變異型α-輔肌動(dòng)蛋白-4的抗體的制作方法
【專利摘要】一種變異型α-輔肌動(dòng)蛋白-4的抗體，所述變異型α-輔肌動(dòng)蛋白-4具有α-輔肌動(dòng)蛋白-4的氨基酸序列的第245位～第263位的區(qū)域的氨基酸殘基的至少一個(gè)置換為其他的氨基酸殘基而成的氨基酸序列；所述抗體識(shí)別該區(qū)域中的置換氨基酸殘基的全部或者一部分。
【專利說明】變異型Ct -輔肌動(dòng)蛋白-4的抗體
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及變異型α-輔肌動(dòng)蛋白-4的抗體，特別涉及α-輔肌動(dòng)蛋白-4蛋白質(zhì)的新型剪接變體的單克隆抗體。
【背景技術(shù)】
[0002]α-輔肌動(dòng)蛋白-4(以下，也稱為ACTN4)為α -輔肌動(dòng)蛋白的一種，在N末端具有球狀的肌動(dòng)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域、在C末端具有結(jié)合有鈣的基序(稱為EF手性結(jié)構(gòu)域(EF handdomain))。另外,ACTN4使用其中央部的桿狀結(jié)構(gòu)域(rod domain)形成二聚體而成為啞鈴狀，還使用兩端的肌動(dòng)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域交聯(lián)肌動(dòng)蛋白成為束狀(非專利文獻(xiàn)I)。哺乳類的α -輔肌動(dòng)蛋白鑒定為輔肌動(dòng)蛋白-1~4的4種，輔肌動(dòng)蛋白-1、-4為非肌肉型，而輔肌動(dòng)蛋白-2和-3為肌肉型(非專利文獻(xiàn)1、2、3、4)。
[0003]ACTN4為涉及肌動(dòng)蛋白束狀化、促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)；確認(rèn)在被認(rèn)為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)亢進(jìn)的細(xì)胞突起處富集。進(jìn)而啟示對(duì)于癌浸潤具有某些積極的貢獻(xiàn)的可能性(非專利文獻(xiàn)2)。
[0004]另外，跳過在家族性局灶性腎小球硬化癥的家系觀察到基因變異的外顯子8并插入目前未知的新型外顯子8’的類型的選擇性剪接變體，在小細(xì)胞肺癌中特異地表達(dá)，在正常組織中確認(rèn)到只在精巢表達(dá)，所以啟示有成為精巢癌抗原的可能性(非專利文獻(xiàn)5)。
[0005]另一方面，根據(jù)組織學(xué)分析，肺癌分類為小細(xì)胞肺癌(稱為SCLC)、和非小細(xì)胞肺癌(稱為非SCLC)兩種。SCLC占原發(fā)性肺癌的20%,由于發(fā)育速度快，多見以伴隨著多臟器轉(zhuǎn)移的發(fā)展型的案例，以“高惡性度”和“預(yù)后不良”而為人所知(非專利文獻(xiàn)5)。
[0006]治療方面，腺癌和扁平上皮癌占其大半的非SCLC與SCLC的治療方法不同。病期稍微延長的SCLC具有不能適用外科療法的特點(diǎn)，非SCLC具有化學(xué)療法的效果低的特點(diǎn)等。因此，可以認(rèn)為在較早病期鑒別出兩者對(duì)于進(jìn)行準(zhǔn)確的治療是重要的。
[0007]另外，非SCLC中所含的大細(xì)胞癌的亞型、大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌(稱為LCNEC)占原發(fā)性肺癌的3%，與SCLC同樣地“預(yù)后不良”。均與其他的肺癌不同，具有高的神經(jīng)內(nèi)分泌性(非專利文獻(xiàn)6)。
[0008]現(xiàn)有的，SCLC和LCNEC被稱為肺原發(fā)高惡性度神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(h i gh_gradeneuroendocrine tumor, HGNT),作為診斷法之一，對(duì)于切除標(biāo)本進(jìn)行神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)記(Chromogranin, Synaptophysin, neural-cell-adhesion-molecule (NCAM))的免疫染色(非專利文獻(xiàn)7)。
[0009]但是，這3個(gè)標(biāo)記的陽性率并不高，偽陽性率高被視為問題。因此，期望開發(fā)在小細(xì)胞肺癌和大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌中具有高的特異性、能夠早期檢測的新的腫瘤標(biāo)記。
[0010]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0011]非專利文獻(xiàn)l:Cell Motil.Cytoskeleton.58，104-111,2004
[0012]非專利文獻(xiàn)2 J.Cell Biol.140，1383-1393，1998
[0013]非專利文獻(xiàn)3:Am.J.Hum.Genet.47，62-71，1990[0014]非專利文獻(xiàn)4 J.Biol.Chem.267,9281-9288，1992
[0015]非專利文獻(xiàn)5 =Oncogene, 23, 5257-5262, 2004
[0016]非專利文獻(xiàn)6:Mod Pathol.19，1358-68，2006
[0017]非專利文獻(xiàn)7:Am J Surg Pathol.31，26-32，2007

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018]發(fā)明要解決的問題
[0019]本發(fā)明目的在于提供:與ACTN4的新型剪接變體蛋白質(zhì)等變異型ACTN4(以下，稱為ACTM-Va)反應(yīng)，而不與組成性表達(dá)的ACTN4 (以下，稱為ACTM-Ub)反應(yīng)的、ACTM-Va特異的單克隆抗體、以及產(chǎn)生該抗體的細(xì)胞株。另外，本發(fā)明的目的在于提供:前述ACTM-Va的檢測方法、以及檢測用試劑等。
[0020]用于解決問題的方案
[0021]本發(fā)明人等，為了解決上述問題而進(jìn)行了深入的研究。并且，使用ACTM-Va或多肽作為抗原，進(jìn)而使用ACTM-Ub或多肽進(jìn)行篩選；接著，用抗原對(duì)抗親和性抗體產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫，能夠成功地得到與ACTM-Va反應(yīng)而不與ACTM-Ub反應(yīng)的抗體即能夠識(shí)別ACTM-Va和ACTM-Ub的單克隆抗體，至此完成本發(fā)明。
[0022]即，本發(fā)明如下。
[0023](I) 一種變異型α -輔肌動(dòng)蛋白-4的抗體，所述變異型α _輔肌動(dòng)蛋白_4具有α -輔肌動(dòng)蛋白-4的氨基酸序列的第245位~第263位的區(qū)域的氨基酸殘基的至少一個(gè)置換為其他的氨基酸殘基而成的氨基酸序列；所述抗體識(shí)別該區(qū)域中的置換氨基酸殘基的全部或者一部分。
[0024](2)根據(jù)⑴所述的抗體，變異型α-輔肌動(dòng)蛋白-4是以編碼輔肌動(dòng)蛋白_4的DNA的外顯子8，為來源的剪接變體。
[0025](3)根據(jù)⑴所述的抗體，置換氨基酸殘基為選自α -輔肌動(dòng)蛋白-4的氨基酸序列的第248位的甘氨酸、第250位的亮氨酸以及第263位的半胱氨酸組成的組至少一個(gè)。
[0026](4)根據(jù)⑴所述的抗體，包含置換氨基酸殘基的氨基酸序列用DIVGTLRPDEKAMTYVSC(序列號(hào) 4)表示。
[0027](5)根據(jù)⑴所述的抗體，抗體為單克隆抗體。
[0028](6)根據(jù)(5)所述的抗體，由接受號(hào)為NITE BP-1140的雜交瘤產(chǎn)生。
[0029](7) 一種能夠與如下抗原決定簇結(jié)合的抗體，所述抗原決定簇能夠與權(quán)利要求5或6所述的抗體結(jié)合。
[0030](8)根據(jù)(5)或(6)所述的抗體，抗體為嵌合抗體、人源化抗體或重組人抗體。
[0031](9)上述⑴~⑶的任一項(xiàng)所述的抗體的片段。
[0032](10)產(chǎn)生上述(5)或(6)所述的抗體的雜交瘤。
[0033](11)接受號(hào)為NITE BP-1140的雜交瘤。
[0034](12) 一種變異型α _輔肌動(dòng)蛋白_4的抗體的制造方法，其包括:
[0035] (a)使用部分肽免疫非人哺乳動(dòng)物的工序，所述部分肽包含α _輔肌動(dòng)蛋白_4的氨基酸序列的第245位~第263位區(qū)域的氨基酸序列、且具有該區(qū)域的氨基酸殘基的至少一個(gè)置換為其他的氨基酸殘基的氨基酸序列；以及[0036](b)由該非人哺乳動(dòng)物提取抗體的工序。
[0037](13) 一種變異型α _輔肌動(dòng)蛋白_4的單克隆抗體的制造方法，其包括:
[0038](a)使用部分肽免疫非人哺乳動(dòng)物的工序，所述部分肽包含α _輔肌動(dòng)蛋白_4的氨基酸序列的第245位~第263位區(qū)域的氨基酸序列、且具有該區(qū)域的氨基酸殘基的至少一個(gè)置換為其他的氨基酸殘基的氨基酸序列；
[0039](b)從前述被免疫的非人哺乳動(dòng)物提取抗體產(chǎn)生細(xì)胞的工序；
[0040](C)使工序(b)中得到的抗體產(chǎn)生細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合的工序；以及
[0041](d)從工序(C)中得到的融合細(xì)胞提取抗體的工序。
[0042](14)根據(jù)(12)或(13)所述的方法，非人哺乳動(dòng)物為導(dǎo)入GANP的非人哺乳動(dòng)物。
[0043](15) 一種變異型α _輔肌動(dòng)蛋白_4的檢測方法，其特征在于，使上述(I)~(9)的任一項(xiàng)所述的抗體或其片段與生物試樣反應(yīng)而檢測變異型α-輔肌動(dòng)蛋白-4。
[0044](16) 一種檢測編碼變異型α -輔肌動(dòng)蛋白_4的基因的方法，所述變異型α _輔肌動(dòng)蛋白-4包含α -輔肌動(dòng)蛋白-4的氨基酸序列的第245位~第263位的區(qū)域的氨基酸殘基的至少一個(gè)置換為其他的氨基酸殘基的氨基酸序列，所述方法使編碼該置換氨基酸序列的多核苷酸的探針或者該多核苷酸的擴(kuò)增用引物與生物試樣反應(yīng)而檢測前述基因。
[0045](17)根據(jù)(16)所 述的方法，編碼變異型α -輔肌動(dòng)蛋白_4的基因是以編碼α -輔肌動(dòng)蛋白-4的DNA的外顯子8，為來源的剪接變體的mRNA。
[0046](18)使用通過上述(15)~(17)的任一項(xiàng)所述的方法得到的檢測結(jié)果檢測腫瘤的方法。
[0047](19)將通過上述(15)~(18)的任一項(xiàng)所述的方法檢測到的結(jié)果作為指標(biāo)評(píng)價(jià)腫瘤的狀態(tài)或者預(yù)后的狀態(tài)的方法。
[0048](20) 一種腫瘤的檢測或診斷用試劑，其包含上述(I)~(9)的任一項(xiàng)所述的抗體或其片段。
[0049](21) 一種腫瘤的檢測或診斷用試劑，其包含編碼如下氨基酸序列的多核苷酸的探針或該多核苷酸的擴(kuò)增用引物，所述氨基酸序列是α-輔肌動(dòng)蛋白-4的氨基酸序列的第245位~第263位的區(qū)域的氨基酸殘基的至少一個(gè)置換為其他的氨基酸殘基而成的。
[0050](22)根據(jù)(18)或(19)所述的方法，腫瘤為肺原發(fā)高惡性度神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。
[0051](23)根據(jù)(20)或(21)所述的試劑，腫瘤為肺原發(fā)高惡性度神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。
