專利名稱：血管緊張素ii酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
血管緊張素11酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒技術(shù)領(lǐng)域[0001]本實用新型涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種血管緊張素II(AngII)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒。
背景技術(shù)：
[0002]腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAQ在調(diào)節(jié)血壓、電解質(zhì)及體液平衡等生理功能中發(fā)揮重要作用。血管緊張素原(AGT)主要由肝臟合成并釋放入血，在腎素的作用下生成10肽化合物，即血管緊張素I (AngI)，AngI在血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)作用下生成8肽Angll，后者再通過ACE作用產(chǎn)生7肽的AngIII。其中AngII是RAS的主要效應(yīng)分子，通過作用于血管緊張素II受體1 (ATI)和AT2受體，在調(diào)節(jié)血壓、管球反饋、腎小管對水鈉的重吸收、腎臟發(fā)育及心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中占有重要地位。病理狀態(tài)下，AngII在高血壓、動脈粥樣硬化以及繼發(fā)性的心室肥厚等進程中發(fā)揮重要作用；同時，在糖尿病患者中，AngII可以直接或間接地抑制胰島素信號途徑，加重胰島素抵抗。同時，該物質(zhì)也可作為預(yù)測糖尿病患者發(fā)生心血管事件的危險因素。[0003]噬菌體展示技術(shù)是以噬菌體為載體，將完整的抗體可變區(qū)片段定向插入噬菌體外殼蛋白基因區(qū)，使其產(chǎn)物表達并展示于噬菌體表面，通過吸附-洗脫-擴增的重復(fù)過程，篩選獲得表達與已知抗原特異性結(jié)合的scFv片段的噬菌體，并通過基因改造使其成為完整抗體，改造后的抗體即可作為制備ELISA試劑盒的原料。由于目前商業(yè)化的噬菌體抗體庫庫容可達IOici-IO11,使得篩選成功率大大增加，可應(yīng)用在制備許多難以通過免疫動物獲得的抗體中。[0004]目前評價AngII的直接方法有高效液相色譜法(HPLC)、放射免疫法(RIA)以及酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。其中高效液相色譜法檢測范圍一般在2.5-500pg/ml，樣本回收率在90%以上。但是該方法存在的缺陷也是非常明顯的，存在檢測儀器費用高、操作繁瑣、樣本需要前處理等缺點。放射免疫法檢測靈敏度較高，但是由于應(yīng)用到放射性物質(zhì)， 對于實驗室的要求較高，且實驗廢液難處理。相比之下，ELISA法操作簡便，不需大型儀器，同時由于親和素-生物素放大的系統(tǒng)的應(yīng)用，極大的提高了其靈敏度。制備ELISA和 RIA試劑盒的重要原料就是針對AngII的特異性抗體。傳統(tǒng)的抗體制備方法是通過免疫動物，獲取能產(chǎn)生抗體的B淋巴細胞，在與骨髓瘤細胞融合得到雜交瘤細胞后，通過篩選得到能產(chǎn)生高親和力抗體的單克隆B細胞，再免疫動物生成富含抗體的腹水。該方法技術(shù)成熟，但操作較繁瑣，且對抗原的免疫原性要求高。由于AngII僅含8個氨基酸，其序列為 Asp-Arg-Val-Tyr-11 e-His-Pro-Phe,分子量為1046. 2，免疫原性較弱，不易通過免疫動物獲得抗體。[0005]抗體是決定ELISA試劑盒質(zhì)量的關(guān)鍵因素，其親和力、特異性直接關(guān)系到試劑盒的靈敏度、準(zhǔn)確性以及精確性。因此，有必要選用一種簡單有效的方法來獲得高質(zhì)量的抗體。該技術(shù)要解決的關(guān)鍵問題是從噬菌體庫中篩選針對AngII特異性的scFv段。由于AGT 的降解產(chǎn)物有3個，依次為AngI，AngII和Anglll，每種之間只有1_2個氨基酸的差別，因此篩選的抗體要避免與AngII之外的2種片段的交叉反應(yīng)。為此，在對噬菌體進行常規(guī)的正向選擇并富集之后，再進行負向選擇去除能與AngI和AngIII結(jié)合的抗體，此舉可保證最后所得抗體與這兩個類似物無交叉反應(yīng)或反應(yīng)極弱，對保證試劑盒檢測準(zhǔn)確性至關(guān)重要。