專利名稱：免疫膠體金試紙及其配合光電傳感器定量檢測clb的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于單克隆抗體技術(shù)、金標抗體技術(shù)、競爭免疫層析技術(shù)和光電型傳感器技術(shù)領域，具體涉及一種免疫膠體金試紙及其配合光電傳感器定量檢測CLB的方法。
背景技術(shù)：
鹽酸克倫特羅又名為瘦肉精，化學名稱為羥甲叔丁腎上腺素，是一種人工合成的 ^ 2-腎上腺素受體激動劑，動物食用后能顯著提高瘦肉率，但同時也造成動物性食品中CLB 的殘留，從而引起人類中毒事件的發(fā)生。世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國糧農(nóng)組織規(guī)定CLB在動物可食用組織中最大殘留限為0. 01ng/g。膠體金免疫層析試驗法利用抗原抗體反應原理，利用膠體金標記示蹤物與固定在膜上的抗原或抗體形成復合物被截留而顯色，不需要特定的酶和底物顯色，也不需要抗原抗體之間的較長時間的物理吸附，而根據(jù)顯色與否判定陰陽性結(jié)果，安全有效，簡單方便。但方法的缺陷是不能完全達到定量檢測的要求。有效的檢測方法是控制CLB濫用的關節(jié)環(huán)節(jié)之一，目前鹽酸克倫特羅的常用檢測方法主要有色譜分析方法和免疫學分析方法等。但這些方法需要對檢測樣品進行嚴格的預處理，所需儀器比較昂貴和不適宜現(xiàn)場檢測等缺點。膠體金免疫試紙條可以快速定性檢測 CLB的殘留，在生產(chǎn)上已被廣泛的應用。近年來，光電型傳感器已被廣泛應用到檢測食品和飲用水的重金屬中，其具有檢測迅速、簡便、容易攜帶、可實現(xiàn)現(xiàn)場檢測等優(yōu)點；目前尚未見到用免疫膠體金技術(shù)和光電型傳感器定量檢測CLB的殘留的相關專利報道。經(jīng)過專利搜索發(fā)現(xiàn)，申請?zhí)?2228104. 5，名為鹽酸克倫特羅快速檢測試紙條；申請?zhí)?2202033. 0，名為鹽酸克倫特羅試紙條；申請?zhí)?00510083198. 5，名為一種快速檢測鹽酸克倫特羅殘留的免疫金試紙，這些技術(shù)只能定性和半定量檢測，不能定量檢測CLB。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有的鹽酸克倫特羅目前樣品前處理復雜、檢測時間長、需要大型儀器和傳統(tǒng)免疫膠體金試紙條不能定量檢測的缺陷，提出了一種免疫膠體金試紙及其配合光電傳感器定量檢測CLB的方法。本發(fā)明既達到定量檢測的要求，還具有檢測迅速、特異性強、操作簡便、便于攜帶、可實現(xiàn)現(xiàn)場檢測等優(yōu)點，具有很好的應用前景。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案本發(fā)明涉及一種免疫膠體金試紙條，包括玻璃纖維、膠體金保護墊、支撐板、NC膜 (硝酸纖維素膜)和吸水紙，所述吸水紙、NC膜、膠體金保護墊、玻璃纖維設置在所述支撐板上并依次相互部分重疊；所述支撐板上設有兩個圓孔，所述NC膜上與所述支撐板上的兩個圓孔相對應的圓形區(qū)域包被有CLB-BSA的T區(qū)條帶和包被有羊抗鼠二抗的C區(qū)條帶，所述膠體金保護墊含有膠體金標記的抗鹽酸克倫特羅的抗體。所述免疫膠體金試紙條具體結(jié)構(gòu)為以吸水紙為起始端，玻璃纖維為末端，支撐板位于底層，其上自起始端至末端依次為吸水紙、NC膜、膠體金保護墊和玻璃纖維，相鄰兩部分交界處部分重疊；所述C區(qū)條帶靠近吸水紙端，所述T區(qū)條帶靠近膠體金保護墊端。
