專利名稱：艱難梭菌外毒素a檢測試劑盒及組成該試劑盒的單克隆抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及艱難梭菌外毒素A檢測試劑盒及組成該試劑盒的單克隆抗體。
背景技術：
艱難梭菌是一種革蘭氏染色陽性、有芽胞、專性厭氧的梭狀桿菌。當前，艱難梭菌感染的預防、診斷、治療面臨著重重困難。一方面，艱難梭菌廣泛存在于院內環(huán)境中，而且作為其休眠形式的芽胞能夠耐受多種院內常用的消毒劑，它已經(jīng)成為僅次于彎曲桿菌的院內感染性腹瀉的主要病原體；甲硝唑、萬古霉素，作為治療艱難梭菌感染的兩種主要的藥物， 它們的耐藥性也在不斷地累積、傳播，療效日趨降低，而且對于復發(fā)病例的治療，這兩種藥物呈現(xiàn)出無能狀態(tài)。另外一方面，到目前為止，尚無有效的、商品化的疫苗問世；基于毒素的 ELISA檢測試劑盒價格昂貴，難以對艱難梭菌進行臨床常規(guī)檢測，也不適用于大規(guī)模的流行病學調查和長期監(jiān)測；治療性抗體作為一種安全、有效、廉價的抗生素替代品，前景光明卻依然處于探索期。所以，急需開發(fā)安全、有效、方便、廉價的艱難梭菌疫苗來保護高危人群， 在疫苗的基礎上開發(fā)相應的單克隆抗體，為診斷試劑及治療性抗體提供可能。艱難梭菌通過糞口途徑進入消化道，繼而分泌外毒素而導致腹瀉。毒素A既是一種腸毒素，又是一種細胞毒素，是艱難梭菌致病的主要毒力因子之一。研究發(fā)現(xiàn)，艱難梭菌外毒素A只有當其羧基端與靶細胞表面受體結合后才能夠發(fā)揮毒性作用；艱難梭菌外毒素 A的分子表面結構大部分為其羧基端所覆蓋；針對艱難梭菌外毒素A羧基端的抗體，能有效抑制其腸毒性和細胞毒性，具有保護效應。所以，艱難梭菌外毒素A羧基端是疫苗研究和抗體開發(fā)的理想結構域。DNA免疫是近年發(fā)展起來的一種新型抗體制備法。DNA免疫克服了傳統(tǒng)蛋白質免疫方法的缺陷，能更為有效地激活機體的體液和細胞免疫應答。首先是在僅知DNA編碼而不能獲得目的蛋白，或獲得的蛋白為低免疫性的情況下，通過DNA免疫可產生高效價特異性的抗體，這為單抗制備提供了一種簡單易行的方法。同時DNA免疫因為存在體內抗原表達和遞呈的過程，所以它最接近活細菌感染機體免疫反應過程并且很完整保存了抗原構象，由此產生的抗體對構想表位有更好的特異性，因此增加了得到具有中和抗體活性單抗的可能性。DNA免疫制備單抗為疾病的診斷和治療提供新的思路。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測艱難梭菌外毒素A的試劑盒。本發(fā)明的另一目的是提供組成該試劑盒的兩株單克隆抗體。本發(fā)明的又一目的是提供所述兩株單克隆抗體的應用。本發(fā)明的目的通過如下技術方案實現(xiàn)一種檢測艱難梭菌外毒素A的試劑盒，包含兩種識別不同表位的抗艱難梭菌外毒素A羧基端抗原的單克隆抗體，分別為保藏號為CGMCC No. 4979的雜交瘤細胞產生的抗艱難梭菌外毒素A羧基端抗原的單克隆抗體以及保藏號為CGMCC No. 4980的雜交瘤細胞系產生抗艱難梭菌外毒素A羧基端抗原的單克隆抗體。所述的辣根過氧化物酶標記的由保藏號為CGMCC No. 4980的雜交瘤細胞系產生抗艱難梭菌外毒素A羧基端抗原的單克隆抗體的稀釋度為I : 2000。分泌抗艱難梭菌外毒素A羧基端單克隆抗體的雜交瘤細胞系，保藏號為CGMCC No. 4979，保藏日期為2011年6月23日。一種抗艱難梭菌外毒素A羧基端抗原的單克隆抗體，由所述的保藏號為CGMCC No. 4979的雜交瘤細胞系產生。所述的單克隆抗體在制備艱難梭菌外毒素的診斷試劑中的應用。所述的單克隆抗體在制備治療艱難梭菌外毒素感染的藥物中的應用。分泌抗艱難梭菌外毒素A羧基端單克隆抗體的雜交瘤細胞系，保藏號為CGMCC No. 4980，保藏日期為2011年6月23日。