[0006]其次，噬菌體庫表達的僅為抗體的scFv片段，不具備傳統(tǒng)抗體的雙價結(jié)合結(jié)構(gòu)， 抗原結(jié)合力較弱。為此，通過將AngII scFv和IgG3上游鉸鏈區(qū)/p53四聚功能域的基因融合，利用P53四聚功能域表達產(chǎn)物將AngII scFv抗體裝配成四聚體，可同時結(jié)合四個抗原表位，且在空間位點上不會相互干擾，由此獲得的抗體可用于制備抗AngII的ELISA試劑品.ο實用新型內(nèi)容[0007]本實用新型的目的是提供一種血管緊張素II酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，包括盒蓋、內(nèi)部的酶標(biāo)板和盒體，其中酶標(biāo)板包括固相載體和包被層，固相載體為設(shè)置有多個微孔的微孔板，包被層附著在所述固相載體的微孔表面，包被層是由AngII和牛血清白蛋白依次涂布在固相載體的微孔表面上形成的復(fù)合層。[0008]優(yōu)選的，上述固相載體為96孔聚苯乙烯試劑板。[0009]優(yōu)選的，上述固相載體為48孔聚苯乙烯試劑板。[0010]優(yōu)選的，上述固相載體為60孔聚苯乙烯試劑板。[0011]本實用新型利用噬菌體抗體展示技術(shù)來篩選獲得高親和力的AngII抗體，然后將其應(yīng)用于ELISA試劑盒的制備和生產(chǎn)中。該技術(shù)模擬了機體體液免疫系統(tǒng)的選擇作用，呈現(xiàn)在噬菌體表面的具有不同可變區(qū)的抗體通過固相化抗原進行篩選，進而利用噬菌體對大腸桿菌的感染和蛋白表達快速獲取特異性抗體。[0012]與傳統(tǒng)方法相比，該方法能在短期內(nèi)獲得特異性高、親和力高的抗體，且經(jīng)篩選獲得的噬菌體可以長期保存，在傳代中亦可保持基因結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。抗體是ELISA試劑盒的重要原料，高質(zhì)量的抗體可以保證試劑盒的高品質(zhì)，尤其是試劑盒的特異性、靈敏度等方面會有很大的改善。


[0013]圖1是本實用新型酶標(biāo)板結(jié)構(gòu)示意圖；[0014]圖2是本實用新型酶標(biāo)板剖視圖；[0015]圖3是本實用新型試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖；[0016]圖4是本實用新型AngII的ELISA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。[0017]圖中1-固相載體；2-微孔；3-包被層；4-盒蓋；5-酶標(biāo)板；6_盒體。
具體實施方式
[0018]
以下結(jié)合附圖對本實用新型作進一步描述。[0019]本實用新型提供的血管緊張素II酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒制備的主要的技術(shù)路線如下[0020]1.抗AngII特異性抗體的正向篩選[0021]購買商業(yè)化構(gòu)建好的噬菌體抗體庫，并進行菌液培養(yǎng)進行噬菌體表面呈現(xiàn)。以目的抗原，即AngII對抗體庫進行篩選，先將抗體庫與AngII相互作用，使其充分結(jié)合，接著洗滌除去非特異結(jié)合噬菌體，最后將特異性結(jié)合噬菌體洗脫下來擴增，然后再進入下一輪的淘選。一般需要重復(fù)2-3輪淘選-洗脫-擴增的過程，最終淘選出親和力高的特異結(jié)合 AngII的噬菌體抗體。[0022]2.抗AngII特異性抗體的負向篩選[0023]具體操作與正向篩選相似，不同的是分別在固相載體上包被AngI和Anglll，然后將上一步收獲的表達AngII抗體的噬菌體與固相抗原孵育，洗脫后收集洗脫液，即未與 AngI和AngII結(jié)合的噬菌體，再次擴增獲得與AngI和III無交叉反應(yīng)的抗體展示噬菌體。[0024]3.抗AngII抗體scFv的改造[0025]由于選用的抗體庫為scFv庫，篩選所得抗體只有一個抗原結(jié)合區(qū)，抗原結(jié)合力較弱，需要進一步改造。通過AngII scFv和IgG3上游鉸鏈區(qū)/p53四聚功能域的基因融合由于該基因表達產(chǎn)物能自動組裝成四聚體，相應(yīng)的成為四價抗體，可明顯的提高對抗原的結(jié)合力。