米諾地爾人工抗原、其多克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種米諾地爾人工抗原、其多克隆抗體及其 制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 米諾地爾是一種治療高血壓的血管擴張藥，局部長期使用時可刺激毛發(fā)增生。 1988年美國FDA批準(zhǔn)米諾地爾可外用治療男性雄激素性脫發(fā)。雖然米諾地爾只是局部外 用，但存在頭皮輕度皮炎、眩暈、刺激性過敏、面部和四肢多毛癥等不良反應(yīng)，使用不慎 可能會灼傷和刺激眼部。日用洗發(fā)護發(fā)類化妝品不允許添加該藥物，《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》 (2007)明令禁止在化妝品中添加米諾地爾。但一些生產(chǎn)商為使洗發(fā)護發(fā)類化妝品達到一定 功效，牟取利潤，違規(guī)添加米諾地爾。因此，有必要對洗發(fā)護發(fā)類化妝品中是否含有米諾地 爾及其鹽和衍生物進彳丁檢測。
[0003] 近年來，食品中農(nóng)藥、獸藥殘留、保健品和化妝品中的非法添加劑的檢測方法已成 為研宄熱點，其中，以小分子為待測物的免疫分析技術(shù)發(fā)展迅速。免疫分析是以抗原與抗體 的特異性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的新型分析技術(shù)。相對于傳統(tǒng)檢測方法，它具有簡便、快速、靈敏 度高和成本低廉、便于現(xiàn)場檢測和高度特異性等特點。此外，免疫分析技術(shù)對藥品鑒定、藥 物代謝研宄、藥材中農(nóng)藥和重金屬殘留的檢驗、解毒及環(huán)境監(jiān)測等也具有重要意義。
[0004] 免疫分析幾乎適用于所有生物活性物質(zhì)的檢測，其基本原理是以待測物合成人工 抗原，經(jīng)動物獲取相應(yīng)的單克隆抗體，然后建立和優(yōu)化免疫分析程序進行檢測。有效的人工 抗原的合成是保證免疫分析的前提和關(guān)鍵，其合成途徑一般為：先根據(jù)待測分子的結(jié)構(gòu)設(shè) 計合成具有活性基團的半抗原，然后依據(jù)免疫學(xué)原理選擇適當(dāng)?shù)妮d體，最后用適當(dāng)?shù)姆绞?將半抗原與載體相互耦聯(lián)，形成載體-半抗原結(jié)合物，純化后即得到人工抗原。
[0005] 最近幾年，對于人工抗原的合成國內(nèi)外已有較多報道，Tuomola等用一個分子量很 小的化合物（分子量為131. 2) 3-甲基吲哚的羰基與適當(dāng)較長的連接臂連接，合成9個半 抗原，通過進一步篩選實驗得到特異性單克隆抗體。
[0006] 雖然人工抗原的合成方法有了很大的發(fā)展，但是所得到人工抗原的免疫原性差異 較大，部分人工抗原不能完全滿足免疫分析的要求。由于免疫應(yīng)答具有其復(fù)雜性，對于一個 具體的待測物，其人工抗原的合成要根據(jù)自身結(jié)構(gòu)特征具體分析與對待，需要設(shè)計、組合出 多套方案，如從不同位置引入不同性質(zhì)的基團、不同長度的間隔臂，將半抗原與多種載體相 結(jié)合，通過改變投料比例獲得不同結(jié)合比的人工抗原等等。通過免疫活性測試，優(yōu)化篩選制 備方案。因此，人工抗原合成研宄不單純是化學(xué)合成問題，亦涉及免疫學(xué)原理，如何根據(jù)免 疫學(xué)原理合成具有較高免疫原性的人工抗原是該領(lǐng)域的重要研宄方向。
[0007] 目前國內(nèi)仍未有明確關(guān)于洗發(fā)護發(fā)類化妝品中米諾地爾及其鹽和衍生物的檢測 方法標(biāo)準(zhǔn)。有文獻報道用紫外分光光度計和高效液相色譜法測定米諾地爾洗劑和血漿中的 米諾地爾，但這兩種方法靈敏度差、不具有特異性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種具有良好免疫原性的米諾地爾 人工抗原、其多克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用。解決當(dāng)前沒有高靈敏度、高特異性的米諾地 爾及其鹽和衍生物的檢測方法的問題。
[0009] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0010] 一種米諾地爾人工抗原，其結(jié)構(gòu)式為：
[0011]
【主權(quán)項】
1. 一種米諾地爾人工抗原，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式為：
〇
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種米諾地爾人工抗原的制備方法，其特征在于，包括如下 步驟： (1)取米諾地爾（Minoxidil)，溶于甲醇中，再加水稀釋，即得溶液I ; ⑵取蛋白載體，溶于PH值為7. 2-7. 4的緩沖溶液中，即得溶液II ; (3) 取25%的戊二醛（GA)，加水稀釋40?50倍，即得溶液III ; (4) 量取溶液I、溶液II、溶液III，其中溶液I和溶液III的摩爾濃度比為50?100:1，將 溶液I和溶液III混合均勻，混合后溶液逐滴加入到溶液II中，溶液I和溶液III的混合液與 溶液II的體積比為1?2:5,攪拌8-12小時； (5) 將步驟（4)所得混合溶液裝入透析袋中，對水透析4-5天，每天更換2-3次透析液， 收集透析外液，即得米諾地爾人工抗原。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種米諾地爾人工抗原的制備方法，其特征在于，所述蛋白 載體為牛血清白蛋白（BSA)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種米諾地爾人工抗原的制備方法，其特征在于，所述溶液 I和溶液III的摩爾濃度比為80:1。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種米諾地爾人工抗原的多克隆抗體，其特征在于，所述米 諾地爾人工抗原的多克隆抗體是能與所述米諾地爾人工抗原發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的免疫 球蛋白。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種米諾地爾人工抗原多克隆抗體的制備方法，其特征在 于，包括如下步驟： (1) 將制備好的米諾地爾人工抗原作為免疫原，對小鼠進行注射； (2) 第一次免疫注射后，每隔2周注射一次，S卩加強免疫； (3) 從第二次加強免疫起，每次加強免疫后的第7-10天，剪尾釆血，免疫注射4-6次； (4) 從采集的血液中分離獲得抗血清。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種米諾地爾人工抗原多克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，所 述多克隆抗體用于米諾地爾及其鹽和衍生物的免疫檢測。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種具有良好免疫原性的米諾地爾人工抗原、其多克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用。通過米諾地爾半抗原設(shè)計、連接臂引入、載體引入、合成、純化等步驟制備出具有免疫原性的人工抗原，再經(jīng)免疫動物等步驟制備出多克隆抗體并評估其效價。本發(fā)明提供的米諾地爾人工抗原及其多克隆抗體可用于米諾地爾的免疫檢測，滿足低成本、快捷、操作簡便的檢測要求；解決當(dāng)前沒有高靈敏度、高特異性的米諾地爾及其鹽和衍生物的檢測方法的問題。
【IPC分類】C07K16-18, G01N33-53, C07K14-765
【公開號】CN104530220
【申請?zhí)枴緾N201410742420
【發(fā)明人】張癸榮, 魏彪
【申請人】中國人民解放軍總后勤部衛(wèi)生部藥品儀器檢驗所
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月5日