[0052](24) 一種抗腫瘤用藥物組合物，其包含阻礙變異型α -輔肌動(dòng)蛋白_4的功能的物質(zhì)，所述變異型α -輔肌動(dòng)蛋白-4具有α -輔肌動(dòng)蛋白-4的氨基酸序列的第245位~第263位的區(qū)域的氨基酸殘基的至少一個(gè)置換為其他的氨基酸殘基的氨基酸序列。
[0053](25)根據(jù)(24)所述的藥物組合物，阻礙變異型α _輔肌動(dòng)蛋白_4的功能的物質(zhì)為(I)~(9)的任一項(xiàng)所述的抗體或其片段、或者編碼變異型α-輔肌動(dòng)蛋白-4的基因的阻礙性核酸。
[0054](26)根據(jù)(24)或(25)所述的藥物組合物，腫瘤為肺原發(fā)高惡性度神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。
[0055]發(fā)明的效果
[0056]通過本發(fā)明，提供變異型ACTN4的抗體，更具體而言，提供ACTM-Va的特異的抗體、以及產(chǎn)生該抗體的細(xì)胞株。另外，通過本發(fā)明，提供特征在于使上述抗體和生物試樣反應(yīng)的檢測ACTM-Va的方法以及用于檢測ACTM-Va的試劑。
[0057]本發(fā)明的與ACTM-Va反應(yīng)的單克隆抗體能夠高靈敏度并特異地檢測組織、細(xì)胞和血液等被檢體中的ACTM-Va，在腫瘤優(yōu)選為癌的診斷中是有用的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0058]圖1為表示免疫方法的概要的圖。
[0059]圖2A為表示來源于克隆“13G9”和“11H2”的純化抗體的特異性確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果的圖。
[0060]圖2B為表示來源于克隆“9B3”、“15H2”和“10E10”的純化抗體的特異性確認(rèn)試驗(yàn) 結(jié)果的圖。
[0061]圖3為表示利用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)進(jìn)行的來源于克隆“ 13G9”、“ 11H2”、“9B3”、“15H2”、“10E10”的單克隆抗體對(duì)于ACTM-Va的特異性確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果的圖。
[0062]需要說明的是，圖中的符號(hào)如下。
[0063]①(帶有圓圈的數(shù)字I):來源于MCF7的提取液
[0064]②(帶有圓圈的數(shù)字2):來源于H69的提取液
[0065]③(帶有圓圈的數(shù)字3):來源于BxPC-3的提取液
[0066]1:ACTN4_Va 抗體(11H2)
[0067]I1:ACTN4_Va 抗體(15H2)
[0068]II1:ACTN4_Va 抗體(10E10)
[0069]IV:ACTN4-Va 抗體(13G9)
[0070]V:ACTN4-Va 抗體(9B3)
[0071]M:尺寸標(biāo)記物
[0072]P:陽性對(duì)照 ACTN4-N 抗體(I3G9)
[0073]圖4為表示利用蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行的使用來源于克隆“15H2”的單克隆抗體的、對(duì)于ACTM-Va基因?qū)爰?xì)胞的特異性確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果的圖。
[0074]圖5為表示利用免疫組化染色進(jìn)行的使用來源于克隆“15H2”的單克隆抗體的、對(duì)于HGNT中的ACTM-Va的診斷適應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果的圖。
[0075]圖6為表示ACTM-Va的蛋白質(zhì)表達(dá)和HGNT、SCLC, LCNEC患者的預(yù)后解析結(jié)果的圖。
[0076]圖7為表示通過SiRNA抑制ACTM-Va的表達(dá)的結(jié)果的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0077]本發(fā)明為變異型α-輔肌動(dòng)蛋白-4的抗體，所述變異型α-輔肌動(dòng)蛋白-4具有α -輔肌動(dòng)蛋白-4的氨基酸序列的第245位~第263位區(qū)域的氨基酸殘基的至少一個(gè)置換為其他的氨基酸殘基的氨基酸序列，本發(fā)明的抗體識(shí)別上述第245位~第263位區(qū)域中置換的氨基酸殘基(置換氨基酸殘基)的全部或一部分。本發(fā)明的一方式中，本發(fā)明的抗體所識(shí)別的變異型α -輔肌動(dòng)蛋白-4是以編碼α -輔肌動(dòng)蛋白-4的DNA的外顯子8，為來源的剪接變體。
[0078]進(jìn)而，本發(fā)明涉及與ACTM-Va反應(yīng)而不與ACTM-Ub反應(yīng)的、識(shí)別ACTM-Va并與其結(jié)合的抗體。
[0079]1.本發(fā)明的抗體
[0080]本發(fā)明的抗體為包含ACTN4分子中的氨基酸殘基被置換的氨基酸序列的變異型ACTN4(蛋白質(zhì)或多肽)的抗體。
[0081 ] 此處，本說明書中，“ α -輔肌動(dòng)蛋白-4 ”、“ ACTN4 ”、“變異型輔肌動(dòng)蛋白_4 ”、“ACTN4-Va”、“剪接變體”、“ACTM-Ub ”等用語，只要沒有特別聲明則包含全長蛋白質(zhì)、部分多肽和部分肽的任意者。因此，例如表達(dá)為“本發(fā)明的抗體識(shí)別ACTN4-Va”的情況下，是指:本發(fā)明的抗體識(shí)別ACTM-Va(例如，ACTN4的剪接變體)的全長蛋白質(zhì)；或者識(shí)別ACTM-Va的部分多肽(例如，包含如下區(qū)域的部分多肽，所述區(qū)域?yàn)橐訟CTN4的外顯子8’為來源的剪接變體的發(fā)生氨基酸置換的區(qū)域)的任意者。
[0082]本發(fā)明優(yōu)選的方式中，本發(fā)明的抗體具有選自以下的(i)~(iii)的至少一個(gè)性質(zhì)。
[0083]⑴滿足為ACTM-Va的抗體且識(shí)別以新插入的外顯子8，為來源的氨基酸序列置換的全部或者任意者的條件。
[0084](ii)上述氨基酸置換為氨基酸序列的第248位的甘氨酸(G:glycine)、第250位的亮氨酸(L:leucine)、或者第263位的半胱氨酸(C:cysteine)。
[0085](iii)抗原的氨基酸序列用DIVGTLRPDEKAMTYVSC(序列號(hào)I)表示。
[0086]氨基酸殘基的置換部位以及置換后的氨基酸殘基為第245位的天門冬氨酸~第263位的絲氨酸為止的氨基酸序列中的至少一個(gè)氨基酸殘基。優(yōu)選為ACTN4的氨基酸序列的第248位的甘氨酸、第250位的亮氨酸以及第263位的半胱氨酸，具有上述一個(gè)或2個(gè)以上的組合的置換氨基酸殘基。
[0087]此處，ACTN4的氨基酸序列表示為序列號(hào)2。序列號(hào)2中，來源于外顯子8的氨基酸序列為第245位的天門冬氨酸~第263位的絲氨酸為止的氨基酸序列(DIVNTARPDEKAIMTYVSS (序列號(hào) 3))。
[0088]因此，本發(fā)明中，變異型ACTN4為第245位的天門冬氨酸~第263位的絲氨酸為止的氨基酸序列中至少一個(gè)氨基酸殘基置換為其他的氨基酸殘基的物質(zhì)。優(yōu)選為，野生型ACTN4的氨基酸序列的第248位的纈氨酸變異為甘氨酸，第250位的丙氨酸變異為亮氨酸，以及第263位的絲氨酸變異為半胱氨酸；或者發(fā)生了上述中任意一個(gè)或2個(gè)變異而成的物質(zhì)。該變異含有通過插入外顯子8’代替外顯子8而產(chǎn)生的變異即剪接變體(非專利文獻(xiàn)5)。成為這樣的變異的氨基酸的置換，在本說明書中也稱為“ACTN4-Va特異的氨基酸序列置換”。
[0089]因此，在本發(fā)明更優(yōu)選的方式中，本發(fā)明的抗體為與下述物質(zhì)特異地結(jié)合的高特異性抗體，所述物質(zhì)為:在ACTM-Va的氨基酸序列中，包含被以新插入的外顯子8’為來源的新型剪接變體部分的氨基酸殘基置換的氨基酸序列的部分片段或全長片段。以下，本說明書中，也將變異型ACTN4的抗體(包含剪接變體的抗體)稱為“抗ACTM-Va抗體”。
[0090]本發(fā)明中，“特異地結(jié)合”或“識(shí)別”是指與變異型ACTN4 (ACTM-Va)例如置換的氨基酸殘基的全部或者一個(gè)(至少一個(gè))結(jié)合(反應(yīng))，而不與沒有變異的ACTM-Ub結(jié)合(不反應(yīng))。本發(fā)明的抗體結(jié)合或識(shí)別的區(qū)域并非只包含置換的氨基酸殘基，只要包含置換的氨基酸殘基也可以包含其他的區(qū)域。即，本發(fā)明的抗體所結(jié)合或識(shí)別的區(qū)域并不排除沒有置換的氨基酸序列區(qū)域。
[0091]確認(rèn)結(jié)合是否特異，可以通過免疫學(xué)的手法例如=ELISA法、蛋白質(zhì)印跡法或免疫組化染色等而確認(rèn)。
[0092]2.抗體的制造
[0093]接著，對(duì)本發(fā)明的抗體的制造方法進(jìn)行說明。
[0094]2-1.抗原的調(diào)制
[0095]ACTM-Va只在小細(xì)胞肺癌患者組織、來源于小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞株或者正常組織的精巢中表達(dá)。另外，目標(biāo)的抗原部位為來源于新型剪接變體中存在的氨基酸序列置換的上述3種氨基酸的任意者。所以，當(dāng)調(diào)制用于得到目標(biāo)的抗體的免疫抗原時(shí)，包含全長序列的來源于組織或細(xì)胞的抗原蛋白質(zhì)作為免疫抗原是不恰當(dāng)?shù)?。所以，需要合成包含進(jìn)行了氨基酸置換的序列的免疫抗原。
[0096]本發(fā)明中，合成ACTM-Va的部分肽并用作免疫抗原，而合成肽是低分子，在該狀態(tài)下即便對(duì)小鼠進(jìn)行免疫也難以得到抗體。因此，使合成肽與載體蛋白質(zhì)通過MBS法形成二硫鍵而制作免疫抗原。
[0097]本發(fā)明中，免疫抗原可以根據(jù)已知的方法而制作(Fmoc法、Kunio Fujiwara.etal., Journal of Immunological Methods,61，217-226(1983))。
[0098]肽的化學(xué)合成可以通過Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法而進(jìn)行。
[0099] 載體蛋白質(zhì)除了BSA(牛血清白蛋白，Bovin serum albumin)之外,可以使用例如，KLH(鑰孔蟲戚血蘭素,Keyhole Limpet Hemocyanin)、0VA(卵清蛋白 Ovalbumin)等。只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，就可以已知的方法制作免疫抗原。
[0100]合成抗原肽的基本的氨基酸序列為ACTM-Va中的部分序列，從該氨基酸序列中任意地選擇連續(xù)的10~50個(gè)、優(yōu)選為10~30個(gè)、進(jìn)而優(yōu)選為15~20個(gè)長度的氨基酸序列。選擇基準(zhǔn)為必須在氨基酸序列中包含至少I個(gè)ACTM-Va特異的氨基酸序列置換。使用這些氨基酸殘基合成肽。
[0101]能夠作為抗原使用的肽優(yōu)選為序列號(hào)2所示的氨基酸序列的第245位~263位區(qū)域的肽；作為包含ACTM-Va特異的氨基酸序列置換的肽，可以使用在上述區(qū)域的肽的氨基酸序列中至少I個(gè)氨基酸殘基置換為其他的氨基酸殘基而成的肽。優(yōu)選使用上述區(qū)域的第248位的纈氨酸、第250位的丙氨酸以及第263位的絲氨酸中的至少一個(gè)置換為其他的氨基酸而成的肽。進(jìn)而，優(yōu)選使用包含基于外顯子8’的插入的置換變異的氨基酸殘基的、ACTM-Va的部分肽(例如DIVGTLRPDEKAMTYVSC(序列號(hào)4))，所述置換變異即序列號(hào)2所示的氨基酸序列的第248位的天冬酰胺變異為甘氨酸(N248G)、第250位的丙氨酸變異為亮氨酸(A250L)、并且第263位的絲氨酸變異為半胱氨酸(S263C)。
