專利名稱：用于在生物分析傳感器應(yīng)用中研究試劑跨雙層膜運(yùn)輸?shù)姆椒ê脱b置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于測量試劑跨雙層膜運(yùn)輸?shù)姆椒ê脱b置。
背景技術(shù)：
跨膜運(yùn)輸以及結(jié)合在膜上的分子例如膜蛋白的影響對于例如研發(fā)新藥物時(shí)的研 究以及在許多其他相關(guān)領(lǐng)域中意義重大。在1985年奧弗頓(Overton)提出分子以與它們的油-水分配系數(shù)相同的相對規(guī) 則滲透細(xì)胞[1]，并且在1943年丹尼利(Danielli)提出連續(xù)的脂雙層相當(dāng)于擴(kuò)散壁壘，決 定跨細(xì)胞膜的被動(dòng)擴(kuò)散速率[2]。然而，隨著制備分隔兩個(gè)液艙的單個(gè)脂雙層的方法的發(fā) 展，在60年代早期出現(xiàn)了第一個(gè)直接研究跨獨(dú)立的脂雙層滲透的方法[3]。雖然這種技術(shù) 很適合于帶電溶質(zhì)的滲透率研究，但當(dāng)今的這種用于非電解質(zhì)的被動(dòng)和主動(dòng)運(yùn)輸(包括水 運(yùn)輸和藥物攝取)的研究的標(biāo)準(zhǔn)方法依賴于懸浮的脂質(zhì)囊(所謂的脂質(zhì)體)的滲透誘發(fā)的 尺寸變化的測量[4]。這種方法是基于當(dāng)滲透誘發(fā)的跨脂質(zhì)膜的水轉(zhuǎn)移導(dǎo)致脂質(zhì)體尺寸變 化時(shí)對散射光的強(qiáng)度差進(jìn)行的動(dòng)態(tài)光散射(DLS)測量，這種變化為脂質(zhì)體先(< 1ms)收 縮，因?yàn)榇藭r(shí)水?dāng)U散出脂質(zhì)體，接下來脂質(zhì)體膨脹，因?yàn)榇藭r(shí)水在溶質(zhì)分子向內(nèi)滲透作用的 驅(qū)動(dòng)下重新進(jìn)入該脂質(zhì)體[5]。盡管已經(jīng)成功地應(yīng)用于許多被動(dòng)和主動(dòng)溶質(zhì)滲透的特性的 研究[6]，但是這種方法受限于脂質(zhì)體尺寸的變化是一種間接效應(yīng)的事實(shí)，這種變化并不一 定與實(shí)際的溶質(zhì)運(yùn)輸有關(guān)。另外，因?yàn)椴粌H脂質(zhì)體尺寸，還有脂質(zhì)體運(yùn)動(dòng)、溶質(zhì)折射率和膜 聚集都對散射光的強(qiáng)度有貢獻(xiàn)，溶質(zhì)轉(zhuǎn)移的這種量化并不總是簡單的[7，8]。從實(shí)用角度 考慮，這種方法還受低信噪比的影響，這意味著通常要求通過多個(gè)數(shù)據(jù)組的平均來解析動(dòng) 力學(xué)曲線(kinetic traces) 0更進(jìn)一步地，因?yàn)槭菍腋〉闹|(zhì)體進(jìn)行測量，所以這種方 法不適合于完全相同的脂質(zhì)體試樣的平行或依次篩選。這轉(zhuǎn)而意味著通常需要大量材料。 除了略有改善的靈敏度以外，對于一種比較不廣泛使用的方法也存在這些限制，在這種方 法中，通過監(jiān)控脂質(zhì)體包封的熒光團(tuán)在脂質(zhì)體收縮和隨之而來的熒光團(tuán)濃度增加時(shí)的自猝 滅的變化來記錄滲透誘發(fā)的尺寸波動(dòng)[9]。可以對多個(gè)識(shí)別事件或依次或同時(shí)地進(jìn)行篩選 是基于表面的生物分析傳感技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)之一，在這種技術(shù)中，將完全相同的一組固定 在表面的探針分子以自動(dòng)的方式暴露在一系列不同的化合物中。這些傳感器在生命科學(xué)中 的重要性逐漸突顯的另外一個(gè)原因是由于這些傳感器能夠與微流體處理(micro-fluidic handling)結(jié)合[10]，這使得它們適用于小試樣體積并因此非常適于測量稀少和不富余的 物質(zhì)。表面等離子體共振儀(SPR)是當(dāng)今主導(dǎo)的基于表面的生物分析傳感器。它基于在平 面金屬(通常為金)基底上橫向傳播的表面等離子的激發(fā)，其中sra激發(fā)的條件對例如由 與所述表面非常接近(通常為幾百個(gè)納米)的區(qū)域內(nèi)的生物分子結(jié)合誘發(fā)的界面折射率 Δ η胃胃的變化是極度敏感的。因此，通過將探針分子固定在所述表面上，可通過良好近似于 與八1!^5成比例的響應(yīng)來實(shí)時(shí)監(jiān)控固定的探針與靶物的結(jié)合[11，12]。其他公知的研究跨膜運(yùn)輸?shù)氖侄伟ㄈ芤褐械闹|(zhì)體。在脂質(zhì)體膜上結(jié)合著例如
4感興趣的膜蛋白，采用涉及例如熒光和/或放射性測量的方法研究由所述膜蛋白介導(dǎo)的試 劑的跨膜運(yùn)輸。US2004/0033624披露了一種膜受體試劑和測試裝置。脂質(zhì)體束縛在具有錨基團(tuán) (anchor groups)的表面上。該表面包含束縛在該表面上的試劑配體。該配體能夠可逆地 與脂質(zhì)體膜中的受體結(jié)合。脂質(zhì)體中的膜蛋白與能夠被表面釋放的能量激發(fā)的分子結(jié)合并 因此而產(chǎn)生可檢測的信號。脂質(zhì)體膜中的膜蛋白與表面上的試劑配體的結(jié)合通常將脂質(zhì)體 拉向所述表面。與所述膜蛋白具有親和力的測試分子將競爭性地與膜蛋白結(jié)合并且一定程 度上取代所述表面上的試劑配體。這將導(dǎo)致膜蛋白從所述表面脫落并且在脂質(zhì)體膜中重新 分布，而脂質(zhì)體仍然固定于所述表面。從所述表面至所述膜蛋白的平均距離將會(huì)更大，因而 它們從所述表面獲得的能量較少，因?yàn)閺乃霰砻孓D(zhuǎn)移的能量與距離有關(guān)。這可以被檢測 到。為實(shí)現(xiàn)上述目的，在美國專利申請2004/0033624中的方法要求某種標(biāo)記物例如熒光 團(tuán)。