTA層析柱中，流速控制在0. 5ml/min，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分 析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況；層析用10倍柱床體積的NTA-OBufTer沖洗，流速控制在lml/min，后 用20mM、60mM、200mM和500mM咪唑溶液洗Ni-NTA柱，直至檢測(cè)G250不變藍(lán)為止，分別收集 流出液體，SDS/PAGE分析，確定目標(biāo)蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況。
[0015] 進(jìn)一步地,所述免疫兔子的具體方法為：取純化后的重組胎球蛋白A免疫家兔,免 疫劑量為500 - 600ug/只，第一次免疫用弗氏完全佐劑，以后用不完全弗氏佐劑，免疫間隔 時(shí)間為2 - 3周，免疫3 - 4次，兔子背部多點(diǎn)注射，靜脈采血，得到含抗重組胎球蛋白A抗 體的抗血清。
[0016] 進(jìn)一步地，所述含抗重組胎球蛋白A抗體的抗血清進(jìn)行分離純化的具體步驟為： 將抗血清過(guò)ProteinA柱；吸附后進(jìn)行洗脫；收集的解吸液，透析、冷凍干燥，既得重組胎球 蛋白A抗體干粉。
[0017] 本發(fā)明提供的胎球蛋白A抗體的制備方法，通過(guò)對(duì)胎球蛋白A的抗原表位分析，把 兩端沒(méi)有免疫原性的位點(diǎn)去掉，而對(duì)可產(chǎn)生較強(qiáng)免疫原性位點(diǎn)的基因片段選擇合適的引物 (參見(jiàn)序列表SEQIDNo. 2和SEQIDNo. 3)進(jìn)行擴(kuò)增，并采用該位點(diǎn)的氨基酸序列制備重 組蛋白片段，用此片段免疫動(dòng)物得到特異性針對(duì)該位點(diǎn)的抗體。在重組蛋白制備的中采用 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，能很好的保證重組蛋白的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)量高，有利于大批量的制備重組 胎球蛋白A及其抗體，適合于作為診斷原料和疫苗開(kāi)發(fā)的技術(shù)。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的胎球蛋白A重組蛋白的電泳圖。
[0019] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的全長(zhǎng)表達(dá)的胎球蛋白A制備的多克隆抗體和優(yōu)化后的 片段表達(dá)的胎球蛋白A制備的多克隆抗體的免疫膠乳實(shí)驗(yàn)對(duì)比結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 實(shí)施例1 一種胎球蛋白A重組蛋白及其多克隆抗體的制備方法
[0021] ( -）抗原表位分析
[0022] 采用DNAStar軟件進(jìn)行抗原表位分析，分析結(jié)論，SEQIDNo. 1的抗原性良好，抗 原決定簇主要集中在N端22個(gè)氨基酸和C端50個(gè)氨基酸，根據(jù)抗原決定簇分析結(jié)果，考慮 將SEQIDNo. 1進(jìn)行原核表達(dá)，并根據(jù)序列設(shè)計(jì)特異性引物。
[0023](二）表達(dá)載體的構(gòu)建
[0024] 1、基因犾取
[0025]I.IRNA提?。豪肨RIzol法提取U251細(xì)胞總RNA
[0026] 1)取IO6-IO7個(gè)細(xì)胞于EP管中，PBS清洗后，加入ImlTransZol，吹吸混勻，然后 室溫孵育5min;
[0027] 2)加入0. 2ml氯仿，渦旋劇烈震蕩15s，室溫孵育3min;
[0028] 3)IlOOOrmp4°C離心15min，此時(shí)溶液分為3層，RNA主要在上層水相中；
[0029] 4)將無(wú)色的水相轉(zhuǎn)移到新的I.5mLEP管中，加入500ul異丙醇，室溫孵育IOmin;
[0030] 5)IlOOOrmp4°C離心lOmin，去上清，在側(cè)管和底管形成膠狀沉淀；
[0031] 6)加Iml75%乙醇（用DEPC處理的水配制，并現(xiàn)配現(xiàn)用），劇烈渦旋至管底的膠 狀沉淀懸其并分散為止；
[0032] 7) 8000rmp4°C離心5min，棄上清，室溫晾干沉淀，沉淀溶于30-100ulRNA溶解液 中，保存樣品于_7〇°C長(zhǎng)期備用。
[0033] 1. 2利用RT-PCR法獲取目的基因
[0034]I)RT:按表1將溶液依次從多至少加入PCR管中；
[0035]表1
[0036]