[0102]其中，ACTM-Va特異的氨基酸序列置換并非限定于上述N248G、A250L和S263C ;置換后的氨基酸殘基在第248位可以為除了 N和G以外的其他18種氨基酸殘基(A、R、D、C、Q、E、H、1、L、K、Μ、F、P、S、T、W、Y或V)、在第250位可以為除了 A和L以外的其他18種氨基酸殘基0?、隊(duì)0、(:、03、6、!1、1、1(、]\^、？、5、1\胃、￥或￥)、并且在第263位可以為除了 S和 C 以外的其他 18 種氨基酸殘基(A、R、N、D、Q、E、G、H、1、L、K、M、F、P、T、W、Y*V)。
[0103]2-2.多克隆抗體的制造[0104]將如前述制作的部分肽以其自身、或者與載體、稀釋劑一起通過對(duì)非人哺乳動(dòng)物給與而進(jìn)行免疫，并測定抗體效價(jià)。
[0105]對(duì)于免疫的非人哺乳動(dòng)物的種類，沒有特別的限定，可列舉出例如:小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、狗、山羊等，優(yōu)選為小鼠。本發(fā)明優(yōu)選的方式中，為了制作本發(fā)明的抗體，作為免疫的動(dòng)物，也可以使用具有高特異性抗體產(chǎn)生能力的被稱為“GANP (注冊(cè)商標(biāo))”的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物(W02004/040971)。
[0106]GANP(注冊(cè)商標(biāo))轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物是指導(dǎo)入了編碼胚中心結(jié)合核蛋白質(zhì)(Germinal center-associated nuclear protein)的基因的非人哺乳動(dòng)物；是通過將該動(dòng)物用規(guī)定的抗原進(jìn)行免疫而能夠?qū)υ摽乖a(chǎn)生高親和性或者高特異性抗體的動(dòng)物(W000/50611 號(hào)公報(bào)、Sakaguchi N.etal.，J Immunol.2005Aprl5 ；174(8):4485-94.)。
[0107]例如導(dǎo)入GANP的非人哺乳動(dòng)物(例如小鼠)能夠通過上述公報(bào)或Sakaguchi等的文獻(xiàn)所述的方法而制作，或者可以以市售品GANP(注冊(cè)商標(biāo))小鼠(轉(zhuǎn)基因股份有限公司)而得到。
[0108]對(duì)于每I只抗原動(dòng)物的給與量，以總量計(jì)為10~2000 μ g。免疫抗原時(shí)，通常將佐劑和抗原溶液混合，作為佐劑的種類，可列舉出:弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)、氫氧化鋁佐劑等 。免疫主要通過向靜脈內(nèi)、皮下、腹腔內(nèi)、肌肉中、腳掌皮下等注入而進(jìn)行。另外，對(duì)于免疫的間隔，沒有特別的限定，為數(shù)天~數(shù)周間隔、優(yōu)選為2~3周間隔，進(jìn)行I~10次、優(yōu)選為2~5次免疫。
[0109]通過免疫抗體效價(jià)以吸光度水平計(jì)上升至2以上之后，將動(dòng)物放置2~6個(gè)月，優(yōu)選放置4~6個(gè)月，更優(yōu)選放置6個(gè)月，直至抗體效價(jià)以吸光度水平計(jì)降低至0.05~1、優(yōu)選為0.05~0.5、更優(yōu)選為0.05為止。需要說明的是，表示上述吸光度水平的血清的稀釋率為例如27，000倍。
[0110]對(duì)于導(dǎo)入GANP的非人哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫的情況下，不需要放置至吸光度水平降低為止，根據(jù)通常的單克隆抗體制作法的免疫間隔，進(jìn)行至最終免疫即可。
[0111]抗體效價(jià)可以使用從免疫的動(dòng)物采集的血液而調(diào)查。采集的血液優(yōu)選不在取血后低溫下保管而迅速地離心并分離血清?？梢詫⒌玫降难暹M(jìn)行梯度稀釋，用酶免疫測定(ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定，enzyme-linkedimmunosorbentassay)或 EIA(酶免疫分析，enzymeimmunoassay))、放射性免疫測定法(RIA(radioimmunoassay))等測定抗體效價(jià)。當(dāng)用ELISA或EIA測定抗體效價(jià)時(shí)，吸光度可以用分光光度計(jì)進(jìn)行測定。
[0112]測定的結(jié)果，對(duì)于ACTM-Va的抗體效價(jià)高的動(dòng)物實(shí)施最終免疫。但是，關(guān)于抗原的免疫和抗體效價(jià)的測定，并不限定于上述測定法。
[0113]之后，從最終免疫日起數(shù)天后，優(yōu)選3~5天后摘除免疫擔(dān)當(dāng)細(xì)胞(脾臟細(xì)胞等)。另外，當(dāng)向動(dòng)物的腳掌皮下注入抗原時(shí)，最終免疫的次數(shù)為I次，從免疫起7~13天后，優(yōu)選為8~10天后摘除脾臟細(xì)胞等免疫擔(dān)當(dāng)細(xì)胞或所屬淋巴結(jié)。取血的間隔在免疫起I~4周后，優(yōu)選為I~2周后進(jìn)行。
[0114]本發(fā)明中，在取得多克隆抗體的情況下，在表現(xiàn)出上述所希望的抗體效價(jià)之日取血而得到抗血清。需要進(jìn)行抗體的純化時(shí)，可以通過適宜選擇硫酸銨沉淀法、離子交換色譜、凝膠過濾色譜、親和色譜等已知的方法，或者將它們組合而進(jìn)行純化。之后，用ELISA法等測定抗血清中的多克隆抗體的反應(yīng)性。[0115]2-3.ACTM-Va的單克隆抗體的制作
[0116]以下，對(duì)ACTM-Va的單克隆抗體的制作方法進(jìn)行說明，但不限于此。
[0117]作為得到本發(fā)明的單克隆抗體(“抗ACTM-Va抗體”)的方法，首先，將置換有新型剪接變體的氨基酸殘基的氨基酸序列肽對(duì)導(dǎo)入GANP的非人哺乳動(dòng)物等動(dòng)物進(jìn)行免疫，由免疫動(dòng)物采集抗體產(chǎn)生細(xì)胞(例如B細(xì)胞)，使該抗體產(chǎn)生細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合，制作雜交瘤(融合細(xì)胞株)。接著，通過采集由該雜交瘤產(chǎn)生的抗體，能夠得到目標(biāo)的單克隆抗體。
[0118]抗ACTM-Va抗體是被稱為所謂的半抗原抗體，而當(dāng)制作這樣的半抗原抗體時(shí)，半抗原-載體復(fù)合體的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)對(duì)于特異抗體的性能有非常大的影響。
[0119](I)抗體產(chǎn)生細(xì)胞的調(diào)制
[0120]抗體產(chǎn)生細(xì)胞由免疫的非人哺乳動(dòng)物等動(dòng)物的脾臟細(xì)胞等或所屬淋巴結(jié)等調(diào)制。使用導(dǎo)入GANP的非人哺乳動(dòng)物的情況下，能夠與上述同樣地從脾臟細(xì)胞、淋巴結(jié)中采集抗體產(chǎn)生細(xì)胞。淋巴結(jié)可列舉出例如:腹股溝部淋巴結(jié)、縱隔淋巴結(jié)等?？梢圆粚?duì)采集的細(xì)胞群特意進(jìn)行抗體產(chǎn)生細(xì)胞的分離操作，但優(yōu)選從細(xì)胞群中僅分離抗體產(chǎn)生細(xì)胞。另外，調(diào)制抗體產(chǎn)生細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選盡可能預(yù)先去除組織的殘骸、紅血球。紅血球去除的方法使用通常市售的紅血球去除液、或者優(yōu)選采用制作并使用氯化銨和Tris調(diào)制的中性緩沖液并使用的方法。調(diào)制的抗體產(chǎn)生細(xì)胞存在不能在剛調(diào)制后直接地著手下一步操作，以及細(xì)胞的狀態(tài)惡化的情況，所以在調(diào)制后至下一次操作為止花費(fèi)時(shí)間的情況下，優(yōu)選靜置于冰上。
[0121](2)細(xì)胞融合
[0122]細(xì)胞融合是為了使上述的抗體產(chǎn)生細(xì)胞和骨髄腫瘤細(xì)胞(骨髓瘤細(xì)胞)融合而制作邊產(chǎn)生抗體邊半永久地持續(xù)增加的細(xì)胞(雜交瘤)而進(jìn)行的操作。作為與抗體產(chǎn)生細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞，可以使用小鼠等動(dòng)物的通常能夠到手的細(xì)胞株。作為使用的細(xì)胞株，優(yōu)選具有在HAT選擇培養(yǎng)基(包含次黃嘌呤、胸腺嘧啶脫氧核苷、氨基喋呤的培養(yǎng)基)下不能存活而只在與抗體產(chǎn)生細(xì)胞融合的狀態(tài)下能夠存活的性質(zhì)。作為骨髓瘤細(xì)胞，可列舉出例如:P3X63-Ag.8.Ul (P3U1)、P3/NSI/l_Ag4_l (NSI)等。
[0123]細(xì)胞融合在不包含牛胎血清(FCS)等的DMEM、RPMI1640培養(yǎng)基等通常市售的培養(yǎng)基中，將I X IO6~I X IO7個(gè)/mL的脾臟細(xì)胞和/或淋巴結(jié)細(xì)胞與I X IO5~I X IO6個(gè)/mL骨髓瘤細(xì)胞混合(脾臟細(xì)胞和/或淋巴結(jié)細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞比優(yōu)選為5:1)，在細(xì)胞融合促進(jìn)劑存在下進(jìn)行融合。作為細(xì)胞融合促進(jìn)劑，可以使用平均分子量200~20000道爾頓的聚乙二醇。
[0124]還可以使用利用了電刺激(例如電穿孔)的市售的細(xì)胞融合裝置使細(xì)胞融合。進(jìn)而也可以使用仙臺(tái)病毒(Sendai virus)而使細(xì)胞融合。只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，就可以使用公知的細(xì)胞融合方法使上述的抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。
[0125]融合后，用例如含有10~20%(優(yōu)選20%)FCS的RPMI1640培養(yǎng)基等制作的HAT培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞之后，向96孔培養(yǎng)平板的各孔中各播種0.5~3X IO5個(gè)細(xì)胞，在CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0126](3)雜交瘤的建立
[0127]接著，從細(xì)胞融合處理后的細(xì)胞中篩選產(chǎn)生目標(biāo)抗體的雜交瘤。從細(xì)胞融合起10~14天后，如前述，用HAT培養(yǎng)基選擇的細(xì)胞形成菌落。采集該菌落陽性96孔培養(yǎng)平板的各孔的培養(yǎng)上清，確認(rèn)ACTM-Va的抗體效價(jià)。作為確認(rèn)方法，使用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射性免疫測定法(RIA)等進(jìn)行。此時(shí)，由細(xì)胞產(chǎn)生的抗體也包含作為載體蛋白質(zhì)的KLH、BSA的抗體，所以通過測定KLH等的抗體效價(jià)，能夠去除KLH等的抗體效價(jià)高的KLH抗體陽性孔。能夠確認(rèn)產(chǎn)生ACTM-Va抗體的陽性孔之后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至24孔、12孔培養(yǎng)平板中。