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，在用于膜蛋白介導(dǎo)的跨膜運(yùn)輸?shù)臏y量的分析方法中，存在改進(jìn)膜 蛋白的必需用量的空間。通常，提純大量的膜蛋白是困難且昂貴的。在現(xiàn)有技術(shù)中還存在改進(jìn)空間，因?yàn)樵谠S多分析方法中必須使用標(biāo)記物。標(biāo)記并 不總是能夠進(jìn)行的，因?yàn)樗赡芨淖兎治鑫?受體的結(jié)構(gòu)和功能并且干擾待研究的分子間 相互作用。另外熒光性標(biāo)記物是疏水性的，這可能引起非特異性的背底結(jié)合。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是為了解決用于測量跨膜運(yùn)輸?shù)墓治龇椒ê脱b置中的至 少部分問題，以及為了提供一種改進(jìn)的方法和裝置，減輕現(xiàn)有技術(shù)中的至少部分問題。進(jìn)一 步地，經(jīng)仔細(xì)研究本說明書、實(shí)施例和權(quán)利要求書，公知方法和裝置的缺點(diǎn)和本發(fā)明實(shí)施例 的優(yōu)點(diǎn)對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。本文公開了一種如權(quán)利要求書中所限定的方法和裝置，通過引用的方式并入本文中。經(jīng)仔細(xì)研究本說明書、實(shí)施例、權(quán)利要求書和附圖，本發(fā)明的其他方面以及它們的 優(yōu)點(diǎn)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。定義在詳細(xì)描述本發(fā)明的裝置和方法前，可以理解的是，本發(fā)明不限于本文中公開的 那些具體的構(gòu)造、方法步驟、檢測方法、傳導(dǎo)方法、傳感器和材料，因?yàn)檫@些構(gòu)造、方法步驟、 檢測方法、傳導(dǎo)方法、傳感器和材料可以稍有變化。還可以理解的是，本文中所使用的術(shù)語 僅僅是為了描述具體的實(shí)施例，并不用于表示限定，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍將僅由權(quán)利要求和 它們的等同替代物限定。還必須注意的是，本說明書和權(quán)利要求中所使用的單數(shù)詞語“一個(gè)”(“a”，“an”) 和“這個(gè)”、“那個(gè)”(“the”)包括復(fù)數(shù)指示對象，除非在上下文中清楚地另指他意。因此， 例如，含有“一個(gè)分析物”的反應(yīng)混合物的指示對象包括兩種或更多種分析物的混合物。當(dāng)用于本文中的數(shù)值時(shí)，詞語“大約”表示為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉且可接受的精確 度區(qū)間。所述區(qū)間優(yōu)選為士 10%。在描述和要求保護(hù)本發(fā)明的過程中，將根據(jù)本文中所設(shè)的定義使用以下的術(shù)語。
本說明書和權(quán)利要求書使用的術(shù)語“雙層結(jié)構(gòu)”表示原子或分子尤其是脂質(zhì)的雙 層結(jié)構(gòu)。該詞語包括所有幾何形狀的雙層，包含但不限于彎曲的雙層。雙層結(jié)構(gòu)的例子包 括但不限于脂質(zhì)體。本說明書和權(quán)利要求書使用的術(shù)語“檢測體積”表示測量折射率的體積。本說明書和權(quán)利要求書使用的術(shù)語“橢圓偏振光譜傳感器”表示包含橢圓偏振光 譜儀的傳感器。本說明書和權(quán)利要求書使用的術(shù)語“離子載體”表示能夠跨過脂質(zhì)雙層運(yùn)輸離子 的可溶于脂質(zhì)的分子。本說明書和權(quán)利要求書使用的術(shù)語“脂質(zhì)”表示任何可溶于脂肪的分子。脂質(zhì)的 例子包括但不限于脂肪、油、石蠟、膽固醇、固醇、單甘油酯、雙甘油酯和磷脂。本說明書和權(quán)利要求書使用的術(shù)語“脂質(zhì)體”表示含有脂質(zhì)雙層膜的大致球狀的 囊。脂質(zhì)體可以包括水溶液的核。脂質(zhì)體的脂質(zhì)膜可以包括但不限于例如蛋白質(zhì)、糖脂、類 固醇組分和其他與膜結(jié)合的組分。
本說明書和權(quán)利要求書使用的術(shù)語“膜”包括各種類型的膜，例如但不限于雙層 膜。膜可以包括分子，例如但不限于蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。本說明書和權(quán)利要求書使用的術(shù)語“膜蛋白”表示結(jié)合在膜上的蛋白質(zhì)。本說明書和權(quán)利要求書使用的術(shù)語“傳感器”表示采用一種類型的能量、某種信號 并且將其轉(zhuǎn)化為用于信息傳送的示數(shù)的換能器。本說明書和權(quán)利要求書使用的術(shù)語“間隔子”表示用于將其他分子連在一起以使 被連接的分子之間存在間隔的分子。本說明書和權(quán)利要求書使用的術(shù)語“表面”應(yīng)從廣義上理解。在本發(fā)明中可以使 用表面支撐裝置，結(jié)構(gòu)體可以束縛在該裝置上。本說明書和權(quán)利要求書使用的術(shù)語“表面等離子體共振傳感器”表示利用光對表 面等離子體的激發(fā)的傳感器。本說明書和權(quán)利要求書使用的術(shù)語“束縛”表示物質(zhì)以一種約束(confine)但并 不一定限制(restrict)該物質(zhì)的運(yùn)動(dòng)的方式附著在表面上或?yàn)楸砻娣@。發(fā)明說明根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供了一種用于研究試劑跨膜運(yùn)輸?shù)姆椒ǎ摲椒òㄒ?下步驟a)提供至少一個(gè)表面，在所述表面上束縛有雙層結(jié)構(gòu)，所述雙層結(jié)構(gòu)包括檢測體 積，b)所述雙層與待分析的至少一種試劑接觸，以及c)檢測由所述試劑的跨膜運(yùn)輸引起的所述檢測體積中的折射率的變化。