一種檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物dkk1 濃度的酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及腫瘤診斷技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物DKK1濃度的酶聯(lián) 免疫試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 在全世界范圍內(nèi)，肝細(xì)胞癌（HCC)是第六種最常見的惡性疾病和第二種與癌癥相 關(guān)的死因。而我國(guó)的肝細(xì)胞癌高風(fēng)險(xiǎn)人群，包括各種肝炎病毒長(zhǎng)期攜帶者和肝硬化患者，高 達(dá)1. 5億。肝細(xì)胞癌的5年總生存率僅為3-5 %，這個(gè)極低的生存率的部分原因是因?yàn)槿狈?一種及時(shí)和有效的診斷，導(dǎo)致在確診肝細(xì)胞癌時(shí)已經(jīng)有60-70%的患者錯(cuò)過(guò)了最佳治療時(shí) 機(jī)。
[0003] 上海市腫瘤研究所發(fā)現(xiàn)的血清蛋白DKK1，是一個(gè)比現(xiàn)有肝細(xì)胞癌診斷標(biāo)志物甲胎 蛋白AFP性能更優(yōu)秀的標(biāo)志物。該所的研究結(jié)果顯示，DKK1蛋白對(duì)肝細(xì)胞癌總體診斷的 靈敏度為69. 1%，特異度為90. 6% ;特別是對(duì)早期肝細(xì)胞癌和小肝癌的診斷靈敏度分別為 70. 9%和58. 5%，特異性分別為90. 5%和84. 7%。另外，DKK1蛋白能夠彌補(bǔ)AFP對(duì)肝細(xì)胞 癌診斷能力的不足，對(duì)甲胎蛋白陰性肝細(xì)胞癌的診斷靈敏度為70. 4%、特異度為90%。同 時(shí)，DKK1蛋白與AFP聯(lián)合應(yīng)用，可將肝細(xì)胞癌總體診斷率提高至88%。因此迫切需要發(fā)展 一種能夠快速、準(zhǔn)確和相對(duì)廉價(jià)地檢測(cè)DKK1蛋白的方法和產(chǎn)品，以便大規(guī)模地對(duì)肝細(xì)胞癌 進(jìn)行普查，盡早診斷，提高患者的生存率和全民身體健康。
[0004] 對(duì)血清中DKK1濃度的檢測(cè)主要采用針對(duì)DKK1的抗體，利用抗原-抗體的特異性 反應(yīng)，再加上特定的顯色基團(tuán)對(duì)反應(yīng)量進(jìn)行測(cè)量。而不同的顯色基團(tuán)和抗原-抗體反應(yīng)的 載體決定了每種檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)并沒有一種能夠高靈敏、高特異和相對(duì)廉價(jià) 地檢測(cè)血清DKK1蛋白的方法和試劑盒。中國(guó)專利CN101398433公布了一種基于時(shí)間分辨 熒光免疫分析方法的試劑盒，該方法需要用到大多數(shù)醫(yī)院并不配備的時(shí)間分辨熒光免疫分 析儀，并且該方法還需要用到較為昂貴的熒光標(biāo)記物，不利于對(duì)DKK1的大規(guī)模普查。中國(guó) 專利CN102507951公布了一種聯(lián)合檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，由包被有神經(jīng) 元特異性烯醇化物酶（NSE)、細(xì)胞角蛋白片段21-1(CYFRA21-1)和Dkkopf 1(DKK1)單克 隆抗體的多孔板，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)的NSE、CYFRA21-1和DKK1，顯色底物TMB和底物終止 液組成；所述多孔板每孔包被NSE單克隆抗體l-4ug/ml ;每孔包被CYFRA21-1單克隆抗體 l-2ug/ml ;每孔包被DKK1單克隆抗體l-2ug/ml ;NSE、CYFRA21-1、DKK1三種檢測(cè)性抗體按 4:4:2比例加入多孔板孔中，總體積為lOOul ;該發(fā)明公布的試劑盒雖然可以同時(shí)檢測(cè)兩種 或三種腫瘤相關(guān)抗原，但由于分散了每種抗原的檢測(cè)精度及靈敏性，且針對(duì)DKK1抗原的檢 測(cè)僅采用了一種DKK1抗體，因而針對(duì)DKK1抗原的檢測(cè)精度難以滿足對(duì)腫瘤的快速、準(zhǔn)確的 檢測(cè)。此外，國(guó)外雖然有檢測(cè)DKK1蛋白的酶聯(lián)免疫試劑盒（貨號(hào)DKK100, R&D Systems公 司，美國(guó)），但是其價(jià)格昂貴（~Y6000/試劑盒），不利于我國(guó)眾多肝細(xì)胞癌高風(fēng)險(xiǎn)人群對(duì) DKK1大規(guī)模普查的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物DKK1濃度的 酶聯(lián)免疫試劑盒，以匹配自動(dòng)分析系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確和相對(duì)廉價(jià)地用于大規(guī)模臨床檢驗(yàn) 腫瘤標(biāo)志物DKK1。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物DKK1濃度的酶聯(lián)免疫試劑盒的 制備方法及應(yīng)用。