優(yōu)選的,所述支撐板為PVC板,所述圓孔為1cm。優(yōu)選的，所述膠體金保護墊含有的抗鹽酸克倫特羅抗體的體積為4 20 ii L。優(yōu)選的，所述膠體金保護墊的制備方法如下a、制備膠體金溶液；b、將4 20ii L的抗鹽酸克倫特羅的抗體加入ImL的Tris-HCl緩沖液中，混合攪拌過程中加入IOml膠體金溶液,攪拌10 60min后,用碳酸鉀調(diào)pH大于8. 5,而后加入 100 200 ii L牛血清白蛋白(BSA)，靜置、離心，棄上清液，用洗滌液洗滌，再離心一次，棄上清液，收集紅色沉淀，將其均勻的滴加到保護墊上，即得。優(yōu)選的，所述步驟a具體為在100 300mL蒸餾水中，加入1%的氯金酸100 500 u L，加熱到沸騰時，再加入I %的檸檬酸三鈉100 500 u L，繼續(xù)加熱到溶液呈紫紅色后低溫維持3 IOmin,即得。優(yōu)選的，所述步驟b中洗滌劑由聚乙二醇200010 100 u L、碳酸鉀100 300 U L、 聚乙烯二醇10 100 i! L和Tris-HCl緩沖液10 30ml配制而成。優(yōu)選的，所述硝酸纖維素膜上包被的CLB-BSA和羊抗鼠二抗的體積為2 20 ii L。優(yōu)選的，所述硝酸纖維素膜的制備方法如下a、制備 CLB-BSA ;b、在所述硝酸纖維素膜上與支撐板上兩圓孔相對應的圓形區(qū)域均勻的滴加2 20 u L的羊抗鼠二抗和CLB-BSA，用封阻劑封閉20 60min，蒸餾水沖洗，取出自然晾干，即得。優(yōu)選的，所述CLB-BSA制備方法如下取CLBlOmg，加入2mL預冷的0. 2mol/L鹽酸至全部溶解，冷卻至零度，30min后，加入120mg NaNO2溶液，然后將上述溶液加入4mL 0. lmol/L的碳酸鹽緩沖液中，混勻后在零度靜止lh，以S印hadexG50凝膠純化，用pH7. 4 的0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液洗脫，_20°C保存?zhèn)溆?；所述碳酸鹽緩沖液中含有40mg的 BSA。優(yōu)選的，所述封阻劑由I 10%脫脂奶粉2 10g/L和0. I 0. 5g/L的甘氨酸配制而成。本發(fā)明還涉及一種用前述的免疫膠體金試紙條和光電傳感器定量檢測鹽酸克倫特羅(CLB)的方法，包括如下步驟a、經(jīng)測試后的免疫膠體金試紙條，放在光電傳感器的測試區(qū)內(nèi)檢測；b、光電型傳感器將檢測區(qū)域反射的光轉(zhuǎn)換成電信號，根據(jù)電信號的強度，計算出 CLB的濃度。優(yōu)選的，步驟a中所述測試后的免疫膠體金試紙條剪切成3cmX0. 9cm大小的條子后再進行檢測。本發(fā)明的工作原理為用本發(fā)明的免疫膠體金試紙條檢測鹽酸克倫特羅時，當溶液中沒有鹽酸克倫特羅時，溶液會緩慢的往上層析，膠體金保護墊上的抗鹽酸克倫特羅的抗體也會向上層析與硝酸纖維素膜上的抗原結(jié)合，在T區(qū)顯現(xiàn)出條帶，結(jié)合的抗體抗原會繼續(xù)往上層析，當遇到二抗時，在C區(qū)也會出現(xiàn)一條條帶。當溶液中有鹽酸克倫特羅時，鹽酸克倫特羅會和膠體金保護墊上的單抗競爭與硝酸纖維素膜上的抗原結(jié)合，就會在此處顯示出沒有或顏色較淺的條帶，結(jié)合的抗體抗原也會繼續(xù)往上層析，在二抗處也會顯現(xiàn)出一條條帶，可以定性和半定量檢測靶物質(zhì)；然后將顯色后的試紙條剪切成尺寸為3X0. 