所述雙層結(jié)構(gòu)與溶劑接觸。在一個(gè)實(shí)施例中，所述溶劑為水。所述雙層結(jié)構(gòu)包括 至少一個(gè)膜。在一個(gè)實(shí)施例中，至少一種膜蛋白與所述雙層結(jié)構(gòu)結(jié)合。如果希望研究由膜蛋白 介導(dǎo)的跨膜運(yùn)輸，則在一個(gè)實(shí)施例中所述膜蛋白嵌于所述雙層膜中。關(guān)于跨膜運(yùn)輸還可以 研究其他分子的運(yùn)輸。例子包括但不限于分子跨膜的被動(dòng)擴(kuò)散和由例如離子載體和滲透促 進(jìn)劑促進(jìn)的運(yùn)輸。滲透促進(jìn)劑是一種被添加至含有分析物的溶液中并影響跨膜運(yùn)輸?shù)姆肿?。在一個(gè)實(shí)施例中，至少一個(gè)選自由膜蛋白和離子載體組成的組的實(shí)體(entity) 與所述雙層結(jié)構(gòu)結(jié)合。所述表面包含檢測折射率的檢測體積。束縛于所述表面的所述雙層結(jié)構(gòu)全部或部 分地在所述檢測體積內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施例中，所述檢測體積由所述表面和距離所述表面250nm 并平行于所述表面的平面限定。在一個(gè)實(shí)施例中，所述檢測體積的靈敏度隨距所述表面之間的距離呈指數(shù)下降。 在一個(gè)實(shí)施例中，所述檢測體積限定在檢測靈敏度大于在所述表面處的最大靈敏度的
的體積。因此，對于所述檢測體積的靈敏度隨距所述表面之間的距離呈指數(shù)下降的實(shí)施例， 也可以計(jì)算檢測體積。檢測體積的靈敏度隨距所述表面之間的距離呈指數(shù)下降的實(shí)施例的 例子包括但不限于含有表面等離子體共振傳感器的實(shí)施例。所述雙層結(jié)構(gòu)使分析物由于所述雙層不能擴(kuò)散或自由運(yùn)動(dòng)跨過所述雙層結(jié)構(gòu)。但 是，所述分析物仍然可以穿過膜。在一個(gè)實(shí)施例中，所述雙層結(jié)構(gòu)包括至少部分被所述雙層包圍的體積。在一個(gè)實(shí)施例中將待研究的分析物添加至與雙層結(jié)構(gòu)接觸的溶劑中。根據(jù)所述分 析物的特性，其可能轉(zhuǎn)移得很緩慢或幾乎完全不能跨過所述雙層膜。對于一些分析物而言， 所述分析物可以以更快的速率轉(zhuǎn)移跨過所述雙層膜。分析物的跨膜運(yùn)輸取決于所述分析物 的性能和所述雙層中的分子。在一個(gè)實(shí)施例中，在所述雙層結(jié)構(gòu)上結(jié)合著至少一個(gè)待研究的分子。這種分子的 例子包括但不限于離子載體、整合跨膜蛋白、通過疏水補(bǔ)丁與所述雙層的一側(cè)結(jié)合的蛋白 質(zhì)、通過共價(jià)結(jié)合的烴基鏈?zhǔn)杷越Y(jié)合的主要為親水性的蛋白質(zhì)、具有能夠吸引脂質(zhì)鏈的 疏水袋的主要為親水性的蛋白質(zhì)和靜電結(jié)合的親水性蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供了研究分子促進(jìn)的跨雙層膜運(yùn)輸?shù)目赡苄?。通過測量折射率來測定分 析物跨雙層膜的運(yùn)輸。分析物的例子包括但不限于陽離子、陰離子、藥物分子、有機(jī)分子、無機(jī)分子、受體 配體、蔗糖、DNA、RNA、肽和蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施例中，將分析物添加至與雙層結(jié)構(gòu)接觸的溶劑中并遍布雙層結(jié)構(gòu)中的 雙層的一側(cè)上的體積中。以一定濃度溶解于溶劑中的所述分析物具有一個(gè)折射率。在雙層 結(jié)構(gòu)中的雙層的另一側(cè)上的體積中，分析物的濃度可能是不同的，因而該體積內(nèi)的折射率 不同。通過測量折射率，可以監(jiān)控跨膜運(yùn)輸?；诒砻娴募夹g(shù)的優(yōu)點(diǎn)包括它們可以更好地結(jié)合微流體裝置、它們可以全部自動(dòng) 化并且測量需要的試樣體積較小。在一個(gè)實(shí)施例中，傳感器采用測量非常接近表面處的折射率的變化的技術(shù)。在一 個(gè)實(shí)施例中，傳感器具有測量離表面0-250nm的距離內(nèi)的折射率的變化的能力。在一個(gè)實(shí)施例中，所述方法包括使用選自由表面等離子體共振傳感器、橢圓偏振 光譜傳感器和光學(xué)波導(dǎo)激光光譜傳感器組成的組的傳感器測量折射率的變化。在一個(gè)實(shí)施例中，所述雙層結(jié)構(gòu)包括至少一個(gè)脂質(zhì)體。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述雙 層結(jié)構(gòu)包括至少一層脂質(zhì)體。在又另一個(gè)實(shí)施例中，所述雙層結(jié)構(gòu)為一層被束縛的脂質(zhì)體。 在另一個(gè)實(shí)施例中，所述雙層結(jié)構(gòu)包括至少兩層脂質(zhì)體。在又另一個(gè)實(shí)施例中，所述雙層結(jié)構(gòu)為束縛于表面的大量脂質(zhì)體。在一個(gè)實(shí)施例中，所述脂質(zhì)體通過間隔子分子被束縛于表面上。在一個(gè)存在多層 脂質(zhì)體的實(shí)施例中，存在至少一個(gè)間隔子將一層中的脂質(zhì)體束縛至相鄰層中的脂質(zhì)體上。在一個(gè)實(shí)施例中，所述方法包括測量由雙層結(jié)構(gòu)包圍的體積中的折射率。在一個(gè)實(shí)施例中，所述方法包括測量被束縛于所述表面的脂質(zhì)體包圍的體積中的 折射率。在一個(gè)實(shí)施例中，所述方法包括測量被至少一個(gè)束縛于所述表面的脂質(zhì)體包圍的 體積中的折射率。在一個(gè)實(shí)施例中，所述雙層結(jié)構(gòu)包圍所述檢測體積的第一體積，其中沒有被雙層 結(jié)構(gòu)包圍但是在所述檢測體積內(nèi)的體積為第二體積，并且其中為了測量所述第一體積的折 射率，優(yōu)化所述第一和第二體積之間的比值。