一種抗艱難梭菌外毒素A羧基端抗原的單克隆抗體，由所述的保藏號為CGMCC No. 4980的雜交瘤細胞系產生。所述的單克隆抗體在制備艱難梭菌外毒素的診斷試劑中的應用。所述的單克隆抗體在制備治療艱難梭菌外毒素感染的藥物中的應用。本發(fā)明的有益效果I、目前，國內尚無合適的檢測艱難梭菌感染的診斷試劑盒，而國際上已研發(fā)成功的試劑盒價格昂貴，這也阻礙了國內艱難梭菌診斷的發(fā)展，本發(fā)明提供的艱難梭菌外毒素檢測試劑盒，通過使用兩株高親和力的配對單抗，使檢測艱難梭菌的靈敏度達到了國際標準。這一試診斷試劑盒的開發(fā)可極大的促使國內開展廣泛艱難梭菌的研究，同時也可以對艱難梭菌感染進行大規(guī)模的流行病學調查和長期的監(jiān)測。2、本發(fā)明以選取艱難梭菌外毒素A基因羧基端末尾978個堿基序列為研究模板，對該序列進行密碼子優(yōu)化處理，設計得到TcdA-C基因序列，并將該優(yōu)化后的序列裝入 PJW4303載體中，構建一密碼子優(yōu)化的TcdA-C基因的DNA疫苗。用該DNA疫苗通過電穿孔免疫小鼠，經(jīng)過常規(guī)細胞融合、篩選及單克隆化，建立穩(wěn)定分泌抗TcdA-C單克隆抗體的雜交瘤細胞株，采用捕獲ELISA方法進行篩選，雜交瘤細胞所分泌的單克隆抗體能夠特異性識別商品化toxinA及艱難梭菌分泌的外毒素A。捕獲ELISA較之直接包被ELISA方法主要有幾方面的優(yōu)勢a.抗原以自然狀態(tài)與特異性抗體結合；b.敏感性高；c.檢測信號的強弱較大程度上依賴于抗體的捕獲能力，換言之，這種方法能篩選出試劑盒所需的具有高親和力的抗體。通過捕獲法篩選獲得的2株高親和力的單抗進行配對，其對抗原的檢測靈敏度達到國際市場上應用最廣的3家艱難梭菌檢測試劑盒的靈敏度，這對艱難梭菌感染的診斷，治療及疫苗制備等具有重要意義。3、雖然新近已有針對外毒素A羧基端的治療性單克隆抗體問世，但仍處在早期臨床試驗階段，所呈現(xiàn)的治療效果也有一定的局限性。我們制備多株高親和力的單抗在CHO 細胞上的被動保護試驗呈現(xiàn)保護作用，通過人源化后可用于開發(fā)安全、有效、廉價的治療性抗體。生物材料保藏信息
I、雜交瘤細胞株5D8D5，分類命名為雜交瘤細胞株SP2/0，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏號為CGMCC No. 4979，保藏日期為2011年6月23日。2、雜交瘤細胞株2C7B6，分類命名為雜交瘤細胞株SP2/0，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏號為CGMCC No. 4980，保藏日期為2011年6月23日。


圖I單抗在細胞水平的中和保護試驗結果照片。A為空白細胞對照，B為未加單抗僅加毒素的細胞對照，C為15ug/ml 2C7B6與毒素共同作用，D為15ug/ml 5D8D5與毒素共同作用。
具體實施例方式實施例L DNA疫苗pJW4303-TcdA_C的構建詳見申請?zhí)枮?010101309048的中國發(fā)明專利申請說明書實施例I 4。實施例2. 293F細胞轉染293F 細胞(購自 invitrogen 公司，cat No. R790-07)用含 293F 細胞培養(yǎng)基 37°C， 5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)至對數(shù)生長期，轉染前一天接種細胞6 7xl05cells/ml,轉染當天,取少量細胞計數(shù),細胞數(shù)約為 lxl06cells/ml,準備 Iipid-DNA 復合物。a.用 opti-MEM I 稀釋 30ug pJW4303-TcdA_C 質粒至 1ml,輕輕混勻。