專利名稱：用于生物材料的澄清試劑和其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于使生物材料透明的澄清試劑(clearing reagent)和其用途。
背景技術：
對于不透明組織的利用光學顯微鏡的內(nèi)部觀察來說，進行使用澄清試劑的預處理(用于使對象透明的澄清處理)。作為澄清試劑和預處理方法的典型的例子，已經(jīng)知道(i)在專利文獻I和非專利文獻I中由Ann-Shyn Chiang描述的Focus Clear(產(chǎn)品名稱)溶液以及(ii)在非專利文獻2中由Hans-Ulrich Dodt等人描述的組織澄清方法。這些都被用于使組織透明以用于對組織中存在的熒光物質(zhì)的觀察。引用列表[專利文獻]美國專利第6472216號(專利授權日2002年10月29日)[非專利文獻]非專利文獻IAnn-Shyn Chiang 等人Insect NMDA receptors mediate juvenile hormonebiosynthesis. PNAS 99(I)，37-42 (2002)。非專利文獻2Hans-Ulrich Dodt 等人Ultramicroscopy !three-dimensional visualizationof neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods 4(4),331-336(2007)。
發(fā)明概述技術問題Focus Clear溶液含有ニ甲亞砜(DMSO)和/或類似物作為用于使對象透明的活性組分，難以在活組織上使用。因此，可以對其應用Focus Clear溶液的對象主要地限于固定的樣品。此外，F(xiàn)ocus Clear溶液具有非常復雜的組成，由此其制備是復雜的，并且其成本是非常高的。此外，雖然提出，F(xiàn)ocus Clear溶液將允許使用熒光蛋白的觀察，但是FocusClear溶液使神經(jīng)組織收縮并且不足以使在深的區(qū)域的神經(jīng)組織的混濁澄清。同吋，Dodt等人的組織澄清方法實質(zhì)上要求在用于使對象透明的步驟中使用大量的有機溶剤。因此，該方法也難以在活組織上使用，并且可以對其應用該方法的對象主要地限于固定的樣品。此外，如上文描述的，因為組織澄清方法實質(zhì)上要求使用大量的有機溶劑，所以該方法破環(huán)幾乎所有的熒光蛋白。因而，使用該方法，難以進行使用熒光蛋白的組織觀察。此外，上文描述的組織澄清方法涉及經(jīng)歷澄清處理的組織的脫水，這是由于它們的組成的本質(zhì)。然而，該過程導致組織的不可逆收縮。
作出本發(fā)明以解決以上的問題，并且本發(fā)明的ー個目的是提供新穎的用于使生物材料透明的澄清劑，所述澄清劑含有作為活性組分的具有較高的生物親和性的組分；以及其用途。問題的解決方案為了解決以上的問題，本發(fā)明的發(fā)明人進行了努力的研究，得到了新的發(fā)現(xiàn)，即在具有優(yōu)良的生物親和性的組分中，尿素具有使生物材料透明的能力?；谶@一點，本發(fā)明的發(fā)明人得出本發(fā)明。具體地，根據(jù)本發(fā)明的用于使生物材料透明的澄清試劑包含作為活性組分的選自由尿素和尿素衍生物組成的組的至少ー種化合物，所述澄清試劑是溶液。本發(fā)明還提供用于進行使生物材料透明的澄清處理的體系，該體系包含上文的 澄清試劑中的任何澄清試劑；以及已經(jīng)被分離的生物材料，澄清試劑已經(jīng)滲透入生物材料中以使生物材料透明。根據(jù)本發(fā)明的用于使生物材料透明的方法包括以下步驟使上文的澄清試劑中的任何澄清試劑滲透入已經(jīng)被分離的生物材料中，目的是使生物材料被制成透明的。根據(jù)本發(fā)明的用于復原已經(jīng)通過澄清處理被制成透明的的生物材料的方法包括以下步驟使平衡鹽溶液滲透入已經(jīng)根據(jù)上文的方法被制成透明的的生物材料中，目的是使生物材料恢復至生物材料在澄清處理之前具有的狀態(tài)。本發(fā)明還提供用于進行使生物材料透明的澄清處理的試劑盒，該試劑盒包括上文的澄清試劑中的任何澄清試劑。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供新穎的用于使生物材料透明的澄清試劑，該澄清試劑含有作為活性組分的具有較高的生物親和性的組分；以及其用途。附圖簡述圖I圖I關于本發(fā)明的實施例，是示出了用根據(jù)本發(fā)明的用于使生物材料透明的澄清試劑處理的小鼠海馬體的視圖。圖2圖2關于本發(fā)明的另ー個實施例，是示出了用根據(jù)本發(fā)明的用于使生物材料透明的澄清試劑處理的小鼠海馬體的視圖。圖3圖3關于本發(fā)明的又另ー個實施例，是示出了用根據(jù)本發(fā)明的用于使生物材料透明的澄清試劑處理的整個小鼠大腦的視圖。圖4圖4關于本發(fā)明的還又另一個實施例，是圖示了(i)根據(jù)本發(fā)明的用于使生物材料透明的澄清試劑和(ii)用澄清試劑處理的生物材料的溶脹之間的關系的圖。圖5圖5關于本發(fā)明的又一個實施例，是示出了用根據(jù)本發(fā)明的用于使生物材料透明的澄清試劑處理的整個小鼠大腦的視圖。圖6