當(dāng)希望測量所述第一體積的折射率時(shí)，相比于 所述第二體積，所述第一體積應(yīng)當(dāng)盡可能大。大的第一體積將產(chǎn)生較高的靈敏度。所述第 一體積和所述第二體積之間的合適的比值的例子包括但不限于0. 001,0. 01,0. 1、1和10。 本發(fā)明也包括較高的比值例如20、50、100、500和1000?？傊景l(fā)明研究細(xì)胞膜滲透的方法有利地允許直接測量不帶電荷和帶電荷的溶 質(zhì)跨過生物膜的轉(zhuǎn)移速率。所述方法以分析由依賴于滲透的脂質(zhì)體內(nèi)部溶質(zhì)濃度的變化引 起的折射率隨時(shí)間的變化為基礎(chǔ)，所述脂質(zhì)體被約束于伴隨著例如表面等離子體共振活性 傳感器表面的瞬逝場。在本發(fā)明的第二方面中，提供了一種裝置，該裝置包括a)至少一個(gè)表面，b)至少一個(gè)束縛于所述表面的雙層結(jié)構(gòu)，以及c)至少一個(gè)能夠檢測出檢測體積中的折射率的變化的傳感器，其中所述雙層結(jié)構(gòu) 包圍所述檢測體積的第一體積，其中沒有被所述雙層結(jié)構(gòu)包圍但在所述檢測體積內(nèi)的體積 為第二體積，并且其中所述第一體積和第二體積之間的比值為約0.001以上。在可選的實(shí)施例中，所述第一體積和所述第二體積之間的比值為約0.001以上， 優(yōu)選約0.01以上，更優(yōu)選約0. 1以上，甚至更優(yōu)選約1以上，并且最優(yōu)選約10以上。高的 比值是有利的，因?yàn)樗沟盟龅谝惑w積中的折射率測量具有更好的靈敏度。本發(fā)明的一 個(gè)優(yōu)點(diǎn)是通過提供高的比值可以提高靈敏度和準(zhǔn)確性。在一個(gè)實(shí)施例中，所述雙層結(jié)構(gòu)包括至少一個(gè)束縛于所述表面的脂質(zhì)體。在另一 個(gè)實(shí)施例中，所述雙層結(jié)構(gòu)包括大量束縛于所述表面的脂質(zhì)體。在一個(gè)實(shí)施例中，至少一個(gè)脂質(zhì)體通過至少一個(gè)間隔子束縛于所述表面。間隔子 的例子包括但不限于聚合物、核酸、DNA、His-tag、附著于與表面共價(jià)結(jié)合的親和素上的生 物素化的脂質(zhì)和疏水改性的葡聚糖。還可以使用上述提到的間隔子的任意組合。在一個(gè)實(shí)施例中，至少一個(gè)間隔子為聚合物。在另一個(gè)實(shí)施例中，至少一個(gè)間隔子 為His-tag。在又一個(gè)實(shí)施例中，同時(shí)存在聚合物間隔子和His-tag間隔子。在一個(gè)實(shí)施例中，所述雙層結(jié)構(gòu)和所述表面之間的距離小于約250nm。在一個(gè)實(shí)施例中，測量所述檢測體積中的折射率的傳感器選自由表面等離子體共 振傳感器、橢圓偏振光譜傳感器和光學(xué)波導(dǎo)激光光譜傳感器組成的組。在一個(gè)實(shí)施例中，所述傳感器利用表面等離子體共振現(xiàn)象。


圖1示出了將中性親和素/生物素DNA (N/B)、0. IM蔗糖(Si)、2mg/ml膽固醇DNA 標(biāo)簽的POPC-脂質(zhì)體(POPC)、0. IM蔗糖(52)、401^蜂毒素、0. IM蔗糖(S3) ,0. IM蔗糖 (S4)、0. IM蔗糖(S5)依次添加至PEG/PEG-生物素功能化的Biacore 傳感器。圖2示出了來自五次蔗糖添加(S1-S5)的響應(yīng)(RU)。插圖示出了圖2的局部放大 圖。圖3示出了作為時(shí)間的函數(shù)的脂質(zhì)體的蔗糖攝取量，這通過從添加S3-S5時(shí)RU的 變化中減去在將蔗糖添加至封閉的脂質(zhì)體時(shí)(S2)RU的變化獲得。圖4a和圖4b示出了脂質(zhì)體對于丙三醇、脲、羥基脲的滲透率。圖5a和圖5b示出了在不同的溫度下丙三醇的釋放和運(yùn)輸速率。圖6a至圖6c示出了當(dāng)置于環(huán)糊精中時(shí)含有膽固醇的脂質(zhì)體的性質(zhì)。圖7示出了碘離子和氯離子的膜運(yùn)輸。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1.蜂毒素及其對膜運(yùn)輸?shù)挠绊懙难芯坎牧虾头椒?-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油_3_膽堿磷酸(POPC)購買自阿凡提極性脂質(zhì)公 司 (Avanti Polar Lipids )。PEG-聚合物(3kDa)、HS-PEG-NHC0-CH2-CH2-0H(HS_PEG)、 HS-PEG-NHCO-CH2CH2-生物素(HS-PEG-生物素)購買自拉普聚合物 有限公司 (Rapp Polymere GmbH)。傳感器芯片購買自ge醫(yī)療集團(tuán) (ge Healthcare )。膜蛋白 分析試劑盒來自LayerLab 。HEPES-2 為 IOmM HEPESU50mM NaCl、pH 為 7. 4。脂質(zhì)體的制備通過首先使用氮?dú)饬鲝腜OPC脂質(zhì)中蒸發(fā)出溶劑三氯甲烷制得脂質(zhì)體。使干燥的 脂質(zhì)在氮?dú)饬髦斜３种辽僖粋€(gè)小時(shí)，然后加入HEPES-2以生成濃度為4mg/ml的P0PC。溶解 的POPC脂質(zhì)經(jīng)渦旋振蕩至少30分鐘以生成多層脂質(zhì)體。使用微型擠出機(jī)和孔尺寸為50nm 的阿凡提極性脂質(zhì)公司⑧的聚碳酸酯膜制備單層脂質(zhì)體。脂質(zhì)體的半徑呈高斯尺寸分布，平 均半徑為36nm。所述脂質(zhì)體在使用前存儲(chǔ)在4°C的氮?dú)庵?2天內(nèi))。生物傳感器表面的功能化將溶于HEPES-2 中的 HS-PEG (200 μ g/ml)和 HS-PEG-生物素(20 μ g/ml)的混合 物(300μ 1)以5μ 1/min的流速注射并覆蓋在Bia<X)re Au傳感器芯片上。然后注入中性 親和素(40 μ g/ml)和生物素-DNA (0.7 μ Μ)的混合物(150 μ 1)并使其與在所述表面處的 HS-PEG-生物素結(jié)合。脂質(zhì)體的束縛以5 μ 1/min的流速注入含有膽固醇-DNA標(biāo)簽(每個(gè)脂質(zhì)體含有3個(gè)DNA標(biāo)簽) 的POPC脂質(zhì)體(2mg/ml，在HEPES-2中)。膽固醇-DNA標(biāo)簽的DNA部分的末端為單鏈的并 且與在所述表面處的生物素-DNA序列互補(bǔ)，使得所述脂質(zhì)體能夠束縛于所述傳感器表面。與所述脂質(zhì)體結(jié)合的蜂毒素