b.用opti-MEM I稀釋60ul 293fectin至1ml,輕輕混勻并室溫孵育5Min。c.將步驟a制備的pJW4303-TcdA_C質粒稀釋液加入到293fectin中，輕輕混勻。d.室溫孵育 20_30mins，得 DNA/293fectin。然后將DNA/293fectin加入到搖瓶中，轉染48_72h，然后收集上清儲存于_80°C備用。脾細胞融合前4天用該上清免疫小鼠進行蛋白質加強。實施例3.雜交瘤細胞系的建立步驟I :動物免疫用實施例I制備的pJW4303-TcdA-C免疫7只Balb/c小鼠。肌肉注射結合活體基因導入方式免疫，保證針頭插入深度2mm，注入疫苗，觀察注射局部隆起，注射后立即于注射部位用WJ-2002活體基因導入儀進行體內電轉染(技術參數(shù)電壓50V，脈沖次數(shù)正反各3 次，波寬60ms，頻率30Hz)，以小鼠腿部肌肉發(fā)生抖動視為電轉染有效。于第0、2、4、8周進行4次DNA免疫，第4次DNA免疫后采用腹腔注射pJW4303-TcdA-C轉染293F細胞上清粗提物，每只小鼠注射O. 2mg蛋白。步驟2:細胞融合在步驟I蛋白加強免疫4天后，摘除免疫小鼠眼睛放血，留取血清作為ELISA的陽性對照。拉頸處死小鼠，75%酒精浸泡5min。在小鼠腹部剪一小口，撕開皮膚，剪開腹膜，鑷取小鼠脾臟，剪下小鼠脾臟，除去脂肪和結締組織，用RPMI 1640不完全培養(yǎng)基洗滌小鼠脾臟。將小鼠脾臟剪成4塊，在不銹鋼篩網(wǎng)(100目/cm2)上，用玻璃注射器針芯充分研磨小鼠脾臟，輕輕擠壓出脾細胞。將研磨液經(jīng)過不銹鋼篩網(wǎng)(200目/cm2)過濾后，轉移至離心管，IOOOrpm離心5min，棄上清。RPMI 1640不完全培養(yǎng)基洗滌細胞一次，再用RPMI 1640不完全培養(yǎng)基充分重懸細胞，進行細胞計數(shù)，置于孵育箱(37°C、5%C02)中待用。充分混勻免疫脾細胞IO8個(25ml無血清培養(yǎng)基)和小鼠骨髓瘤SP2/0細胞(購自上海細胞所)2xl07 個(25ml無血清培養(yǎng)基)懸液，200-400g離心5_10min，用吸管盡可能吸取上清，以免稀釋 PEG.。手指輕彈離心管使細胞沉淀較為松動，將離心管置于37°C水浴中，融合過程中離心管一直置于水浴中，I分鐘內使用吸管將Iml 37°C水浴中預熱的50% PEG1500加入到細胞沉淀中，邊加邊適度攪拌，加完后繼續(xù)攪拌l_2min。I分鐘內加lml37°C水浴中預熱的培養(yǎng)基到融合混合物中，如上述攪拌。3分鐘內加3ml預熱的培養(yǎng)基，持續(xù)攪拌，然后緩慢的加入IOml預熱的培養(yǎng)基，離心沉淀細胞，棄上清，用選擇性培養(yǎng)基(RPMI 1640,10% FBS, lxGlutamine/Pen/Strep, IxHAT medium)重懸細胞沉淀,按100 μ I/孔加入到96孔培養(yǎng)板， 置于細胞孵育箱(37°C、5%C02)中培養(yǎng)。在融合后第5和第7天更換新鮮培養(yǎng)基，在第7 天或第10天檢測抗體分泌情況。步驟3 :捕獲ELISA方法篩選陽性雜交瘤細胞I)準備5ug/ml抗小鼠IgG-Fc (購自Sigma公司)，每孔加IOOul, 4°C,過夜。2)棄包被液，用IXPBST洗板2次。3) 5 % 脫脂奶粉(PBS，O. 05 % Tween-20, 5 % 脫脂奶粉)37 °C，封閉 lh，每孔 200 μ I。4)棄封閉液，用IXPBST洗板2次。5) 一抗為待檢測融合細胞上清，每孔加入100μ 1，37°C，孵育Ih。6)棄一抗，用IXPBST洗板5次。