[0128]此處，培養(yǎng)基優(yōu)選置換為除去了氨基喋呤的HT培養(yǎng)基(含有次黃嘌呤、胸腺嘧啶脫氧核苷的培養(yǎng)基)。在存在細(xì)胞內(nèi)殘留的氨基喋呤的影響期間，HT培養(yǎng)基用作在補(bǔ)救途徑中持續(xù)供給嘌呤和嘧啶的前體的雜交瘤的恢復(fù)用培養(yǎng)基。在HT培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后，再度確認(rèn)培養(yǎng)上清中的抗體效價(jià)。雜交瘤為融合細(xì)胞所以不穩(wěn)定，抗體產(chǎn)生能力馬上消失的可能性高，所以優(yōu)選進(jìn)行第2次的抗體效價(jià)的確認(rèn)。如前述，本發(fā)明中，需要取得不與ACTM-Ub交叉反應(yīng)而對(duì)于ACTM-Va具有高的特異性的雜交瘤，所以此處重要的是，在培養(yǎng)上清水平利用ELISA、RIA等確認(rèn)與其他的ACTM-Ub的交叉反應(yīng)性。
[0129]為了將最終選擇的孔的細(xì)胞制成為單一的細(xì)胞而進(jìn)行克隆。克隆為例如:將細(xì)胞懸浮液用含有10~20%的FCS (優(yōu)選為20%) RPMI1640培養(yǎng)基等適當(dāng)?shù)叵♂屩?，播種細(xì)胞以使96孔培養(yǎng)平板的各孔中加入0.3~2個(gè)。對(duì)于在96孔培養(yǎng)平板的各孔中加入的細(xì)胞的個(gè)數(shù)，為了使在一個(gè)孔中加入的細(xì)胞為I個(gè)的概率變高，優(yōu)選以在各孔中加入I個(gè)的方式播種細(xì)胞。細(xì)胞播種之后，在7~10天后回收菌落陽性孔的培養(yǎng)上清。此時(shí)，優(yōu)選在3~5天后確認(rèn)單個(gè)菌落。對(duì)于回收的培養(yǎng)上清確認(rèn)抗體效價(jià)。此處，選擇對(duì)于ACTM-Va具有高的特異性并且對(duì)于ACTM-Ub的交叉反應(yīng)性低的克隆。進(jìn)而，使選擇的孔的細(xì)胞增加至一定程度從而建立雜交瘤株?？寺∫部梢愿鶕?jù)需要進(jìn)行多次。
[0130](4)單克隆抗體的調(diào)制
[0131 ] 從建立的雜交瘤株中按照以下的方法純化以及采集ACTM-Va特異的單克隆抗體。即，有:從用抑制了血清的濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)的培養(yǎng)上清中調(diào)制抗體的方法；從用市售的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的培養(yǎng)上清中調(diào)制抗體的方法；向動(dòng)物的腹腔內(nèi)注入雜交瘤并采集腹水，從該腹水中調(diào)制抗體的方法等。培養(yǎng)上清從將細(xì)胞以0.1~4X IO5個(gè)/mL進(jìn)行調(diào)制并培養(yǎng)了 I~2周者中采集。當(dāng)為腹水時(shí)，在與骨髓瘤細(xì)胞的來源哺乳動(dòng)物為同種系動(dòng)物的腹腔內(nèi)給與雜交瘤0.1~I X IO7個(gè)，使雜交瘤大量地增殖。接著，在I~2周后采集腹水。
[0132]作為培養(yǎng)方法，有:使用培養(yǎng)燒瓶的方法、使用旋轉(zhuǎn)燒瓶的方法、使用搖瓶的方法、使用生物反應(yīng)器的方法等。抗體的純化方法有:用蛋白G親和柱或蛋白A親和柱進(jìn)行純化的方法；用ACTM-Va親和柱進(jìn)行純化的方法；從硫酸銨沉淀級(jí)分中用凝膠過濾色譜進(jìn)行純化的方法；用離子交換色譜進(jìn)行純化的方法等，可以適宜選擇這些已知的方法，或者通過組合它們而進(jìn)行純化。需要說明的是，使用蛋白A親和柱純化小鼠的IgG1時(shí)，使用將結(jié)合條件最優(yōu)化的緩沖液等是有效的，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員就可以適宜選擇最優(yōu)條件而進(jìn)行純化。
[0133](5)微生物的保藏
[0134] 產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的細(xì)胞株(雜交瘤)稱為“Anti ACTM-Va MAb (CloneN0.15H2) ”，于2011年8月31日在獨(dú)立行政法人產(chǎn)品評(píng)價(jià)技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)專利微生物保藏中心(NPMD:National Institute of Technology and Evaluation Patent MicroorganismsDepositary)(〒 292-0818 千葉縣木更津市上總鍵足 Kazusa-Kamatari, Kisarazu, Chiba2_5-8NITE Biotechnology 本部，Patent Microorganisms Depositary)進(jìn)行了國際保藏。表示其接受序號(hào)的接受號(hào)(收據(jù)中記載)為NITE BP-11400 NITE ΒΡ-1140為實(shí)施例1中建立的克隆“15Η2”。
[0135](6)單克隆抗體的性質(zhì)
[0136]本發(fā)明的單克隆抗體為與ACTM-Va特異地結(jié)合并表現(xiàn)出高特異性的物質(zhì)。該特異性滿足如下的條件:在蛋白質(zhì)印跡中的ACTM-Va與抗體的反應(yīng)體系中，使用特異地表達(dá)ACTM-Va的來源于人小細(xì)胞肺癌的癌細(xì)胞株Η69的細(xì)胞提取液時(shí)的抗原抗體反應(yīng)體系，與使用作為非表達(dá)株的來源于人胰腺癌的細(xì)胞株BxPC-3的細(xì)胞提取液和來源于人乳癌的細(xì)胞株MCF7的細(xì)胞提取液時(shí)的抗原抗體反應(yīng)體系相比,在目標(biāo)分子量的位置檢測到ACTM-Va的條帶，從而表現(xiàn)出特異性。
[0137]例如，
[0138](i)首先，將包含存在來源于新插入的外顯子8’的氨基酸序列置換的ACTM-Va的、來源于人小細(xì)胞肺癌的癌細(xì)胞株H69的提取液(將其稱為“抗原I”)供于蛋白質(zhì)印跡。同樣地，將包含不存 在來源于新插入的外顯子8’的氨基酸序列置換的ACTM-Ub的、來源于人胰腺癌的細(xì)胞株BxPC-3、來源于人乳癌的細(xì)胞株MCF7的細(xì)胞提取液(將它們分別稱為“抗原2”和“抗原3”)供于蛋白質(zhì)印跡。
[0139](ii)接著，使該抗原的抗體與各自的抗原在同一濃度下反應(yīng)。
[0140]上述(i)的抗原抗體反應(yīng)中的抗原分子(抗原I)，在其氨基酸序列中存在有來源于新插入的外顯子8’的氨基酸序列置換，本發(fā)明的單克隆抗體與包含來源于新插入的外顯子8’的氨基酸序列置換的固相化抗原I特異地結(jié)合。因此，在蛋白質(zhì)印跡中，作為分子量約IOOKDa的蛋白質(zhì)條帶而檢測出來。
[0141]另外,在上述反應(yīng)體系中，固相化抗原為抗原2和抗原3的情況下，由于不具有來源于新插入的外顯子8’的氨基酸序列置換，所以該固相化抗原2和3不能與本發(fā)明的單克隆抗體特異地結(jié)合。因此，在蛋白質(zhì)印跡中，不能作為分子量約IOOKDa的蛋白質(zhì)條帶而檢測出來。
[0142]本發(fā)明的抗體滿足如下的檢測條件:進(jìn)行上述抗原抗體反應(yīng)試驗(yàn)時(shí)，抗原1、2和3的泳動(dòng)量為?ο μ g/泳道的情況下，抗ACTM-Va抗體的檢測濃度至少為10 μ g/ml以下，優(yōu)選為5 μ g/ml以下，更優(yōu)選為2.5 μ g/ml以下，特別優(yōu)選為I μ g/ml以下；對(duì)于抗原I具有極高的特異性。
[0143]或者,也可以通過蛋白質(zhì)印跡來表現(xiàn)本單克隆抗體的特異性，所述蛋白質(zhì)印跡使用來源于導(dǎo)入有ACTM-Va基因的表達(dá)細(xì)胞的抗原。
[0144]其特異性可以如下進(jìn)行檢測。
[0145]在蛋白質(zhì)印跡中的ACTM-Va和抗體的反應(yīng)體系中，實(shí)施了使用來源于如下表達(dá)細(xì)胞的提取液的抗原抗體反應(yīng)體系(稱為反應(yīng)體系I)，所述表達(dá)細(xì)胞為:制作在ACTM-Va的N末端附加有GFP (綠色突光蛋白，green fluorescent protein)的質(zhì)粒載體并將其導(dǎo)入到人腎上皮細(xì)胞株HEK293(稱為HEK293)中而成的表達(dá)細(xì)胞。另一方面，實(shí)施了使用來源于如下表達(dá)細(xì)胞的提取液的抗原抗體反應(yīng)體系(稱為反應(yīng)體系2),所述表達(dá)細(xì)胞為:制作在ACTM-Ub的N末端附加有GFP (green fluorescent protein)的質(zhì)粒載體，并將其導(dǎo)入到HEK293中而成的表達(dá)細(xì)胞。[0146]接著，將反應(yīng)體系I和反應(yīng)體系2進(jìn)行比較，檢測反應(yīng)體系I中目標(biāo)分子量的位置是否有ACTM-Va的條帶出現(xiàn)。
[0147](7)抗體片段
[0148]上述抗體的片段也包含于本發(fā)明的抗體中。此處，本發(fā)明的抗體片段與本發(fā)明的抗體同樣地，為ACTM-Va的抗體，具有識(shí)別來源于新插入的外顯子8’的氨基酸序列置換的全部或者任意者的上述性質(zhì)。
[0149]作為抗體的片段，意味著本發(fā)明的抗體的一部分區(qū)域，可列舉出例如:Fab(抗原結(jié)合片段，antigen - binding fragment)、Fab’、F (ab，)2、Fv、diabody (雙抗體，dibodies)、dsFv、線狀抗體、scFv(single chain Fv)、至少一部分中包含互補(bǔ)決定區(qū)域(complementarity determining region:Q)R)的肽等。上述抗體片段可以通過將本發(fā)明的抗體根據(jù)目的使用各種蛋白質(zhì)分解酶切斷而得到。 [0150]例如，分別地，F(xiàn)ab可以通過將抗體分子用木瓜蛋白酶進(jìn)行處理而得到，F(xiàn) (ab ’)2可以通過將抗體分子用胃蛋白酶進(jìn)行處理而得到。另外，F(xiàn)ab’可以通過將上述F(ab’ )2的鉸鏈區(qū)域的二硫鍵切斷而得到。
[0151 ] scFv的情況下，取得編碼抗體的VH和VL的cDNA，構(gòu)建編碼scFv的DNA。將該DNA插入表達(dá)載體中,將該表達(dá)載體導(dǎo)入至宿主生物而使之表達(dá)，由此能夠制造scFv。
[0152]雙抗體(diabody)的情況下，取得編碼抗體的VH和VL的cDNA，構(gòu)建編碼scFv的DNA并使肽連接體的氨基酸序列的長度為8殘基以下。將該DNA插入表達(dá)載體中，將該表達(dá)載體導(dǎo)入至宿主生物而使之表達(dá)，由此能夠制造diabody。dsFv的情況下,取得編碼抗體的VH和VL的cDNA，構(gòu)建編碼dsFv的DNA。將該DNA插入至表達(dá)載體中，將該表達(dá)載體導(dǎo)入至宿主生物使之表達(dá)，由此能夠制造dsFv。
[0153]包含⑶R的肽的情況下，構(gòu)建編碼抗體的VH和VL的⑶R的DNA。將該DNA插入表達(dá)載體中，將該表達(dá)載體導(dǎo)入至宿主生物使之表達(dá)，由此能夠制造包含CDR的肽。包含CDR的肽也可以通過Fmoc法和tBoc法等化學(xué)合成法而制造。
[0154]即便抗體的氨基酸序列改變，只要能夠與上述變異型ACTN4特異地結(jié)合，這樣的抗體也包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0155](8)基因重組抗體
[0156]作為本發(fā)明的ACTM-Va的抗體優(yōu)選的方式之一，可列舉出基因重組抗體。對(duì)于基因重組抗體沒有限定，但可列舉出例如:嵌合抗體、人源化抗體和重組人抗體等。
[0157]嵌合抗體(即人源嵌合抗體)為將來源于小鼠的抗體的可變區(qū)域與來源于人的恒定區(qū)域連接(接合)而成的抗體(參照 Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.81，6851-6855，(1984)等)；制作嵌合體時(shí)，為了得到這樣連接的抗體，可以通過基因重組技術(shù)構(gòu)建。