9cm的條子，到光電型傳感器上進行檢測，光電型傳感器的檢測原理為光從光源發(fā)出投射到試紙條的測試區(qū)后被反射，反射光由電流頻率轉(zhuǎn)換器接收并轉(zhuǎn)換為電信號進行傳輸，經(jīng)過單片機的數(shù)據(jù)處理，最終顯示在顯示器上，且電信號的強度與試紙條的顏色深淺呈反比，光電型傳感器讀出光電信號值，根據(jù)電信號的強度，間接計算出鹽酸克倫羅的濃度，從而克服傳統(tǒng)免疫金試紙條只能定性和半定量檢測的缺陷，實現(xiàn)定量檢測鹽酸克倫特羅。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下有益效果I、制備方法簡單，可以定量檢測鹽酸克倫特羅；制備的膠體金免疫試紙條的顯色區(qū)域為直徑為Icm的圓孔增大了顯色面積；顯色面積增大后，在光電型傳感器上檢測的準確度和靈敏度更高；2、本發(fā)明的方法靶物質(zhì)針對性強，準確率高，檢測速度快，顯色后的免疫膠體金試紙條在光電型傳感器上檢測時間為2min，克服了傳統(tǒng)免疫膠體金試紙條檢測CLB的缺陷， 可滿足出入境、海關和超市等部門機構(gòu)定量檢測CLB的要求；3、具有制備成本低、攜帶方便、操作簡單不需要大型儀器設備等優(yōu)點；對動物性產(chǎn)品、飼料和食品中鹽酸克倫特羅的檢測具有良好的應用前景。


圖I為免疫膠體金試紙條檢測鹽酸克倫特羅的示意圖；圖2為免疫膠體金試紙條測試不同濃度的鹽酸克倫特羅的顏色效果示意圖；圖3為光電型傳感器的檢測原理圖；圖4為光電型傳感器的樣機圖；其中，1為PVC板,2為玻璃纖維,3為膠體金保護墊,4為硝酸纖維素膜,5為吸水紙，6為顯示屏，7為測試區(qū)。
具體實施例方式下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。以下實施例中用到的CLB-BSA的制備方法如下取CLBlOmg,加入2mL預冷的0. 2mol/L鹽酸至全部溶解,冷卻至零度,30min后,加 A 120mg NaNO2溶液，然后將上述溶液加入4mL 0. lmol/L的碳酸鹽緩沖液中(含有40mg的 BSA)，混勻后在零度靜止lh，以S印hadexG50凝膠純化，用pH7. 4的0. 05mol/L的Tris-HCl 緩沖液洗脫，_20°C保存?zhèn)溆?。實施例I本實施例的免疫膠體金試紙條的制備及其和光電型傳感器相結(jié)合定量檢測鹽酸克倫特羅的方法步驟如下(I)膠體金溶液的制備首先所需要的實驗儀器酸泡12h，制備膠體金溶液，用量筒量取IOOmL的蒸餾水， 加入I %氯金酸IOOiI L，加熱到沸騰時，再加入I %的檸檬酸三鈉IOOiI L，加熱到溶液呈紫紅色，關小火再燒3min即可。(2)膠體金保護墊的制作用干凈的移液管吸取IOmL的膠體金溶液到小燒杯中，吸取4 ii L的抗體加入ImL 的Tris-HCl緩沖液中，將其混合液在攪拌的過程中加入膠體金溶液中，等IOmin后，用碳酸鉀調(diào)PH大于8. 5，等一段時間后，加入BSA100 u L，等一段時間之后，將其均勻分裝到6個離心管中離心，棄其上清液，用洗滌劑(吸取聚乙二醇2000 10 iiL、碳酸鉀IOOii L、聚乙烯二醇10 u L，Tris-HCl緩沖液IOmL配制成洗滌劑)洗漆，再離心一次，棄掉上清液，收集紅色沉淀，將其均勻的滴加到膠體金保護墊上。(3)在硝酸纖維素膜的圓孔處滴加二抗和抗原將硝酸纖維素膜在封阻劑(取1%脫脂奶粉2g/L，加入0. lg/L的甘氨酸，配制成封阻劑)中搖晃lOmin，用圓規(guī)在硝酸纖維素膜上制作兩個直徑為Icm的圓孔用洗液搶吸取L的羊抗鼠二抗和CLB-BSA偶聯(lián)物均勻的滴加到制作的圓孔處，用封阻劑進行封閉 20min,蒸餾水反復沖洗三次，取出自然晾干，備用。