[0007] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0008] -種檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物DKK1濃度的酶聯(lián)免疫試劑盒，由包被有DKK1單克隆抗體1 的多孔板、酶標(biāo)記的DKK1單克隆抗體2、顯色底物和底物終止液組成；其中，DKK1單克隆抗 體1為10C3 ;DKK1單克隆抗體2為6E8 ;此處基于雙抗體夾心法的原理，包被抗體和檢測(cè)抗 體選用不同抗體。本發(fā)明總共測(cè)試了 8個(gè)不同的DKK1單克隆抗體，每?jī)蓛膳鋵?duì)為包被抗體 和檢測(cè)抗體，然后根據(jù)每組配對(duì)的靈敏性和特異性，選定我司與上海銳勁生物技術(shù)有限公 司合作生產(chǎn)的靈敏性和特異性均優(yōu)的10C3和6E8分別為包被抗體和檢測(cè)抗體。
[0009] 其中，所述酶標(biāo)記的DKK1單克隆抗體2的保護(hù)液由pH = 7. 2的10mM磷酸鹽緩沖 液、0. 5%的牛血清白蛋白、0. 01 %的硫柳汞和50%甘油組成。
[0010] 其中，所述酶標(biāo)記的DKK1單克隆抗體2的存貯條件為-20°C，且濃度大于100ug/ ml〇
[0011] 其中，所述酶標(biāo)記的DKK1單克隆抗體2的工作濃度稀釋倍數(shù)為1:100-1:2500,優(yōu) 選 1 :400。
[0012] 其中，所述酶標(biāo)記的DKK1單克隆抗體2所采用的酶為辣根過(guò)氧化物酶（HRP)，但不 僅限于HRP，以滿足優(yōu)異的酶標(biāo)記效果為佳。
[0013] 基于上述結(jié)構(gòu)的酶聯(lián)免疫試劑盒，本發(fā)明又提供了一種用于上述檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物 DKK1濃度的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法，包括如下步驟：①制備包被有DKK1單克隆抗體1 的多孔板：用pH = 7-8的磷酸緩沖液將DKK1單克隆抗體1稀釋，然后將稀釋后的DKK1單克 隆抗體1溶液加入到多孔板的孔中，37°C孵育2小時(shí)；包被后用磷酸鹽緩沖液洗板拍干；用 5%牛血清白蛋白溶液加入到多孔板各孔，37°C封閉1小時(shí)；封閉后用磷酸鹽緩沖液洗板拍 干，將其保存于4°C。②制備酶標(biāo)記的DKK1單克隆抗體2 :將5mg/ml的HRP (辣根過(guò)氧化物 酶）加入0. 2ml的0. 1M高碘酸鈉 NaI04溶液中，室溫避光攪拌20分鐘；將上述溶液對(duì)ImM pH4. 4的醋酸鈉緩沖液4°C透析過(guò)夜；透析后，加20 μ 1 0. 2M pH9. 5的碳酸鹽緩沖液，然后 立即加入10mg DKK1單克隆抗體2,室溫避光攪拌2小時(shí)；加入0. lml新配的4mg/ml NaBH4 溶液，混勻，4°C放置2小時(shí)；將上述溶液對(duì)10mM pH7. 2PBS緩沖液4°C透析過(guò)夜；在攪拌下 逐滴加入等體積飽和硫酸銨，4°C放置1小時(shí)；3000rpm離心半小時(shí)，棄上清；沉淀物用半飽 和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量10mM PH7. 2的PBS中；將上述溶液對(duì)酶標(biāo)抗體保護(hù) 液4°C透析過(guò)夜，lOOOOrpm離心30分鐘去除沉淀后分裝冷凍保存。
[0014] 通過(guò)上述技術(shù)方案，本發(fā)明提供的一種檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物DKK1濃度的酶聯(lián)免疫試 劑盒，采用全國(guó)產(chǎn)化的試劑，包括優(yōu)質(zhì)的DKK1單克隆抗體1及DKK1單克隆抗體2 (兩種抗體 均采購(gòu)至上海銳勁生物技術(shù)有限公司，其中DKK1單克隆抗體1的型號(hào)為10C3，DKK1單克隆 抗體2的型號(hào)為6E8)，制造了與大多數(shù)醫(yī)院現(xiàn)有儀器相匹配的酶聯(lián)免疫試劑盒，實(shí)現(xiàn)了對(duì) DKK1濃度極高靈敏、高特異和相對(duì)廉價(jià)的檢測(cè)，有利于大規(guī)模地對(duì)肝細(xì)胞癌進(jìn)行普查，盡早 診斷，提高我國(guó)全民身體健康。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使 用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。
[0016] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例所公開的酶聯(lián)免疫法檢測(cè)DKK1的原理示意圖；
[0017] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例所公開的本發(fā)明與進(jìn)口試劑盒的相關(guān)性示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完 整地描述。
[0019] 本發(fā)明中的抗體來(lái)源說(shuō)明：作為包被抗體的DKK1單克隆抗體1為采購(gòu)至上海銳勁 生物技術(shù)有限公司的型號(hào)為10C3的抗體，DKK1單克隆抗體2為采購(gòu)至上海銳勁生物技術(shù) 有限公司的型號(hào)為6E8的抗體。
[0020] 實(shí)施例1 :
[0021] 基于圖1所示的酶聯(lián)免疫法檢測(cè)DKK1的原理示意圖，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)腫 瘤標(biāo)志物DKK1濃度的酶聯(lián)免疫試劑盒，由包被有DKK1單克隆抗體1的多孔板、酶標(biāo)記的 DKK1單克隆抗體2、顯色底物（TMB)和底物終止液組成；其中，DKK1單克隆抗體1為10C3 ; DKK1單克隆抗體2為6E8 ;其中，所述酶標(biāo)記的