[0158]制作人源化抗體時(shí)，可以采用被稱為所謂的⑶R移植(⑶R grafting)的方法。⑶R移植是指從小鼠抗體的可變區(qū)域?qū)⒒パa(bǔ)決定區(qū)域(CDR)移植至人可變區(qū)域，制作框架區(qū)域(FR)來源于人、CDR來源于小鼠的重構(gòu)的可變區(qū)域的方法。接著，將這些人源化的重構(gòu)人可變區(qū)域與人恒定區(qū)域連接。這樣的人源化抗體的制作法在本領(lǐng)域中廣為人知(參照例如:Nature,321,522-525(1986) J.Mol.Biol.，196，901-917(1987)等)。
[0159]重組人抗體(完全人抗體)是通常V區(qū)域的作為抗原結(jié)合部位的超可變區(qū)域(Hyper Variable region)、V區(qū)域的其他部分以及恒定區(qū)域的結(jié)構(gòu)具有與人的抗體相同的結(jié)構(gòu)的抗體。但是，超可變部位也可以來源于其他的動(dòng)物。制作重組人抗體的技術(shù)也是已知的，對(duì)于與人共通的基因序列，確立了通過基因工程的手法制作的方法。重組人抗體可以如下取得，例如:使用具有包含人抗體的H鏈和L鏈的基因的人染色體片段的人抗體產(chǎn)生小鼠的方法(參照 Tomizuka, K.etal., Nature Genetics, (1977) 16,133-143 ；Kuroiwa, Y.et.al.，Nuc.Acids Res.， (1998) 26, 3447-3448 ；Yoshida, H.et.al.，AnimalCell Technology:Basic and Applied Aspects, (1999) 10,69-73(Kitagawa, Y., Matuda,T.and Iijima, S.eds.), Kluwer Academic Publishers ；Tomizuka, K.et.al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, (2000)97, 722-727等)、取得通過人抗體文庫篩選的來源于噬菌體展不的人抗體的方法(參照 Wormstone, 1.M.et.al, Investigative Ophthalmology &Visual Science., (2002)43(7),2301-8；Carmen, S.et.al., Briefings in FunctionalGenomicsandProteomics, (2002)I(2),189-203 ；Siriwardena, D.et.al., Opthalmology,(2002) 109(3) ,427-431 等)。
[0160]另外，本發(fā)明中，可以將本發(fā)明的雜交瘤(例如接受號(hào)NITE BP-1140的雜交瘤)或者由該雜交瘤提取的DNA或RNA等作為原料，根據(jù)上述已知的方法制作嵌合抗體、人源化抗體、重組人抗體。
[0161](9)與本發(fā)明的抗體所結(jié)合的抗原決定簇結(jié)合的抗體
[0162]進(jìn)而，作為本發(fā)明的抗ACTM-Va抗體，也優(yōu)選列舉出例如:與接受號(hào)為NITEBP-1140的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體所結(jié)合(識(shí)別)的部位(例如表位)結(jié)合的抗體。作為表位，可列舉出以下例示的表位。
[0163]本發(fā)明的抗ACTM-Va抗體的表位(抗原決定簇)是作為抗原的ACTM-Va的至少一部分即可，沒有限定，例如，為包含ACTN4的氨基酸序列的第245位~第263位的氨基酸序列的區(qū)域；包含 第248位、第250位以及第263位置換為其他的氨基酸殘基、分別優(yōu)選置換為甘氨酸、亮氨酸、半胱氨酸的氨基酸序列的區(qū)域。這樣的表位的氨基酸序列用DIVGTLRPDEKAMTYVSC(序列號(hào) 4)表示。
[0164]3.檢測方法
[0165]ACTM-Va可以作為癌的臨床標(biāo)記物(腫瘤標(biāo)記物)而利用，所以使本發(fā)明的抗體與生物試樣反應(yīng)，測定生物試樣中的ACTM-Va，由此能夠?qū)⒃摐y定結(jié)果作為指標(biāo)檢測或診斷腫瘤。
[0166]因此，本發(fā)明提供變異型α -輔肌動(dòng)蛋白-4的檢測方法，其特征在于，使本發(fā)明的抗體或其片段與生物試樣反應(yīng)而檢測變異型α -輔肌動(dòng)蛋白-4。
[0167]另外，本發(fā)明提供癌的檢測或診斷方法，其特征在于，使本發(fā)明的抗體與生物試樣反應(yīng)，與ACTM-Va反應(yīng)而不與ACTM-Ub反應(yīng)，從而檢測ACTM-Va。作為檢測對(duì)象的蛋白質(zhì)，可列舉出例如:ACTN4-Va，作為檢測的對(duì)象，可列舉出:ACTN4_Va的全長蛋白質(zhì)、或者ACTM-Va的部分多肽(例如包含下述的氨基酸序列的多肽)。
[0168]DIVGTLRPDEKAMTYVSC(序列號(hào) 4)
[0169]ACTM-Va的測定可以通過通常進(jìn)行的免疫組化染色(稱為IHC:1mmunohistochemical staining)、或者作為半抗原免疫測定法已知的方法的任意方法(例如，ELISA、EIA)等而進(jìn)行，沒有特別的限定。
[0170]對(duì)于癌，沒有特別的限定，可列舉出例如:選自由腦腫瘤、唾液腺癌、食道癌、咽癌、口腔癌、肺癌、胃癌、小腸或十二指腸癌、大腸癌、尿路惡性腫瘤(例如前列腺癌、腎癌、膀胱癌、精巢腫瘤)、肝癌、前列腺癌、乳癌、子宮癌、卵巢癌、甲狀腺癌、膽囊癌、膽道癌、胰癌、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、肉瘤(例如骨肉瘤、肌肉瘤等)以及黑素瘤組成的組至少I種，優(yōu)選為肺原發(fā)高惡性度神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(HGNT)。HGNT包括小細(xì)胞肺癌(SCLC)以及大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌(LCNEC)，可列舉出選自它們中的至少I種。對(duì)于作為檢測對(duì)象的癌的種類，可以為I種，也可以組合2種以上。癌的狀態(tài)為:選自由癌的有無、癌的惡性度、癌的轉(zhuǎn)移的有無以及癌的復(fù)發(fā)的有無組成的組至少一個(gè)。
[0171]特別是，來源于HGNT患者的ACTM-Va中，包含上述序列號(hào)4所示的肽(氨基酸置換而成的肽)的氨基酸序列，所 以與該氨基酸序列特異地結(jié)合的本發(fā)明的抗體，對(duì)于檢測前述的癌特別優(yōu)選。
[0172]從癌患者、疑似癌的患者、或者健康診斷就診者等被檢者采集生物試樣，調(diào)制ACTM-Va測定試樣。作為生物試樣，可列舉出組織、細(xì)胞等。組織優(yōu)選使用采集后調(diào)制成組織切片的組織。
[0173]接著，使前述測定試樣與本發(fā)明的抗體反應(yīng)。ACTM-Va的檢測可以通過通常進(jìn)行的IHC而進(jìn)行。此處，為了方便說明，本發(fā)明的抗體使用來源于小鼠的抗體。
[0174]IHC的測定中，去除切片上的石蠟之后，進(jìn)行內(nèi)源性的過氧化物酶活性的抑制，通過熱處理活化抗原。用2%的豬血清進(jìn)行非特異的蛋白質(zhì)結(jié)合的封閉(blocking)，將第一抗體(primary antibody)(抗ACTM-Va抗體)在4度、進(jìn)行16小時(shí)以上雜交。洗漆第一抗體，用生物素化抗小鼠IgG作為第二抗體在室溫下進(jìn)行I小時(shí)雜交，進(jìn)而在洗滌后用抗生物素蛋白-過氧化物酶標(biāo)記第三抗體使之反應(yīng)，將DAB (稱為3，3’- 二氨基聯(lián)苯胺四氯化氫即3,3’ -Diaminobenzidine, tetrahydrochloride)作為底物進(jìn)行顯色。
[0175]另外，在本發(fā)明的其他的方式中，可以檢測ACTM-Va的mRNA量，由該檢測結(jié)果檢測腫瘤。
[0176]因此，本發(fā)明提供檢測編碼變異型ACTN4的基因的方法，所述變異型ACTN4包含ACTN4的氨基酸序列的第245位~第263位的區(qū)域的氨基酸殘基的至少一個(gè)置換為其他的氨基酸殘基的氨基酸序列。該方法如下:使編碼上述置換氨基酸序列的多核苷酸的探針或者該多核苷酸的擴(kuò)增用引物與生物試樣反應(yīng)而檢測前述基因。作為檢測的基因，優(yōu)選為來源于編碼ACTN4的DNA的外顯子8，的剪接變體的mRNA。
[0177]mRNA的測定可以通過例如=Northern印跡、RT-PCR、實(shí)時(shí)PCR、微列陣(microarray)等進(jìn)行。
[0178]編碼ACTM-Va的基因以具有前述N248G、A250L或S263C、或者它們的組合的置換變異的方式置換序列號(hào)I所示的堿基序列。即，V248G:序列號(hào)I所示的堿基序列的第861~863位的“aac” (Asn的密碼子)置換為“ggc” (Gly的密碼子)；A250L:序列號(hào)I所示的堿基序列的第867~869位的“gcc” (Ala的密碼子)置換為“cug” (Leu的密碼子)；還有S263C:序列號(hào)I所示的堿基序列的第906~908位的“age” (Ser的密碼子)置換為“ugc” (Cys的密碼子)。
[0179]因此，進(jìn)行Northern印跡時(shí)，設(shè)計(jì)并合成與編碼ACTM-Va的基因中包含上述變異部位的核苷酸(來源于外顯子8’的核苷酸)雜交的探針。
[0180]另外，進(jìn)行RT-PCR、實(shí)時(shí)PCR時(shí)，以對(duì)包含上述變異部位的核苷酸(來源于外顯子8’的核苷酸)進(jìn)行擴(kuò)增的方式設(shè)計(jì)引物。
[0181]mRNA的解析中，例如:能夠廣泛(comprehensive)檢測出對(duì)應(yīng)于登錄號(hào)匪—00004924.4所示的ACTN4基因(序列號(hào)I)的剪接變體即基于外顯子8’的插入的堿基的置換。
[0182]并且，關(guān)于ACTN4是否為變異型的判斷、或者是否為腫瘤的判斷，在利用探針的雜交、利用PCR的擴(kuò)增反應(yīng)或者測序的結(jié)果、檢測出目標(biāo)條帶的情況下，或者在得到變異型的堿基序列的情況下，可以判斷ACTN4為變異型。
[0183]此時(shí),優(yōu)選與來源于健康者的mRNA表達(dá)量進(jìn)行比較。例如,將來源于被檢者的試樣中的mRNA表達(dá)量(試驗(yàn)值)、與來源于健康者的被檢試樣中的mRNA的表達(dá)量(對(duì)照值)的比進(jìn)行比較，如果為基準(zhǔn)值以上則判定為癌。
[0184]但是，本發(fā)明的方法中，存在使用來源于多個(gè)被檢者的生物試樣測定ACTM-Va或其mRNA的水平的情況。因此,可以對(duì)于預(yù)先規(guī)定的個(gè)數(shù)的被檢者(初級(jí)總體primarypopulation)，測定上述ACTM-Va或其mRNA量，將得到的測定值作為基本數(shù)據(jù)，將該基本數(shù)據(jù)、與作為檢測對(duì)象的各個(gè)來源于被檢者的生物試樣的ACTM-Va或其mRNA量進(jìn)行比較。
[0185]進(jìn)而，上述測定的被檢者的數(shù)據(jù)為規(guī)定值以上時(shí)，也可以將其引入前述總體值中，對(duì)ACTM-Va或其mRNA量的水平再度進(jìn)行數(shù)據(jù)處理(平均值化等)，增加作為對(duì)象的被檢者(總體)的例數(shù)。通過增加例數(shù)，提高ACTM-Va或其mRNA量的臨界值的精度，根據(jù)情況適宜修正臨界值，由此可以提高癌的檢測或診斷精度。
[0186]進(jìn)而，對(duì)于從患者或健康診斷就診者等被檢者逐個(gè)采集的生物試樣，可以使用本發(fā)明的方法，在實(shí)際上開始治療前等進(jìn)行該被檢者的癌的檢測。即，由該生物試樣采集mRNA并檢查其水平或堿基序列，其檢查結(jié)果為陽性時(shí)或解析到目標(biāo)的堿基序列時(shí)，可以判斷該被檢者為癌的概率(risk)高。