[0037]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種胎球蛋白A重組蛋白的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 胎球蛋白A抗原表位分析：通過(guò)抗原表位分析選擇目的片段用作胎球蛋白A的重 組表達(dá)，所述目的片段的基因序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示； (2) 重組胎球蛋白A的合成：將選定的目的片段的DNA通過(guò)PCR擴(kuò)增后插入到表達(dá)載 體，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，大腸桿菌在生長(zhǎng)的同時(shí)，目的蛋白也將得到表達(dá)。
2. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（2)中所述的PCR擴(kuò)增的引物序列 為 SEQ ID No. 2 和 SEQ ID No. 3 所示。
3. -種胎球蛋白A重組蛋白抗體的制備方法，其特征在于，將分離純化后的權(quán)利要求1 制備的重組胎球蛋白A作為抗原去免疫兔子，得到含抗重組胎球蛋白A抗體的抗血清。
4. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，得到含抗重組胎球蛋白A抗體的抗血清 后，進(jìn)行分離純化，得到抗重組胎球蛋白A抗體干粉。
5. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的重組胎球蛋白A的分離純化包 括： 分離，收集培養(yǎng)的大腸桿菌，離心棄上清；冰上在細(xì)胞中加入1/20細(xì)胞生長(zhǎng)體積的 NTA-OBuffer和PMSF，然后向緩沖體系中加入溶菌酶，置冰上冷卻處理；將細(xì)胞懸浮起來(lái)， 加入10% Triton X-100,使Triton X-100的終濃度為0· 05%，充分混勻，冰上放置15分 鐘，間或混勻；冰上超聲破碎細(xì)胞，后用離心機(jī)離心取上清再離心一次，再過(guò)0. 22 μ m的濾 膜過(guò)濾； 純化，將Ni-NTA樹(shù)脂裝入合適的層析柱，用10倍柱床體積的NTA-OBuffer沖洗，然后 將樣品加到Ni-NTA層析柱中，流速控制在0. 5ml/min，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析 蛋白質(zhì)的結(jié)合情況；層析用10倍柱床體積的NTA-OBufTer沖洗，流速控制在lml/min，后用 20mM、60mM、200mM和500mM咪唑溶液洗Ni-NTA柱，直至檢測(cè)G250不變藍(lán)為止，分別收集流 出液體，SDS/PAGE分析，確定目標(biāo)蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況。
6. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述免疫兔子的具體方法為：取純化后 的重組胎球蛋白A免疫家兔，免疫劑量為500 - 600ug/只，第一次免疫用弗氏完全佐劑，以 后用不完全弗氏佐劑，免疫間隔時(shí)間為2 - 3周，免疫3 - 4次，兔子背部多點(diǎn)注射，靜脈采 血，得到含抗重組胎球蛋白A抗體的抗血清。
7. 如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述含抗重組胎球蛋白A抗體的抗血清 進(jìn)行分離純化的具體步驟為：將抗血清過(guò)Protein A柱；吸附后進(jìn)行洗脫；收集的解吸液， 透析、冷凍干燥，既得重組胎球蛋白A抗體干粉。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種胎球蛋白A重組蛋白及多克隆抗體的制備方法，包括：胎球蛋白A抗原表位分析獲得目的片段用作胎球蛋白A的重組表達(dá)，將選定的目的片段的DNA通過(guò)PCR擴(kuò)增后插入到表達(dá)載體，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，表達(dá)重組胎球蛋白A，分離純化后作為抗原去免疫兔子，得到含抗重組胎球蛋白A抗體的抗血清。本發(fā)明能很好的保證重組蛋白的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)量高，有利于大批量的制備重組胎球蛋白A及其抗體，制備的抗體干粉適合于作為診斷原料和疫苗開(kāi)發(fā)。
【IPC分類】C07K14-47, C07K16-18, C12N15-70
【公開(kāi)號(hào)】CN104558145
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410848365
【發(fā)明人】華權(quán)高, 易汪雪, 徐春雷
【申請(qǐng)人】華權(quán)高
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2014年12月30日