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在POPC脂質(zhì)體的束縛完成后，直接在Biae()re 儀器中測量蜂毒素的可逆結(jié)合。 依次注入在HEPES-2中濃度為0. 5-40 μ M的蜂毒素溶液。在注射過程中，所述蜂毒素分子 與脂質(zhì)體結(jié)合，并且在所述注射停止后，運(yùn)行緩沖液(HEPES-2)流過并覆蓋該表面并且蜂 毒素游離出來。在所述游離完成后，注入新的不同濃度的蜂毒素溶液。蜂毒素造成的脂質(zhì)體的破裂在束縛所述pope脂質(zhì)體后，直接在Biaeore 儀器中測量蜂毒素造成的脂質(zhì)體的 破裂。注入溶于HEPES-2中的濃度為360yM(lmg/ml)的蜂毒素，并監(jiān)控當(dāng)脂質(zhì)體破裂時(shí)所 述響應(yīng)(RU)的下降。蜂毒素介導(dǎo)的蔗糖的攝取在束縛中性親和素/生物素-DNA后，依次進(jìn)行以下注射0. IM蔗糖、2mg/ml膽固 醇-DNA標(biāo)簽的POPC-脂質(zhì)體、0. IM蔗糖、40 μ M蜂毒素、0. IM蔗糖、0. IM蔗糖、0. IM蔗糖。 所有試樣都溶于HEPES-2中。結(jié)果脂質(zhì)體的束縛存在脂質(zhì)體與生物傳感器表面的結(jié)合。通過使用EDC/NHS將表面的羧基激活 以進(jìn)行酰胺結(jié)合。然后，加入PLL-PEG/PLL-PEG-生物素(5 1)、中性親和素/生物 素-DNA(1 1)和膽固醇DNA標(biāo)簽的POPC脂質(zhì)體。所述雙層結(jié)構(gòu)包圍所述檢測體積的第一體積，而沒有被所述雙層結(jié)構(gòu)包圍但是在 所述檢測體積內(nèi)的體積為第二體積。在這個(gè)具體的例子中所述第一和第二體積之間的比值 約為0. 1。蜂毒素的結(jié)合和孔的形成在Biaeore 儀器中將不同濃度的蜂毒素溶液(ο. 50-40 μ Μ)以5 μ 1/min注 射并覆蓋到被結(jié)合的脂質(zhì)體上。將作為時(shí)間函數(shù)的響應(yīng)(Ru)的變化擬合為RU = RVRU1* (1-exp ("t/ τ ) +RU2* (l_exp (_t/ τ 2))。但是，在注射 0. 5 μ M 蜂毒素的過程中 RU 的變化可以僅用一個(gè)指數(shù)表示(即RU2 = 0)。已知高濃度的蜂毒素可以使細(xì)胞和脂質(zhì)體破 裂。蜂毒素的非特異性結(jié)合(即與不含脂質(zhì)體的生物傳感器表面的結(jié)合)少，小于蜂毒素與 脂質(zhì)體膜表面結(jié)合的5% (數(shù)據(jù)未示出)。將實(shí)測的速率常數(shù)Ic1Gi1 = 1/ τ J和響應(yīng)(RU1) 作為在本體溶液中的蜂毒素濃度函數(shù)來研究。脂質(zhì)體膜表面上蜂毒素的微觀吸 附速率(microscopic on-rate) (k+1)和解離速率(off-rate) (Ie1)通過將數(shù)據(jù)擬合為Ii1 = [Μθ1]β^+1+^來獲得，其中得到= 0. 032s"1且k+1 = 3684Μ_ν。幅值RU1也通過微觀速 率常數(shù)確定，RU1 = RUmax* (k+1/(、+、))。當(dāng)采用 = 0. 032、且 k+1 = 3684M-1s"1 (通過 將h擬合成[Mel]B的函數(shù)得到的)時(shí)，RU1作為[Mel]B的函數(shù)擬合良好。來自脂質(zhì)體的結(jié)合的響應(yīng)(RU)與來自蜂毒素的結(jié)合的響應(yīng)的比較提供了與 每個(gè)脂質(zhì)體結(jié)合的蜂毒素分子的數(shù)量。已知α-螺旋蜂毒素分子以平行的方向與膜結(jié) 合，并且蜂毒素分子占據(jù)的脂質(zhì)體膜的面積為大約210人2。脂質(zhì)體外膜的表面積為大約 1.63*106 A2 (脂質(zhì)體半徑 360人)。因此對于每個(gè)[Mei]B可以計(jì)算在脂質(zhì)體外膜處的 蜂毒素的濃度([Mel]aM.)以及蜂毒素分子所覆蓋的脂質(zhì)體表面的分率(FaM.)。在蜂毒素濃度為2、4、8和40 μ M的本體溶液中，蜂毒素與脂質(zhì)體的結(jié)合是雙階段的。已知在膜表面處的蜂毒素達(dá)到閾值濃度時(shí)誘發(fā)孔的形成。如果形成了孔，則本體溶液 中脂質(zhì)體外部的蜂毒素分子應(yīng)該能夠跨過脂質(zhì)體膜并且與脂質(zhì)體的內(nèi)膜表面結(jié)合。因此 認(rèn)為較慢的動(dòng)力學(xué)階段代表蜂毒素與內(nèi)膜結(jié)合。發(fā)現(xiàn)實(shí)測到的速率常數(shù)k2線性地依賴于 [Mel]B，這表示通過所述孔轉(zhuǎn)移蜂毒素不是限速步驟(不依賴于[Mel]B)。線性擬合得到k+2 =56M-V1 且 k_2 = 0. 0046s—1。表觀擴(kuò)散系數(shù) k+2 (δθΜ"^"1)的值相比于 k+1 (36841^8^)較 低，可以解釋為蜂毒素分子找到脂質(zhì)體的孔的可能性比找到作為一個(gè)整體的脂質(zhì)體表面的 可能性更低?？讛?shù)/脂質(zhì)體呈高斯分布，并且在低[Mel]aM.下，[Mel]B的上升增加了含有 一個(gè)孔的脂質(zhì)體的數(shù)量。因此，在低[Mel]B下，所述響應(yīng)(RU2)將不僅依賴于[Mel]B，還依 賴于不含任何孔的脂質(zhì)體的分率。