[0187]上述檢測結(jié)果可以作為例如，進(jìn)行癌的確定診斷時(shí)的主要資料或輔助資料。更詳細(xì)而言，進(jìn)行癌的檢查或確定診斷的情況下，可以在上述檢測結(jié)果基礎(chǔ)上，與其他的檢查結(jié)果例如選自活檢、其他的癌標(biāo)記物的水平的至少一個(gè)組合，綜合地進(jìn)行判斷。
[0188] 4.癌的評(píng)價(jià)方法
[0189]本發(fā)明中，可以將由前述3中所示的檢測方法得到的檢測結(jié)果作為指標(biāo)評(píng)價(jià)癌的狀態(tài)。將檢測結(jié)果超過規(guī)定的基準(zhǔn)值的作為ACTM-Va陽性、將規(guī)定的基準(zhǔn)值以下的作為ACTM-Va陰性，為陽性的情況下，可以判斷為具有癌發(fā)病的可能性而評(píng)價(jià)癌的狀態(tài)。規(guī)定的基準(zhǔn)值可以根據(jù)癌的種類而適宜設(shè)定。
[0190]癌的狀態(tài)是指是否罹患癌或腫瘤或者其進(jìn)行程度，可列舉出:有無癌發(fā)病、癌的惡性度、癌有無轉(zhuǎn)移以及癌有無復(fù)發(fā)等。進(jìn)行上述評(píng)價(jià)時(shí)，這些癌的狀態(tài)可以選擇一個(gè)，也可以適宜組合選擇多個(gè)。評(píng)價(jià)癌的有無而判斷是否罹患癌癥。癌的惡性度為表示癌的發(fā)展程度的指標(biāo)；將病期(Stage)分類而進(jìn)行評(píng)價(jià)，也能夠分類為所謂的早期癌、晚期癌并進(jìn)行評(píng)價(jià)。癌的轉(zhuǎn)移通過在遠(yuǎn)離原發(fā)病灶的位置的部位是否出現(xiàn)新生物來進(jìn)行評(píng)價(jià)。復(fù)發(fā)通過在間歇期或緩解后癌是否再次出現(xiàn)而進(jìn)行評(píng)價(jià)。
[0191]5.包含本發(fā)明的抗體的試劑盒、試劑
[0192] 本發(fā)明中，可以將ACTM-Va的抗體作為ACTM-Va的檢測用試劑或者試劑盒而使用。本發(fā)明的試劑或試劑盒可以適用于上述腫瘤的檢測等中。[0193]將本發(fā)明的抗體(例如單克隆抗體)用作癌的檢測或診斷藥時(shí)，可以將該單克隆抗體與其他的溶劑、溶質(zhì)組合而制成組合物。例如，可以組合蒸餾水、PH緩沖試劑、鹽、蛋白質(zhì)、表面活性劑等。另外，可以將單克隆抗體用酶標(biāo)記后使用。作為標(biāo)記酶，除了 HRP(辣根過氧化物酶)以外，可以使用堿性磷酸酶、蘋果酸脫氫酶、α -葡萄糖苷酶、α -半乳糖苷酶、金膠體等。
[0194]將本發(fā)明應(yīng)用于試劑盒的情況下，除了本發(fā)明的抗體之外，還可以包含上述的溶齊?、溶質(zhì)、酶標(biāo)記試劑、抗原固相化微孔板、抗體稀釋溶液、OPD(鄰苯二胺)片劑、底物液、反應(yīng)終止液、濃縮洗滌液、使用說明書等。另外，提供反應(yīng)的最適條件的緩沖液、對(duì)于反應(yīng)生成物質(zhì)的穩(wěn)定化有用的緩沖液、反應(yīng)物質(zhì)的穩(wěn)定化劑等反應(yīng)介質(zhì)也可以包含于本發(fā)明的試劑盒中。
[0195]本發(fā)明中，用于檢測ACTM-Va的mRNA的探針以及引物可以包含于本發(fā)明的試劑或試劑盒中。作為探針或引物的設(shè)計(jì)基礎(chǔ)的區(qū)域只要能夠檢測出外顯子8’就沒有特別的限定。
[0196]序列引物的長度為18~24堿基，優(yōu)選為20~22堿基。作為序列引物的堿基序列，可以例示出以下的序列。
[0197]CCGTATAAGAACGTCAATGTGC (序列號(hào) 5) CTGGCCAGCTTCTCGTAGTC (序列號(hào) 6 )
[0198]另外，作為用于進(jìn)行RT-PCR、實(shí)時(shí)PCR而擴(kuò)增ACTM-Va的mRNA的引物，只要擴(kuò)增外顯子8’就沒有特別的限定，設(shè)計(jì)并合成由外顯子8’的上游區(qū)域和下游區(qū)域起的15~24堿基、優(yōu)選為16~22堿 基長度的核苷酸，將其作為引物而使用。
[0199]例如，作為引物的堿基序列，可以例示出以下的物質(zhì)。
[0200]正向:TGGGCACTCTGAGGCCA(序列號(hào) 7)
[0201]反向:CTTCTGAGCCCCCGAGAAA(序列號(hào)8)
[0202]另外，作為進(jìn)行雜交的探針(TaqMan探針)，可例示出以下的物質(zhì)。
[0203]TGAGAAGGCCATCATG (序列號(hào) 9 )
[0204]雜交、PCR中使用的試劑、反應(yīng)條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知的。
[0205]6.藥物組合物
[0206]本發(fā)明的藥物組合物為阻礙變異型α -輔肌動(dòng)蛋白-4 (ACTM-Va)的功能的物質(zhì)，優(yōu)選為含有本發(fā)明的抗體作為有效成分，對(duì)于腫瘤的予防、治療是有效的。
[0207]因此，本發(fā)明提供腫瘤的治療方法，其特征在于，對(duì)于患者給與阻礙變異型α-輔肌動(dòng)蛋白-4的功能的物質(zhì)。
[0208]“阻礙變異型α -輔肌動(dòng)蛋白-4的功能的物質(zhì)”是指低分子化合物或功能阻礙性抗體，優(yōu)選為本發(fā)明的ACTM-Va的抗體、以及編碼ACTM-Va的基因的阻礙性核酸。
[0209]編碼ACTM-Va的基因(也稱為ACTM-Va基因)的阻礙性核酸是指抑制其基因功能或抑制基因表達(dá)的核酸，可列舉出例如:反義核酸、誘館核酸(Decoy nucleic acid)、MicroRNA、shRNA或siRNA等。這些阻礙性核酸能夠抑制上述基因的表達(dá)，可以作為腫瘤的基因治療用藥物組合物而使用。
[0210]〈反義核酸〉
[0211]反義核酸為能夠與ACTM-Va基因(目標(biāo)基因)的mRNA (有義)或DNA (反義)序列結(jié)合的單鏈核酸序列(RNA或DNA的任意者)。反義核酸序列的長度為至少14核苷酸，優(yōu)選為14~100核苷酸。反義核酸與上述基因序列結(jié)合形成雙鏈，抑制轉(zhuǎn)錄或翻譯。
[0212]反義核酸可以使用本領(lǐng)域中公知的化學(xué)合成法或生物化學(xué)的合成法而制造。例如，可以使用作為基因重組技術(shù)通常應(yīng)用的、使用DNA合成裝置的核酸合成法。反義核酸例如通過各種DNA轉(zhuǎn)染或電穿孔等基因?qū)敕椒?、或者通過使用病毒載體而被導(dǎo)入至細(xì)胞中。
[0213]〈誘餌核酸〉
[0214]本發(fā)明中,誘館核酸(Decoy nucleic acid)是指包含轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合部位的短的誘餌核酸，能夠與ACTM-Va基因的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并抑制啟動(dòng)子活性。通過將該核酸導(dǎo)入至細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)錄因子與該核酸結(jié)合，競爭地抑制轉(zhuǎn)錄因子向本來的基因組結(jié)合部位的結(jié)合，結(jié)果，該轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)被抑制。具體而言，誘餌核酸為能夠與目標(biāo)結(jié)合序列結(jié)合的核酸或其類似物。本發(fā)明的誘餌核酸可以基于上述基因的啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)為單鏈或包含其互補(bǔ)鏈的雙鏈。對(duì)于長度，沒有特別的限定，為15~60堿基優(yōu)選為20~30堿基。
[0215]核酸既可以為DNA，也可以為RNA，或者也可以包含其核酸內(nèi)被修飾的核酸和/或偽核酸。另外，這些核酸既可以為單鏈或雙鏈，或者為環(huán)狀或線狀。
[0216]本發(fā)明中使用的誘餌核酸，可以使用本領(lǐng)域中公知的化學(xué)合成法或生物化學(xué)的合成法而制造。例如，可以使用作為基因重組技術(shù)通常應(yīng)用的、使用DNA合成裝置的核酸合成法。另外，將作為模板的堿基序列分離或合成之后，也可以使用PCR法或者使用克隆載體的基因擴(kuò)增法。進(jìn)而，也可以將通過這些方法得到的核酸使用限制性內(nèi)切酶等切斷，使用DNA連接酶結(jié)合而制造所希望的核酸。進(jìn)而，為了在細(xì)胞內(nèi)得到更穩(wěn)定的誘餌核酸，可以對(duì)堿基等附加烷基化、酰基化等化學(xué)修飾。
[0217]使用誘餌核酸情況下的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性的解析可以采用通常進(jìn)行的熒光素酶檢測、凝膠阻滯分析(Gel shift Assay)、蛋白質(zhì)印跡法、FACS解析法、RT-PCR等。用于進(jìn)行這些檢測的試劑盒也有銷售(例如promega dual luciferase assay kit)。
[0218]〈RNA 干擾〉
[0219]本發(fā)明中，可以使用能夠在細(xì)胞中通過RNA干擾(RNAi)調(diào)芐基因表達(dá)的合成小核酸分子、例如 siRNA、MicroRNA (miRNA)和 shRNA 分子。
[0220]使用siRNA (small interfering RNA)分子的情況下,可以將對(duì)應(yīng)于ACTM-Va基因的各種RNA作為目標(biāo)。作為這樣的RNA，可列舉出:mRNA、ACTN4-Va基因的轉(zhuǎn)錄后修飾RNA等。本發(fā)明中作為目標(biāo)的基因?yàn)橥ㄟ^選擇的剪接生成的剪接變體，所以能夠使用siRNA分子阻礙外顯子部分(外顯子8’ )的表達(dá)。
[0221]siRNA分子可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的基準(zhǔn)進(jìn)行設(shè)計(jì)。例如，目標(biāo)mRNA的目標(biāo)片段可以優(yōu)選選擇以AA (最優(yōu)選)，TA,GA或CA起始的連續(xù)的15~30堿基、優(yōu)選19~25堿基的片段。siRNA分子的GC比為30~70%，優(yōu)選為35~55%。
[0222]為了生成雙鏈部分，siRNA可以作為在自身的核酸上折疊的單鏈發(fā)夾RNA分子而生成。siRNA分子能夠通過通常的化學(xué)合成而得到。
[0223]本發(fā)明中優(yōu)選使用的siRNA的堿基序列例如如以下。
[0224]CCAUCAUGACUUACGUGUC (序列號(hào) 10)
[0225]UUACGUGUCCUGCUUCUAC (序列號(hào) 11)
[0226]AGAUGAGAAGGCCAUCAUG (序列號(hào) 12)[0227]本發(fā)明中，為了起到RNAi效果也可以使用shRNA。shRNA被稱為短發(fā)夾RNA，是由于單鏈的一部分區(qū)域與其他區(qū)域形成互補(bǔ)鏈從而具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA分子。
[0228] shRNA可以設(shè)計(jì)為其一部分形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。例如，將某區(qū)域的序列作為序列A，將序列A的互補(bǔ)鏈作為序列B時(shí)，按照序列A、間隔物、序列B的順序使這些序列存在于一條RNA鏈上的方式進(jìn)行連接，設(shè)計(jì)成以整體計(jì)為45~60堿基的長度。序列A是作為目標(biāo)的基因的一部分區(qū)域的序列，對(duì)于目標(biāo)區(qū)域，沒有特別的限定，可以將任意的區(qū)域作為候補(bǔ)。并且序列A的長度為19~25堿基，優(yōu)選為19~21堿基。