圖6關于本發(fā)明的還又ー個實施例，是示出了已經(jīng)用根據(jù)本發(fā)明的用于使生物材料透明的澄清試劑處理的小鼠腦切片的透光度測量的結果的圖。圖7圖7關于本發(fā)明的另外的實施例，是示出了用根據(jù)本發(fā)明的用于使生物材料透明的澄清試劑處理的小鼠胎兒的視圖。圖8圖8關于本發(fā)明的又另外的實施例，是示出了對用根據(jù)本發(fā)明的用于使生物材料透明的澄清試劑處理的小鼠海馬體中的神經(jīng)祖細胞的觀察的結果的視圖。 圖9圖9是用于在用根據(jù)本發(fā)明的用于使生物材料透明的澄清試劑或用常規(guī)的技術(BABB法)處理的小鼠大腦樣品之間的比較的視圖。

圖10圖10是用于在具有在其中表達的各種熒光蛋白的希拉細胞的結果之間的比較的視圖，希拉細胞已經(jīng)用根據(jù)本發(fā)明的用于使生物材料透明的澄清試劑或用常規(guī)的技術(BABB法)處理。圖11圖11關于本發(fā)明的還又另外的實施例，是示出了對具有被移植于其的神經(jīng)祖細胞的大腦皮層的觀察的結果的視圖，大腦皮層用根據(jù)本發(fā)明的用于使生物材料透明的澄清試劑處理。圖12圖12關于本發(fā)明的又另外的實施例，是示出了在⑴在使用根據(jù)本發(fā)明的用于使生物材料透明的澄清試劑的澄清處理之前的生物材料和(ii)在澄清處理之后恢復至它們在澄清處理之前具有的狀態(tài)的生物材料上的免疫染色的結果的視圖。實施方案的描述下文將詳細地描述本發(fā)明的實施方案。(用于使生物材料透明的澄清試劑的活性組分)根據(jù)本發(fā)明的“用于使生物材料透明的澄清試劑”是含有作為用于使生物材料透明的主要活性組分的“尿素”的溶液。根據(jù)本發(fā)明的另ー個方面的“用于使生物材料透明的澄清試劑”是含有作為用于使生物材料透明的主要活性組分的“尿素衍生物”的溶液。尿素衍生物不限于任何具體的類型。具體地，例如，尿素衍生物是各種類型的烷基脲或由以下的式(I)表示的化合物中的任何化合物。注意，由式(I)表示的化合物包括烷基脲的一部分。根據(jù)本發(fā)明的用于使生物材料透明的澄清劑僅需要含有作為活性組分的選自由尿素和尿素衍生物組成的組的至少ー種化合物。在這些中，澄清劑更優(yōu)選地含有尿素。
權利要求
1.一種用于使生物材料透明的澄清試劑，包含 作為活性組分的選自由尿素和尿素衍生物組成的組的至少ー種化合物， 所述澄清試劑是溶液。
2.如權利要求I所述的澄清試劑，其中 尿素作為所述活性組分被包含。
3.如權利要求I或2所述的澄清試劑，其中所述澄清試劑是水溶液。
4.如權利要求I至3中任一項所述的澄清試劑，還包含表面活性剤。
5.如權利要求4所述的澄清試劑，其中 所述表面活性劑是非離子型表面活性剤。
6.如權利要求5所述的澄清試劑，其中 所述非離子型表面活性劑是選自由Triton X(注冊商標)、Tween (注冊商標)和NP-40 (產(chǎn)品名稱)組成的組的至少ー種。
7.如權利要求3至6中任一項所述的澄清試劑，還包含水溶性的大分子化合物。
8.如權利要求7所述的澄清試劑，其中 所述水溶性的大分子化合物是選自由Percoll (注冊商標)、Ficoll (注冊商標)、聚乙ニ醇和聚こ烯吡咯烷酮組成的組的至少ー種。
9.如權利要求8所述的澄清試劑，其中 所述尿素以IM或更大并且不大于8. 5M的濃度被包含，所述表面活性劑以O. 025 (w/v) %或更大并且不大于5(w/v) %的濃度被包含，并且所述水溶性的大分子化合物以2.5(w/v) %或更大并且不大于40 (w/v) %的濃度被包含。
10.如權利要求I至9中任一項所述的澄清試劑，還包含 選自由甘油、羧基こ烯聚合物、羥丙基甲基纖維素、丙ニ醇和聚こニ醇組成的組的至少ー種。
11.如權利要求I至10中任一項所述的澄清試劑，其中 所述澄清試劑使(i)來源于多細胞動物的組織或器官或(ii)不是人類的多細胞動物透明。
12.ー種用于進行使生物材料透明的澄清處理的體系，包含 如權利要求I至10中任一項所述的澄清試劑；以及 已經(jīng)被分離的生物材料， 所述澄清試劑已經(jīng)滲透入所述生物材料中以使所述生物材料透明。
13.一種用于使生物材料透明的方法，包括以下步驟 使如權利要求I至10中任一項所述的澄清試劑滲透入已經(jīng)被分離的生物材料中，目的是使所述生物材料被制成透明的。
14.一種用于復原已經(jīng)通過澄清處理被制成透明的的生物材料的方法，包括以下步驟 使平衡鹽溶液滲透入已經(jīng)根據(jù)如權利要求13所述的方法被制成透明的的生物材料中，目的是使所述生物材料恢復至所述生物材料在所述澄清處理之前具有的狀態(tài)。
15.ー種用于進行使生物材料透明的澄清處理的試劑盒，包括 如權利要求I至10中任一項所述的澄清試劑。
全文摘要
根據(jù)本發(fā)明的用于使生物材料透明的澄清試劑是含有作為活性組分的選自由尿素和尿素衍生物組成的組的至少一種化合物，以提供新穎的用于使生物材料透明的澄清試劑的溶液。
文檔編號G01N33/48GK102859344SQ20118001335
公開日2013年1月2日 申請日期2011年3月11日 優(yōu)先權日2010年3月12日
發(fā)明者宮脅敦史, 濱裕, 黑川裕, 河野弘幸, 阪上朝子 申請人:獨立行政法人理化學研究所