在高[Mel]BT，所有脂質(zhì)體含有至少一個(gè)孔，在此情況 下蜂毒素在內(nèi)膜處的表面覆蓋率應(yīng)等于其在外膜處的表面覆蓋率，并且RU2應(yīng)接近于RU2max =冊1*(面積#/面積一。因此，上述結(jié)果表示較慢的動(dòng)力學(xué)階段描述了蜂毒素與內(nèi)膜的結(jié) 合。進(jìn)一步的證明來自于觀測到當(dāng)4、8和40 μ M的注射停止后，RU沒有回到初始值(注射 前)，這可以解釋為，當(dāng)由于蜂毒素自膜表面分離而導(dǎo)致孔消失時(shí)蜂毒素分子被困在了脂質(zhì) 體內(nèi)部。由蜂毒素孔介導(dǎo)的蔗糖攝取在研究例如膜運(yùn)輸體時(shí)，一種用于在生物傳感器表面對跨膜分析物進(jìn)行實(shí)時(shí)和不 含標(biāo)簽的攝取測量的簡單方法很有價(jià)值。這里我們想測試是否可以通過簡單地檢測當(dāng)分析 物蔗糖被攝取時(shí)引起的脂質(zhì)體內(nèi)部溶液的折射率的變化來測量所述分析物穿過蜂毒素孔 的攝取。圖1示出了將中性親和素/生物素DNA (N/B)、0. IM蔗糖(Si)、2mg/ml膽固醇DNA 標(biāo)簽的POPC-脂質(zhì)體(POPC)、0. IM蔗糖(52)、401^蜂毒素、0. IM蔗糖(S3) ,0. IM蔗糖 (S4)、0. IM蔗糖(S5)依次添加至PEG/PEG-生物素功能化的表面。圖2示出了來自五次蔗糖添加(S1-S5)的響應(yīng)(RU)。添加蔗糖改變檢測體積(即 對應(yīng)于傳感器表面上方瞬逝場的體積)中的溶液的折射率，這表現(xiàn)為RU的改變。添加S2 時(shí)比添加Sl時(shí)RU的上升更小對應(yīng)于由表面結(jié)合的脂質(zhì)體引起的瞬逝場可進(jìn)入的體積減 小。蜂毒素的加入在脂質(zhì)體膜中產(chǎn)生孔從而形成被添加的蔗糖分子可進(jìn)入的脂質(zhì)體的內(nèi)部 體積。當(dāng)停止添加蜂毒素時(shí)，蜂毒素從膜表面游離出來，并且含有蜂毒素孔的脂質(zhì)體的數(shù)量 隨時(shí)間減少。圖2示出了當(dāng)孔數(shù)/脂質(zhì)體減少時(shí)添加蔗糖(S3-S5)時(shí)的RU的變化。圖3示出了作為時(shí)間函數(shù)的脂質(zhì)體中的蔗糖攝取，這通過從添加S3-S5時(shí)RU的變 化中減去將蔗糖添加至封閉的脂質(zhì)體(S2)時(shí)RU的變化獲得。從S3至S5所述攝取的幅值 降低，這可以解釋為含有孔的脂質(zhì)體的數(shù)量減少。從S3至S5所述速率也降低，這可以解釋 為每個(gè)脂質(zhì)體的孔數(shù)減少。從圖3中的曲線可知，可以估計(jì)用于蔗糖攝取量的衰減時(shí)間并 且T3 20sec。如果攝取后的脂質(zhì)體內(nèi)的蔗糖的濃度等于[蔗糖]3 = 0.1M，然后 7400 個(gè)蔗糖分子在 20秒內(nèi)跨過膜。表2示出了在[Mel]B = 40 μ M時(shí)RU2/RU2max為0. 85，這與含 有多于一個(gè)孔/脂質(zhì)體的脂質(zhì)體的數(shù)量相符。響應(yīng)的幅值與可以來自用0. IM蔗糖(分子量 (Mw)為0. 34kDa)填滿脂質(zhì)體的期望值吻合良好?？梢酝ㄟ^固定脂質(zhì)體自身獲得的響應(yīng)(RU =6790)計(jì)算脂質(zhì)體內(nèi)的7400個(gè)蔗糖分子(0. 1M)的期望RU。所述脂質(zhì)體的虬為35800kDa， 這提供了 0. 19RU/kDa。7400 個(gè)蔗糖分子的 Mw 為 7400*0. 342kDa = 2531kDa，這使得 RU = 2531*0. 19 = 480。由于僅 85%的脂質(zhì)體含有孔，那么期望值為480/0. 85 ^ 560RU，這與
11測量到的來自S3注射的響應(yīng)530RU吻合良好。實(shí)施例2軒誦過石開劍_軍麵二酉享、_____絲_割牛_〒5 尺 的方法通過研究非電解質(zhì)丙三醇、脲和羥基脲這些全部與生物相關(guān)的分子來評估基于 SI^R的方法的效率及其與多滲透事件的篩選的相容性。例如，跨儲(chǔ)存脂肪分子的脂肪細(xì)胞膜 運(yùn)輸丙三醇的效率已經(jīng)被認(rèn)為是肥胖癥和II型糖尿病的發(fā)展過程中的重要因素[17]。另 一方面，脲是新陳代謝過程中產(chǎn)生的廢物并且從肝細(xì)胞中運(yùn)出并經(jīng)由尿釋放到體外，而羥 基脲是一種已廣泛用于癌癥化療[18]以及HIV-病毒感染治療[19]的藥物。已經(jīng)證明該 方法能夠應(yīng)用于原位變化以及通過監(jiān)控當(dāng)環(huán)糊精誘發(fā)的脂質(zhì)體的膽固醇含量逐漸減少時(shí) 丙三醇滲透的增加同時(shí)監(jiān)控脂質(zhì)體的滲透率。還示出了探測離子運(yùn)輸?shù)姆椒ǖ南嗳菪浴Ｊ紫雀鶕?jù)實(shí)施例1提供70nm的脂質(zhì)體。圖4a示出了 70nm的脂質(zhì)體的結(jié)合，然后 重復(fù)注射不同濃度的丙三醇、脲、羥基脲的沖量(pulse)(參見插圖)。圖4b示出了清洗步 驟之一的放大，通過該步驟從脂質(zhì)體內(nèi)部釋放出溶質(zhì)(丙三醇)。在圖4b (虛線表示的曲 線)中還示出了不含固定的脂質(zhì)體的完全相同的清洗步驟，顯示了流體交換的時(shí)間常數(shù)比 IOOms更快，足以在時(shí)間上分析這些運(yùn)輸測量。在8至22°C的溫度區(qū)間內(nèi)測量丙三醇的釋 放速率。結(jié)果示于圖5a中。與期望一致，跨脂質(zhì)膜的運(yùn)輸速率隨溫度的上升而增大，并且 阿累尼烏斯圖(Arrhenius plots)顯示ln(l/)和(1/T)之間具有線性相關(guān)性，所產(chǎn)生的被 研究的三種溶質(zhì)(丙三醇、脲和羥基脲)的活化能與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)吻合良好，參見圖5b。