[0229]進(jìn)而，本發(fā)明可以使用MicroRNA而抑制上述基因的表達(dá)。MicroRNA(miRNA)為細(xì)胞內(nèi)存在的長度20~25堿基左右的單鏈RNA，是被認(rèn)為具有調(diào)節(jié)其他的基因的表達(dá)的功能的ncRNA(非編碼RNA, non coding RNA)的一種。miRNA是在轉(zhuǎn)錄成RNA時(shí)接受加工而產(chǎn)生，作為形成抑制目標(biāo)序列的表達(dá)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的核酸而存在。
[0230]miRNA也為基于RNAi的阻礙性核酸，所以可以根據(jù)shRNA或siRNA而設(shè)計(jì)并合成。
[0231]本發(fā)明中作為治療對(duì)象的病患為癌患者，癌的種類如前所述，其中，為神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、優(yōu)選為肺原發(fā)高惡性度神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(小細(xì)胞肺癌或大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌)。
[0232]本發(fā)明的抗體或ACTM-Va基因的阻礙性核酸可以單獨(dú)給與，或者與藥學(xué)允許的載體或稀釋劑等一起作為藥物組合物而給與，另外其給與可以分為I次或數(shù)次而進(jìn)行。
[0233]此處，“藥學(xué)上能夠允許的載體”可列舉出:賦形劑、稀釋劑、增量劑、崩解劑、穩(wěn)定齊?、防腐劑、緩沖劑、乳化劑、芳香劑、著色劑、甜味劑、增稠劑、掩味劑、溶解輔助劑或者其他的添加劑等。通過使用一種以上這樣的載體，可以調(diào)制片齊?、丸齊?、散齊?、顆粒劑、注射齊?、液齊?、膠囊劑、含片劑、配劑、混懸劑、乳劑或者漿劑等形式的藥物組合物。這些藥物組合物可以口服或非口服地給與。
[0234]口服給與的情況下，可以將微晶纖維素、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸氫二鉀、甘氨酸等各種賦形劑與崩解劑、粘合劑等一起使用。作為崩解劑，可列舉出:淀粉、藻酸、某種硅酸復(fù)鹽等，作為粘合劑，可列舉出例如:聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明膠、阿拉伯膠等。另外，硬脂酸鎂、月桂基硫酸鈉、滑石等潤滑劑對(duì)于片劑形成是非常有效的。用作口服給與而制成為水性懸浮液或者配劑的情況下，可以根據(jù)需要組合使用乳化劑、懸浮化劑，可以與水、乙醇、丙二醇、甘油等以及它們組合成的稀釋劑一起使用。
[0235]作為用于非口服給與的其他的形態(tài)，包含含有一種或其以上的活性物質(zhì)并根據(jù)常規(guī)方法配伍的注射劑等。
[0236]注射劑的情況下，可以例如通過在生理鹽水或市售的注射用蒸餾水等藥學(xué)允許的載體中以成為5mg/ml~500mg/ml的抗體濃度溶解或懸浮而制造。這樣制造的注射劑可以對(duì)于需要處置的人患者，在I次的給與中以單位體表面積250mg/m2~375mg/m2的比例，優(yōu)選為250mg/m2~400mg/m2的比例，每I周I次而給與數(shù)次。
[0237]其中，給與量不受該范圍的限定，能夠通過患者的體重和癥狀、各個(gè)給與路徑而改變。根據(jù)治療的患者對(duì)于藥物的感受性的差異、藥劑配伍的方法、給與期間以及給與間隔，給與量產(chǎn)生變動(dòng)，所以根據(jù)情況不同，低于前述范圍的下限的給與量也是合適的。
[0238]作為給與的形式，可列舉出:靜脈內(nèi)注射、皮下注射、皮內(nèi)注射等，優(yōu)選為靜脈內(nèi)注射。另外，注射劑根據(jù)情況不同，也可以調(diào)制成非水性的稀釋劑(例如丙二醇、聚乙二醇、橄欖油等植物油、乙醇等醇類等)、懸浮劑或乳濁劑。這樣的注射劑的無菌化可以利用從截留細(xì)菌的過濾器中通過的過濾滅菌、殺菌劑的配合或照射而進(jìn)行。注射劑可以以用時(shí)調(diào)制的形式而制造。即，可以通過凍結(jié)干燥法等制成為無菌的固體或粉末組合物，在使用前溶解于無菌的注射用蒸餾水或其他的溶劑中而使用。
[0239]給與siRNA、shRNA或miRNA的情況下，其有效量只要是對(duì)于引起目標(biāo)mRNA的RNAi介質(zhì)分解而言充分的量，就沒有特別的限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以考慮身高和體重、年齡、性別、給與途徑、或者局部或全身給與等的處方而決定應(yīng)該對(duì)于患者給與的有效量。例如，siRNA、shRNA或miRNA在非口服給與(例如靜注)的情況下為約IpM~約20pM、優(yōu)選為5pM~IOpM的細(xì)胞內(nèi)濃度。
[0240]以下，通過實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例更具體地說明本發(fā)明。但本發(fā)明不受這些實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例限定。
[0241][實(shí)施例1]ACT M-Va特異性單克隆抗體的制作
[0242](1)抗原的制作
[0243]ACTM-Va只在小細(xì)胞肺癌患者組織或來源于小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞株、或者正常組織的精巢中表達(dá)。另外，即便想通過它們調(diào)制免疫抗原，目標(biāo)的抗原部位也為來源于新型剪接變體中存在的氨基酸序列置換的3種氨基酸的任意種。因此，作為用于得到目標(biāo)的抗體的抗原，來源于包含全長序列的組織或者細(xì)胞的抗原蛋白質(zhì)作為免疫抗原是不合適的。因此，化學(xué)合成了包含氨基酸置換的序列的免疫抗原(序列號(hào)4)作為部分肽。
[0244]接著，使用合成的ACTM-Va部分肽作為免疫抗原。
[0245]使合成肽和作為載體蛋白質(zhì)的KLH通過MBS法形成二硫鍵，制作免疫抗原。
[0246](2)對(duì)于小鼠的免疫
[0247]免疫方法的概略如圖1所示。免疫按照以下的方法進(jìn)行。將調(diào)制成1.25mg/mL的免疫抗原與FCA等量混合而形成乳劑的物質(zhì)各160μ L對(duì)小鼠的背部皮下進(jìn)行給與，之后間隔2周，將1.25mg/mL的免疫抗原與FIA等量混合而形成乳劑的物質(zhì)各80 μ L對(duì)于小鼠的背部皮下進(jìn)行給與。最終總計(jì)給與5次抗原，通過ELISA確認(rèn)抗體效價(jià)，對(duì)于抗體效價(jià)高的，將1.25mg/mL的免疫抗原40 μ L與生理鹽水460 μ L混合而成的物質(zhì)對(duì)小鼠的腹腔內(nèi)最終給與，3天后，摘除脾臟用于細(xì)胞融合。
[0248](3)脾臟細(xì)胞的調(diào)制與細(xì)胞融合
[0249]將摘除的脾臟研碎，調(diào)制包含ACTM-Va抗體產(chǎn)生細(xì)胞的脾臟細(xì)胞，每I只能夠調(diào)制約IXlO8個(gè)脾臟細(xì)胞。另一方面，培養(yǎng)作為骨髓瘤細(xì)胞的P3U1，在細(xì)胞融合當(dāng)天調(diào)制活細(xì)胞率為95%以上的P3U1。將這些脾臟細(xì)胞與P3U1以5:1混合，利用50%濃度的分子量1，450的聚乙二醇進(jìn)行細(xì)胞融合。融合后，用培養(yǎng)基進(jìn)行洗滌，將懸浮于HAT培養(yǎng)基的物質(zhì)向96孔培養(yǎng)平板的各孔中播種細(xì)胞以成為I X IO5個(gè)/孔。
[0250](4)抗體產(chǎn)生陽性孔的篩選
[0251]細(xì)胞融合后，回收第10天的培養(yǎng)上清，按照后述的實(shí)驗(yàn)例I的方法進(jìn)行抗體產(chǎn)生陽性孔的篩選。1264孔中有31孔是ACTM-Va陽性、ACTM-Ub陰性。用這些選擇的孔的培養(yǎng)上清，再次用實(shí)驗(yàn)例2的方法進(jìn)行篩選，最終，17孔為ACTM-Va陽性。
[0252](5)克隆
[0253]將對(duì)ACTM-Va的特異性高的17孔用有限稀釋(limiting dilution)法進(jìn)行克隆。SP，將細(xì)胞用包含10%的FCS的RPMI培養(yǎng)基調(diào)制成5個(gè)/mL，向2張96孔培養(yǎng)平板的各孔中各添加200 μ L。10天后，用后述的實(shí)驗(yàn)例I和2的方法測定培養(yǎng)上清中的ACTM-Va的抗體效價(jià)和特異性，確認(rèn)為陽性，得到來源于各個(gè)孔的克隆5個(gè)克隆。將各個(gè)建立的克隆作為 “ 13G9 ”、“ 11H2 ”、“ 9B3 ”、“ 15H2 ”、“ IOEIO ”。
[0254]<實(shí)驗(yàn)例1>
[0255]抗體的篩選法
[0256]向96孔微量滴定板的各孔中，添加用PBS (pH7.0)調(diào)制成I μ g/mL的ACTM-Va肽各50yL作為固相化抗原，25°C下放置I小時(shí)。另外，為了同時(shí)地進(jìn)行特異性確認(rèn)，同樣地添加ACTM-Ub肽DIVNTARPDEKAMTYVSS(序列號(hào)3)各50 μ L，25°C下放置I小時(shí)。接著，用包含0.05%Tween20的PBS(pH7.0) (PBST)洗滌3次后，向各孔中添加包含0.5%明膠的PBST(封閉液)各200yL，25°C下靜置I小時(shí)。洗滌后，向各孔中以原液的狀態(tài)添加培養(yǎng)上清各50 μ L，25°C下靜置I小時(shí)。接著，用PBST洗滌3次后，向各孔中添加稀釋了 2500倍的HRP標(biāo)記抗小鼠IgG抗體(KPL公司)各50yL，25°C下靜置I小時(shí)。接著，用PBST洗滌3次后，向各孔中添加用包含0.02%過氧化氫的0.1M檸檬酸磷酸緩沖液(pH5.0)調(diào)制成0.5mg/mL的鄰苯二胺溶液100 μ L，25°C下靜置10分鐘之后，向各孔中添加IM硫酸溶液100 μ L，停止顯色反應(yīng)。之后，通過酶標(biāo)儀(ELISA Reader)測定490nm的吸光度。
[0257]<實(shí)驗(yàn)例2>
[0258]利用蛋白質(zhì)印跡的篩選法以及特異性確認(rèn)法
[0259]用以下的方法，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺電泳(稱為SDS-PAGE)之后，進(jìn)行利用半干印跡(Sem1-dry blotting)的、蛋白質(zhì)印跡(稱為WB),進(jìn)行特異性確認(rèn)試驗(yàn)。
[0260]特異性評(píng)價(jià)用的樣品使用來源于癌細(xì)胞株的提取液時(shí)，使用來源于特異地表達(dá)ACTM-Va的人小細(xì)胞肺癌的癌細(xì)胞株H69以及來源于非表達(dá)株的人胰腺癌的細(xì)胞株BxPC-3、來源于人乳癌的細(xì)胞株MCF7總計(jì)3種細(xì)胞的提取液。使用來源于表達(dá)細(xì)胞的提取液的情況下，使用導(dǎo)入了 ACTM-Va基因的HEK293GFP-ACTN4-Va和導(dǎo)入了 ACTM-Ub基因的HEK293GFP-ACTN4-Ub2 種、以及 HEK293 和 HEK293GFP 總計(jì) 4 種。
[0261]另外，用培養(yǎng)上清篩選時(shí)，只使用H69提取液進(jìn)行評(píng)價(jià)，在用純化抗體的確認(rèn)試驗(yàn)中使用來源于癌細(xì)胞或者來源于表達(dá)細(xì)胞的提取液進(jìn)行評(píng)價(jià)。
[0262]調(diào)制中，分別準(zhǔn)備IXlO7ceIl以上的細(xì)胞，用在T-PER提取液(Thermo公司)中以100倍稀釋加入了蛋白抑制劑(NACALAI TESQUE, INC.)的提取液500ul以下進(jìn)行混合，按照說明書進(jìn)行提取而制成樣品。另外，各樣品通過BCA法(Thermo公司)測定濃度。