將含融合基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中，擴增培養(yǎng)后采用親和層析法純化目的抗體，并通過Western-Blot和ELISA等方法對其親和性和特異性進行鑒定。[0026]4. ELISA試劑盒的研制[0027]本試劑盒應(yīng)用競爭抑制酶聯(lián)免疫分析法測定血清或血漿樣本中AngII的水平。制備過程如下使用96孔聚苯乙烯試劑板(PS)作為固相載體，先將其置于紫外光下輻照2小時，使PS板活化。在試劑板微孔條上預(yù)先包被一定濃度的AngII，4°C過夜，經(jīng)洗板及牛血清白蛋白封閉處理后制成包被好的酶標(biāo)板。檢測時，依次加入待測標(biāo)本及生物素化的AngII 抗體，形成酶標(biāo)板上包被的AngII和標(biāo)本中的AngII競爭結(jié)合抗AngII抗體的局面，再通過親和素化辣根過氧化物酶(HRP)放大信號，以3，3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(Tiffi)及硫酸分別作為底物及終止液，完成血管緊張素II酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒的制備。[0028]ELISA試劑盒較RIA試劑盒有諸多優(yōu)點，通過與Phoenix Pharmaceuticals, Inc. 生產(chǎn)的RIA試劑盒進行比較，可見其操作更簡單、無需特殊的實驗條件且對環(huán)境和操作人員影響小，適用于普通實驗室的應(yīng)用。[0029]ELISA試劑盒與RIA試劑盒比較結(jié)果如表1所示。[0030]ELISA試劑盒RIA試劑盒樣本前處理不需抽提樣本中多肽所需樣本量50ulIml[0031]
權(quán)利要求1.一種血管緊張素II酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，包括盒蓋G)、內(nèi)部的酶標(biāo)板(5)和盒體(6)，其中酶標(biāo)板( 包括固相載體(1)和包被層(3)，其特征在于所述固相載體(1) 為設(shè)置有多個微孔的微孔板O)，所述包被層(3)附著在所述固相載體(1)的微孔表面，所述包被層C3)是由AngII和牛血清白蛋白依次涂布在固相載體(1)的微孔表面上形成的復(fù)I=I te ο
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血管緊張素II酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，其特征是，所述固相載體(1)為96孔聚苯乙烯試劑板。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血管緊張素II酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，其特征是，所述固相載體(1)為48孔聚苯乙烯試劑板。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血管緊張素II酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，其特征是，所述固相載體(1)為60孔聚苯乙烯試劑板。
專利摘要本實用新型提供了一種血管緊張素II酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，包括盒蓋(4)、內(nèi)部的酶標(biāo)板(5)和盒體(6)，其中酶標(biāo)板(5)包括固相載體(1)和包被層(3)，固相載體(1)為設(shè)置有多個微孔的微孔板(2)，包被層(3)附著在所述固相載體(1)的微孔表面，包被層(3)是由AngII和牛血清白蛋白依次涂布在固相載體(1)的微孔表面上形成的復(fù)合層。固相載體(1)為96孔聚苯乙烯試劑板。本實用新型通過噬菌體抗體展示的方法篩選得到與AngII結(jié)合的抗體片段，并通過負向篩選去除與AngI和AngIII交叉結(jié)合的抗體，由此進一步提高了抗體的特異性。
文檔編號G01N33/535GK202305538SQ20112042700
公開日2012年7月4日 申請日期2011年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月18日
發(fā)明者何峰容, 李華淵, 楊娟, 汪景, 章秀波 申請人:武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司