在圖4和5中所示的結(jié)果表示所述方法可用于通過溶質(zhì)的釋放而不是攝取來準(zhǔn)確 地確定脂質(zhì)膜的滲透系數(shù)。注意所有的這些數(shù)據(jù)都來自于使用相同的一組固定的脂質(zhì)體的 單一實(shí)驗(yàn)。不同實(shí)驗(yàn)之間的再現(xiàn)性優(yōu)于2%。根據(jù)實(shí)施例1獲得了含有40%的膽固醇的70nm的脂質(zhì)體。圖6a中示出了所述脂 質(zhì)體的結(jié)合，之后重復(fù)注射環(huán)糊精，所述環(huán)糊精從脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙層中除去膽固醇。SPR響 應(yīng)與界面折射率是成比例的，這使得可以量化除去的膽固醇。在注射七次環(huán)糊精后，膽固醇 的含量降低至14%。每次注射環(huán)糊精(圖6a)后注射丙三醇的沖量，這使得可以量化相對于膽固醇含 量的丙三醇運(yùn)輸?shù)臅r(shí)間常數(shù)，所述時(shí)間常數(shù)的范圍從40%膽固醇的7s到14%膽固醇的ls， 參見圖6b。注意可檢測當(dāng)膽固醇含量發(fā)生那么小的變化時(shí)的運(yùn)輸速率的差異。圖6c示出了滲透率的變化(由溶質(zhì)的轉(zhuǎn)移速率和囊面積估計(jì))和響應(yīng)的幅值(與 內(nèi)部體積是成比例的)。與期望一致，所述滲透率相對于膽固醇含量線性降低，而內(nèi)在化 (internalized)的體積非線性增加。后一觀測數(shù)據(jù)反映在膽固醇含量約25%時(shí)所述膜的 結(jié)構(gòu)變化。通過圖3a至3c所示的測量，證實(shí)所述方法使得能夠根據(jù)滲透率量化溶質(zhì)轉(zhuǎn)移，這 可以同時(shí)與膜特性的結(jié)構(gòu)變化相關(guān)聯(lián)。這類信息在關(guān)于例如藥物如何影響細(xì)胞膜的滲透率 的研究中具有高度的相關(guān)性。不帶電荷的溶質(zhì)的被動(dòng)轉(zhuǎn)移和膜蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移都具有高度 的生物學(xué)和藥物學(xué)相關(guān)性。但是，對于像這種普遍適用于任意類型的膜轉(zhuǎn)移反應(yīng)的方法，也 應(yīng)該可以測量離子轉(zhuǎn)運(yùn)(translocation)，這在當(dāng)今通常采用基于膜片鉗的分析方法。圖7 示出了碘離子( IOs)和氯離子( 200s)的膜運(yùn)輸，與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)吻合得非常好。注意脂質(zhì)體中并入了短桿菌肽以保證反離子(K+)的共運(yùn)輸，從而防止靜電跨膜電勢的建立，如果 建立了靜電跨膜電勢，則會(huì)限制無阻礙的陰離子運(yùn)輸。圖7中所示的結(jié)果證實(shí)了所述方法 也適用于帶電溶質(zhì)的時(shí)間解析的膜轉(zhuǎn)運(yùn)反應(yīng)。這一工作自然延伸到對分子和離子通道控制 的運(yùn)輸?shù)难芯浚⑶以谒幬锖Y選的過程中具有高相關(guān)性。如對于丙三醇、脲和羥基脲所描述的那樣，根據(jù)本發(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)了在單一測量 中對多滲透事件的篩選，并且允許待量化的滲透率發(fā)生原位變化，這以從脂質(zhì)雙層中連續(xù) 除去膽固醇為例。一種可選的探測非電解質(zhì)轉(zhuǎn)移的方法依賴于間接測量懸浮的脂質(zhì)體的滲 透誘發(fā)的尺寸變化，相比于上述方法，本發(fā)明方法提高了靈敏度并且降低了所需的試樣量 的數(shù)量級。在圖4至7中所示的結(jié)果中，示出了可以根據(jù)當(dāng)溶質(zhì)釋放而不是攝取時(shí)的脂質(zhì)體 內(nèi)在化的體積的折射率變化確定跨固定在電磁瞬逝場中的脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙層膜的溶質(zhì)運(yùn) 輸(圖4)。還示出了所述膜特性可以原位變化，并且與滲透率的變化相關(guān)聯(lián)(圖5)。在圖 6中，我們證明了根據(jù)當(dāng)溶質(zhì)釋放(或攝取)時(shí)的脂質(zhì)體內(nèi)在化的體積的折射率變化不僅可 以測量不帶電荷的溶質(zhì)還可以測量離子的運(yùn)輸。總之，本發(fā)明肯定了利用這種傳感原理以IOOms的時(shí)間分辨率直接測量非電解質(zhì) 溶質(zhì)的分子跨膜運(yùn)輸?shù)目赡苄?。所述方法?shí)現(xiàn)了對溶質(zhì)跨脂質(zhì)雙層轉(zhuǎn)移的直接的而非間接 的(參考DLS和熒光猝滅方法)測量，而這到目前為止僅能夠通過使用膜片鉗[14]或基于 芯片的替代物[15]用于帶電荷的分子，在此意義上本方法是獨(dú)一無二的。相比于間接的方 法，本發(fā)明還具有基于表面的方法的所有其他優(yōu)點(diǎn)，例如快速依次(或平行)篩選多種溶質(zhì) 以及由效應(yīng)分子的添加引起的脂質(zhì)體滲透率的原位擾動(dòng)。對于受分析的脂質(zhì)體的尺寸也沒 有特別限定，但是基于DLS的方法僅適用于比較大的脂質(zhì)體，因?yàn)橹睆叫∮诩sSOnm的脂質(zhì) 體是基本不可壓縮的(< ) [16]。盡管本發(fā)明中已經(jīng)描述了包括發(fā)明人目前所知道的最佳方式在內(nèi)的優(yōu)選實(shí)施例， 但是可以理解的是，可以進(jìn)行對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言顯而易見的不同的變化和修改 而不偏離本發(fā)明在權(quán)利要求書中所要求保護(hù)的范圍。參考文獻(xiàn)1、E.奧弗頓(E. 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1權(quán)利要求