7) 二抗為生物素標記商品化全毒素toxinA(購自List BioLab公司)(濃度為 100ng/ml)，每孔加入 100 μ 1，RTlh08)棄二抗，用IXPBST洗板5次。9)!11^標記鏈親和素(濃度為111^/1111，1 2000)，每孔加入100 μ 1，37°C，孵育lh。10)棄HRP標記鏈親和素，用IXPBST洗板5次。11)TMB 顯色(100ul/well)，室溫，3. 5min，50ul/well IM 的 H2SO4 終止顯色。12)酶標儀測定并記錄各孔A450值。步驟4 :陽性雜交瘤細胞的克隆化-采用有限稀釋法將細胞懸液移至刻度離心管中連續(xù)倍數(shù)稀釋。例如，先制備5xl03細胞懸液，將此細胞懸液經(jīng)100倍稀釋，即為50細胞/ml ;再將50細胞/ml的細胞懸液經(jīng)5倍稀釋，即為 10細胞/ml，最后將10細胞/ml的細胞懸液經(jīng)2倍稀釋，即為5細胞/ml。將3種稀釋好的細胞懸液分別接種于96孔板中，每孔加IOOul。50細胞/ml加到A，B，C三排，細胞數(shù)為 10個/ml加D、E、F三排。細胞數(shù)5個/ml，加G、H兩排。約10天后檢測抗體，篩選出抗體陽性最強的單克隆細胞。然后，再進行亞克隆培養(yǎng)，改用RPMI 1640完全培養(yǎng)基，直到所有含單個克隆的微孔均為抗體陽性為止，即獲得單抗分泌株，大量擴增并凍存，長期傳代培養(yǎng)后，以相同的方法再次克隆化鑒定，從何獲得了 6株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株， 分別為 OT8D5，2C7B6，1G3F10, 2D4D3,1B5F5 和 4A4F2，液氮凍存待用。實施例4體外培養(yǎng)法制備單抗
將實施例3建立的陽性雜交瘤細胞 8D5，2C7B6，1G3F10, 2D4D3,1B5F5，和4A4F2 進行擴大培養(yǎng)，收集培養(yǎng)上清1500rpm，離心lOmin，上清含有高濃度的單克隆抗體，-70°C
保存?zhèn)溆?。實施?單抗特性鑒定步驟I :克隆抗體IgG亞型鑒定取6株雜交瘤細胞培養(yǎng)上清，按照小鼠單克隆抗體同型檢測試劑盒操作說明(HBT 公司)進行操作。具體方法如下(I)加500ul緩沖液至檢測管中；(2)加500ul雜交瘤細胞培養(yǎng)上清至檢測管中；(3)完全浸潤試紙條，并輕輕搖動；(4)加入Iml大鼠抗小鼠K鏈底物至檢測管中，試紙條打印面朝下，與液體充分接觸，輕輕搖動直至試紙條上出現(xiàn)兩條帶；結果表明1G3F10為 IgGl，K 輕鏈免疫球蛋白；5D8D5, 2C7B6,1B5F5，2D4D3 和 4A4F2為IgG2a，K輕鏈免疫球蛋白。步驟2:單克隆抗體的純化利用GE HiTrap protein G抗體純化柱(Iml柱)進行單抗純化,具體操作如下(I)將注射器中充滿結合緩沖液，除去堵頭并將注射器連接在柱子上(使用提供的連接接頭)，緩沖液需一滴一滴注如以避免出現(xiàn)氣泡；(2)除去柱子底部出口的堵頭；(3)使用至少5倍柱體積的結合緩沖液平衡柱子；(4)使用注射器將樣品上到柱子上去，為了獲得良好的結果，推薦的流速為O. I lml/min ；(5)以7倍柱體積的緩沖液沖洗柱子，或直到?jīng)]有物質從柱子中流出。在沖洗時保持流速為2ml/min。(6)以IOml洗脫緩沖液洗脫蛋白，在洗脫時，保持流速為lml/min。(7)洗脫完畢后，用5倍的結合緩沖液沖洗柱子，這樣柱子可以用于新的一輪純化過程。步驟3 :單克隆抗體穩(wěn)定性的測定復蘇雜交瘤細胞，收集不同傳代次數(shù)(傳代次數(shù)高達20次以上)的細胞上清，并用ELISA方法檢測其效價。結果表明獲得6株雜交瘤細胞株能夠穩(wěn)定的產生單克隆抗體。實施例6.