[0263]SDS-PAGE使用10%單一濃度的聚丙烯酰胺凝膠(ΑΤΤ0公司)，使用I X SDS-PAGE用電泳緩沖液進(jìn)行電泳。另外，樣品用包含9.3%DTT(dithiothreitol)的6X樣品緩沖液稀釋,進(jìn)行95°C、5分鐘的熱反應(yīng)處理之后，以IOug/泳道供于電泳。此時(shí)的泳動(dòng)條件為20mA、恒定電流，泳動(dòng)在用于可視化而添加的、樣品中的溴酚藍(lán)的線移動(dòng)至凝膠的下端為止的時(shí)點(diǎn)結(jié)束。
[0264]接著，進(jìn)行WB。作為前處理，至泳動(dòng)結(jié)束為止，將9X8.5cm的PVDF膜(稱為膜)(Nihon Millipore K.K.)用甲醇進(jìn)行I分鐘處理之后，使之再次含浸包含20%甲醇的印跡緩沖液(Blotting buffer)。同樣地,將6張切割成與膜同樣尺寸的濾紙含浸印跡緩沖液(Blotting buffer)。
[0265]接著，進(jìn)行向膜的印跡。在半干印跡裝置(GE公司:原Amersham公司)中依次層疊濾紙3張、PVDF膜、樣品的泳動(dòng)結(jié)束了的SDS-PAGE凝膠、濾紙3張，在lcm2/2mA的恒定電流下進(jìn)行50分鐘泳動(dòng)從而對(duì)膜施加終壓15V~30V。
[0266]接著，進(jìn)行封閉(Bloking)。當(dāng)樣品為H69時(shí)，每I泳道中包含BxPC_3、MCF7的3種的情況下，將3種作為I組切斷膜之后，使用用MilliQ水3倍稀釋過的NlOl封閉緩沖液(Blocking buffer) (NOF CORPORATION.)在 25°C下進(jìn)行 I 小時(shí)的振蕩反應(yīng)。
[0267]接著，進(jìn)行I次反應(yīng)。當(dāng)使用培養(yǎng)上清篩選時(shí)，使用將培養(yǎng)上清用PBST進(jìn)行10倍稀釋的封閉液(稱為抗體稀釋液)稀釋至3倍使之與膜反應(yīng)。當(dāng)使用純化抗體確認(rèn)特異性時(shí)，同樣地使用抗體稀釋液調(diào)制成I μ g/ml使之與膜反應(yīng)。分別在25°C下進(jìn)行I小時(shí)的振蕩反應(yīng)。
[0268]接著，進(jìn)行2次反應(yīng)。用PBST將膜洗滌3次后，調(diào)制使用抗體稀釋液進(jìn)行了 20000倍稀釋的HRP標(biāo)記抗小鼠IgG抗體(KPL公司)，在25°C下通過I小時(shí)的振蕩使之與膜反應(yīng)。
[0269]接著，進(jìn)行顯色反應(yīng)。用PBST將膜洗滌3次后，使用Chem1-Lumi One (NACALAITESQUE, INC.)進(jìn)行顯色反應(yīng)。方法按照說明書進(jìn)行。顯色反應(yīng)后，使用LAS-3000(GE公司)，檢測 Chemiluminescence (化學(xué)發(fā)光)。
[0270](6)抗體的純化
[0271]按照以下的方法由上述(5)中建立的5個(gè)克隆純化目標(biāo)的單克隆抗體。首先，將建立的克隆懸浮于市售的無血清培養(yǎng)基(Hybridoma SFM:1nvitrogen公司)中，調(diào)制成4X105個(gè)/mL。向T225燒瓶中加入該細(xì)胞懸浮液50mL，在37°C、5.0%C02環(huán)境下培養(yǎng)約I周。培養(yǎng)后，回收培 養(yǎng)上清。將回收的培養(yǎng)上清上樣至蛋白G柱，用甘氨酸緩沖液(pH3.0)洗脫，純化單克隆抗體。
[0272]之后，使用純化抗體，再次按照實(shí)驗(yàn)例I和2的方法進(jìn)行ACTM-Va的特異性確認(rèn)試驗(yàn)。
[0273]結(jié)果，5個(gè)克隆均獲得與培養(yǎng)上清的情況同樣的結(jié)果(圖2、圖3和圖4)。
[0274](7)建立的克隆的利用免疫組化染色進(jìn)行的診斷適應(yīng)試驗(yàn)
[0275]關(guān)于上述的5個(gè)克隆，按照下述實(shí)驗(yàn)例3的方法進(jìn)行識(shí)別生物組織中的ACTM-Va的抗體在利用免疫組化染色進(jìn)行的診斷適應(yīng)試驗(yàn)。診斷使用肺原發(fā)HGNT和Ad、Sq的切除病理被檢體(η = 557)。結(jié)果，癌組織中的免疫染色能夠使用ACTM-Va的特異的單克隆抗體 “15Η2”(圖 5)。
[0276]另外，ACTM-Va陽性率以實(shí)驗(yàn)例3的評(píng)價(jià)法為基準(zhǔn)進(jìn)行診斷。結(jié)果，LCNEC中
47.5%(58/122)、SCLC 中 60.0%(42/70);偽陽性率 Ad (0/158)，Sq (0/158)均為 0%。作為肺原發(fā)低惡性度神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的類腫瘤(carcinoid)的陽性率成為9.8%(5/51)，與高惡性度神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤相比較，陽性率低(表1)。
[0277][表1]
[0278]
【權(quán)利要求】
1.一種變異型α -輔肌動(dòng)蛋白-4的抗體， 所述變異型α -輔肌動(dòng)蛋白-4具有α -輔肌動(dòng)蛋白-4的氨基酸序列的第245位~第263位的區(qū)域的氨基酸殘基的至少一個(gè)置換為其他的氨基酸殘基而成的氨基酸序列；所述抗體識(shí)別該區(qū)域中的置換氨基酸殘基的全部或者一部分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其中，變異型α-輔肌動(dòng)蛋白-4是以編碼α -輔肌動(dòng)蛋白-4的DNA的外顯子8，為來源的剪接變體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其中，置換氨基酸殘基為選自由α-輔肌動(dòng)蛋白-4的氨基酸序列的第248位的甘氨酸、第250位的亮氨酸和第263位的半胱氨酸組成的組至少一個(gè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其中，包含置換氨基酸殘基的氨基酸序列用序列號(hào)4即DIVGTLRPDEKAIMTYVSC 表示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其中，抗體為單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗體，其由接受號(hào)為NITEΒΡ-1140的雜交瘤產(chǎn)生。
7.—種能夠與如下抗原決定簇結(jié)合的抗體，所述抗原決定簇能夠與權(quán)利要求5或6所述的抗體結(jié)合。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的抗體，其中，抗體為嵌合抗體、人源化抗體或者重組人抗體。
9.一種權(quán)利要求1~8的任一項(xiàng)所述的抗體的片段。
10.一種產(chǎn)生權(quán)利要求5或6所述的抗體的雜交瘤。
11.一種接受號(hào)為NITE ΒΡ-1140的雜交瘤。
12.—種變異型α -輔肌動(dòng)蛋白-4的抗體的制造方法，其包括: (a)使用部分肽免疫非人哺乳動(dòng)物的工序，所述部分肽包含α-輔肌動(dòng)蛋白-4的氨基酸序列的第245位~第263位區(qū)域的氨基酸序列、且具有該區(qū)域的氨基酸殘基的至少一個(gè)置換為其他的氨基酸殘基的氨基酸序列；以及 (b)由該非人哺乳動(dòng)物提取抗體的工序。
13.一種變異型α-輔肌動(dòng)蛋白-4的單克隆抗體的制造方法，其包括: (a)使用部分肽免疫非人哺乳動(dòng)物的工序，所述部分肽包含α-輔肌動(dòng)蛋白-4的氨基酸序列的第245位~第263位區(qū)域的氨基酸序列、且具有該區(qū)域的氨基酸殘基的至少一個(gè)置換為其他的氨基酸殘基的氨基酸序列； (b)從所述被免疫的非人哺乳動(dòng)物提取抗體產(chǎn)生細(xì)胞的工序； (C)使工序(b)中得到的抗體產(chǎn)生細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合的工序；以及 (d)從工序(C)中得到的融合細(xì)胞提取抗體的工序。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的方法，其中，非人哺乳動(dòng)物為導(dǎo)入GANP的非人哺乳動(dòng)物。
15.一種變異型α-輔肌動(dòng)蛋白-4的檢測方法，其特征在于， 使權(quán)利要求1~9的任一項(xiàng)所述的抗體或其片段與生物試樣反應(yīng)而檢測變異型α-輔肌動(dòng)蛋白_4。
16.一種檢測編碼變異型α -輔肌動(dòng)蛋白-4的基因的方法，所述變異型α _輔肌動(dòng)蛋白-4包含α -輔肌動(dòng)蛋白-4的氨基酸序列的第245位~第263位的區(qū)域的氨基酸殘基的至少一個(gè)置換為其他的氨基酸殘基的氨基酸序列，所述方法使編碼該置換氨基酸序列的多核苷酸的探針或者該多核苷酸的擴(kuò)增用引物與生物試樣反應(yīng)而檢測所述基因。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，編碼變異型α-輔肌動(dòng)蛋白-4的基因是以編碼α-輔肌動(dòng)蛋白-4的DNA的外顯子8，為來源的剪接變體的mRNA。
18.一種使用通過權(quán)利要求15~17的任一項(xiàng)所述的方法得到的檢測結(jié)果檢測腫瘤的方法。
19.將通過權(quán)利要求15~18的任一項(xiàng)所述的方法檢測到的結(jié)果作為指標(biāo)評(píng)價(jià)腫瘤的狀態(tài)或者預(yù)后的狀態(tài)的方法。
20.一種腫瘤的檢測或診斷用試劑，其包含權(quán)利要求1~9的任一項(xiàng)所述的抗體或其片段。
21.一種腫瘤的檢測或診斷用試劑，其包含編碼如下氨基酸序列的多核苷酸的探針或該多核苷酸的擴(kuò)增用引物，所述氨基酸序列是α -輔肌動(dòng)蛋白-4的氨基酸序列的第245位~第263 位的區(qū)域的氨基酸殘基的至少一個(gè)置換為其他的氨基酸殘基而成的。
22.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的方法，其中，腫瘤為肺原發(fā)高惡性度神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。
23.根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的試劑，其中，腫瘤為肺原發(fā)高惡性度神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。
24.一種抗腫瘤用藥物組合物，其包含阻礙變異型α-輔肌動(dòng)蛋白-4的功能的物質(zhì)，所述變異型α -輔肌動(dòng)蛋白-4具有α -輔肌動(dòng)蛋白-4的氨基酸序列的第245位~第263位的區(qū)域的氨基酸殘基的至少一個(gè)置換為其他的氨基酸殘基的氨基酸序列。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的藥物組合物，其中，阻礙變異型α-輔肌動(dòng)蛋白-4的功能的物質(zhì)為權(quán)利要求1~9的任一項(xiàng)所述的抗體或其片段、或者編碼變異型α -輔肌動(dòng)蛋白-4的基因的阻礙性核酸。
26.根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的藥物組合物，其中，腫瘤為肺原發(fā)高惡性度神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。
【文檔編號(hào)】G01N33/574GK103958679SQ201180073344
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2011年9月9日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月9日
【發(fā)明者】品川真吾, 伊藤一成, 渡嘉敷佳美, 宮本顯友, 本田一文, 山田哲司 申請(qǐng)人:轉(zhuǎn)基因股份有限公司, 日本國立癌癥研究中心