一種用于研究試劑跨膜運(yùn)輸?shù)姆椒ǎ龇椒òㄒ韵虏襟Ea、提供至少一個(gè)表面，在所述表面上束縛有雙層結(jié)構(gòu)，并且所述雙層結(jié)構(gòu)包含檢測體積，b、所述雙層與至少一種待分析的試劑接觸，以及c、檢測由所述試劑的跨膜運(yùn)輸引起的所述檢測體積中的折射率的變化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括使用至少一個(gè)選自由表面 等離子體共振傳感器、橢圓偏振光譜傳感器和光學(xué)波導(dǎo)激光光譜傳感器組成的組的傳感器 檢測折射率的變化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，至少一個(gè)選自由膜蛋白和離 子載體組成的組的實(shí)體與所述雙層結(jié)構(gòu)結(jié)合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述雙層結(jié)構(gòu)包括至少一個(gè) 脂質(zhì)體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，至少一個(gè)脂質(zhì)體通過間隔子分子束縛在 所述表面上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述雙層結(jié)構(gòu)包括至少兩層 脂質(zhì)體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法包括測量由所述雙 層結(jié)構(gòu)包圍的體積的折射率。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述雙層結(jié)構(gòu)包圍所述檢測 體積的第一體積，沒有被包圍在所述雙層結(jié)構(gòu)中但在所述檢測體積內(nèi)的體積為第二體積， 并且其中為了測量所述第一體積的折射率，優(yōu)化所述第一和第二體積之間的比值。
9.一種裝置，包括a、至少一個(gè)表面，b、至少一個(gè)束縛在所述表面上的雙層結(jié)構(gòu)，以及C、至少一個(gè)能夠檢測出檢測體積中折射率的變化的傳感器，其中所述雙層結(jié)構(gòu)包圍所述檢測體積的第一體積，沒有被包圍在所述雙層結(jié)構(gòu)中但在所述 檢測體積內(nèi)的體積為第二體積，并且其中所述第一體積和第二體積之間的比值為約0. 001 以上。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的裝置，其特征在于，至少一個(gè)選自由膜蛋白和離子載體組成 的組的實(shí)體與所述雙層結(jié)構(gòu)結(jié)合。
11.根據(jù)權(quán)利要求9-10中任意一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述雙層結(jié)構(gòu)包括至少 一個(gè)束縛在所述表面上的脂質(zhì)體。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的裝置，其特征在于，至少一個(gè)脂質(zhì)體通過至少一個(gè)間隔子 束縛在所述表面上。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的裝置，其特征在于，至少一個(gè)間隔子選自由聚合物、核酸、 DNA、His-tag、附著在與所述表面共價(jià)結(jié)合的親和素上的生物素化的脂質(zhì)和疏水改性的葡 聚糖組成的組中的至少一種。
14.根據(jù)權(quán)利要求9-13中任意一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述傳感器具有測量距 所述表面0-250nm的距離內(nèi)的折射率的變化的能力。
15.根據(jù)權(quán)利要求9-14中任意一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述傳感器選自由表面 等離子體共振傳感器、橢圓偏振光譜傳感器和光學(xué)波導(dǎo)激光光譜傳感器組成的組。
16.根據(jù)權(quán)利要求9-15中任意一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述傳感器利用表面等 離子共振現(xiàn)象。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于研究試劑跨膜運(yùn)輸?shù)姆椒?，該方法包括以下步驟a)提供至少一個(gè)具有雙層結(jié)構(gòu)的表面，在所述表面上束縛有所述雙層結(jié)構(gòu)，所述雙層結(jié)構(gòu)包括檢測體積，b)所述雙層與至少一種待分析的試劑接觸，以及c)檢測由所述試劑的跨膜運(yùn)輸引起的檢測體積中的折射率的變化。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種裝置，所述裝置包含a)至少一個(gè)表面，b)至少一個(gè)束縛在所述表面上的雙層結(jié)構(gòu)，和c)至少一個(gè)能夠檢測出檢測體積中折射率的變化的傳感器，其中所述雙層結(jié)構(gòu)包圍所述檢測體積的第一體積，其中沒有被所述雙層結(jié)構(gòu)包圍但是在所述檢測體積內(nèi)的體積為第二體積，而且所述第一體積和第二體積之間的比值為約0.001以上。
文檔編號G01N33/543GK101939647SQ200980104408
公開日2011年1月5日 申請日期2009年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月8日
發(fā)明者塞耶德·塔巴義, 弗雷德里克·赫克, 芒努斯·布蘭登 申請人:拉耶萊布股份公司