不同單抗配對特性的檢測以及試劑盒的前期基礎研究步驟I :6株單克隆抗體配對后進行檢測其靈敏度按下列模式設計該試驗，本試驗目的是為了檢測不同的配對優(yōu)劣，選出檢測靈敏度最好的一對單抗。組I :包被 1G3F10，用 C7B6-HRP，2D4D3-HRP，1B5F5-HRP, 4A4F2-HRP 進行檢測組2 :包被 OT8D5，用 2C7B6-HRP，2D4D3-HRP，1B5F5-HRP, 4A4F2-HRP 進行檢測組3 :包被 2C7B6，用 1G3F10-HRP，5D8D5-HRP 進行檢測組4 :包被 2D4D3，用 1G3F10-HRP，5D8D5-HRP 進行檢測組5 :包被 1B5F5，用 1G3F10-HRP，5D8D5-HRP 進行檢測
組6 :包被 4A4F2，用 1G3F10-HRP，5D8D5-HRP 進行檢測操作步驟I)準備5ug/ml抗體進行包被，每孔加IOOul，4°C，過夜。2)棄包被液，用IXPBST洗板2次。 3)5% 脫脂奶粉(PBS ,0. 05% Tween-20，5 % 脫脂奶粉)37 °C，封閉 Ih，每孔 200 μ L·4)棄封閉液，用IXPBST洗板2次。5)按表I加入ToxinA,室溫孵育lh。表I
權利要求
1.一種檢測艱難梭菌外毒素A的試劑盒，其特征在于包含兩種抗艱難梭菌外毒素A羧基端抗原的單克隆抗體，分別為保藏號為CGMCC No. 4979的雜交瘤細胞產生的抗艱難梭菌外毒素A羧基端抗原的單克隆抗體以及辣根過氧化物酶標記的由保藏號為CGMCC No. 4980 的雜交瘤細胞系產生的抗艱難梭菌外毒素A羧基端抗原的單克隆抗體。
2.根據(jù)權利要求I所述的檢測艱難梭菌外毒素A的試劑盒，其特征在于所述的辣根過氧化物酶標記的由保藏號為CGMCC No. 4980的雜交瘤細胞系產生抗艱難梭菌外毒素A羧基端抗原的單克隆抗體的稀釋度為I : 2000。
3.分泌抗艱難梭菌外毒素A羧基端單克隆抗體的雜交瘤細胞系，保藏號為CGMCC No. 4979，保藏日期為2011年6月23日。
4.一種抗艱難梭菌外毒素A羧基端抗原的單克隆抗體，由權利要求3所述的保藏號為 CGMCC No. 4979的雜交瘤細胞系產生。
5.權利要求4所述的單克隆抗體在制備艱難梭菌外毒素的診斷試劑中的應用。
6.權利要求4所述的單克隆抗體在制備治療艱難梭菌外毒素感染的藥物中的應用。
7.分泌抗艱難梭菌外毒素A羧基端單克隆抗體的雜交瘤細胞系，保藏號為CGMCC No. 4980，保藏日期為2011年6月23日。
8.一種抗艱難梭菌外毒素A羧基端抗原的單克隆抗體，由權利要求7所述的保藏號為 CGMCC No. 4980的雜交瘤細胞系產生。
9.權利要求8所述的單克隆抗體在制備艱難梭菌外毒素的診斷試劑中的應用。
10.權利要求8所述的單克隆抗體在制備治療艱難梭菌外毒素感染的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術領域，公開了艱難梭菌外毒素A檢測試劑盒及組成該試劑盒的單克隆抗體。一種檢測艱難梭菌外毒素A的試劑盒，包含兩種抗艱難梭菌外毒素A羧基端抗原的單克隆抗體，分別為保藏號為CGMCC No.4979的雜交瘤細胞產生的抗艱難梭菌外毒素A羧基端抗原的單克隆抗體以及辣根過氧化物酶標記的由保藏號為CGMCC No.4980的雜交瘤細胞系產生的抗艱難梭菌外毒素A羧基端抗原的單克隆抗體。本發(fā)明提供的艱難梭菌外毒素檢測試劑盒，通過使用兩株高親和力的配對單抗，使檢測艱難梭菌的靈敏度有了顯著提高。
文檔編號G01N33/577GK102590515SQ20121001166
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月13日 優(yōu)先權日2012年1月13日
發(fā)明者盧山, 張春華, 王世霞, 金柯, 黃祖瑚 申請人:盧山, 張春華, 王世霞, 金柯, 黃祖瑚