(4)膠體金免疫試紙條的組裝取一定長度的PVC板I，采用機械沖壓打孔法，在PVC板I上中部等距離制作兩個直徑為Icm的圓孔，對齊將硝酸纖維素膜4黏貼上(所述硝酸纖維素膜4上與所述PVC板 I上的兩個圓孔相對應的圓形區(qū)域包被有CLB-BSA的T帶和包被有羊抗鼠二抗的C帶，C帶靠近吸水紙5端，T帶靠近膠體金保護墊3端)；在硝酸纖維素膜4上部的一側(cè)粘貼上吸水紙5，該吸水紙5與硝酸纖維素膜4部分重疊；在硝酸纖維素膜4上部相對于吸水紙5而言的另一側(cè)粘貼上膠體金保護墊3，該膠體金保護墊3與硝酸纖維素膜4部分重疊；在膠體金保護墊3上相對于硝酸纖維素膜4而言的另一側(cè)貼上玻璃纖維2，該玻璃纖維2與膠體金保護墊3部分重疊(如圖I所示)。配制不同濃度的CLB標準液進行檢測如圖2所示，當無鹽酸克倫特羅時，T帶顏色較深，判斷為陰性；而控制線(C帶)應一直顯色(a);相反，在有鹽酸克倫特羅的情況下，鹽酸克倫特羅首先會與金標墊上的單抗形成復合物，從而與NC膜上的CLB-BSA偶聯(lián)物形成競爭，抑制CLB-BSA偶聯(lián)物捕獲鹽酸克倫特羅金標單抗的量，T帶較淺(b)或消失(C)，判斷為陽性，因為二抗結(jié)合鹽酸克倫特羅抗體的其它結(jié)合位點，與鹽酸克倫特羅的存在沒有關系；所以隨著鹽酸克倫特羅濃度的增加，試紙條在檢測帶上的顏色會越來越淺。(5)結(jié)合光電型傳感器定量檢測鹽酸克倫特羅將顯色后的試紙條剪切成尺寸為3X0. 9cm的條子，到光電型傳感器上進行檢測
O。光電型傳感器的檢測原理圖如圖3所示，光電型傳感器的樣機如圖4所示從光源發(fā)出投射到試紙條的測試區(qū)7后被反射，反射光由電流頻率轉(zhuǎn)換器接收并轉(zhuǎn)換為電信號進行傳輸，經(jīng)過單片機的數(shù)據(jù)處理，最終顯示在顯示屏6上，且電信號的強度與試紙條的顏色深淺呈反比，從而克服傳統(tǒng)免疫金試紙條只能定性和半定量檢測的缺陷，可以達到定量進行檢測，一般肉眼觀測不到的顏色，光電型傳感器也讀出光電信號值，根據(jù)電信號的強度，間接計算出鹽酸克倫羅的濃度，從而可以定量檢測鹽酸克倫特羅。實施例2本實施例的免疫膠體金試紙條的制備及其和光電型傳感器相結(jié)合定量檢測鹽酸克倫特羅的方法步驟如下
(I)膠體金溶液的制備在制備免疫膠體金試紙條之前，把所需要的實驗儀器酸泡15h，首選制備膠體金溶液，用量筒量取200mL的蒸餾水，加入1%氯金酸200 iiL，加熱到沸騰時，再加入1%的檸檬酸三鈉300 ii L，加熱到溶液呈紫紅色，關小火再燒5min即可。(2)膠體金保護墊的制作用干凈的移液管吸取IOmL的膠體金溶液到小燒杯中，吸取10 ii L的抗體加入ImL 的Tris-HCl緩沖液中，將其混合液在攪拌的過程中加入膠體金溶液中，等30min后，用碳酸鉀條PH大于8. 5，等一段時間后，加入BSA150 u L，等一段時間之后，將其均勻分裝到6個離心管中離心，棄其上清液，用洗滌劑(吸取聚乙二醇2000 40111、碳酸鉀160111、聚乙烯二醇40 u L，Tris-HCl緩沖液16mL配制成洗滌劑)洗漆，再離心一次，棄掉上清液，收集紅色沉淀，將其均勻的滴加到膠體金保護墊上。(3)在硝酸纖維素膜的圓孔處滴加二抗和抗原將硝酸纖維素膜在封阻劑(取4%脫脂奶粉4g/L，加入0. 3g/L的甘氨酸，配制成封阻劑)中搖晃20min，用圓規(guī)在硝酸纖維素膜上制作兩個直徑為Icm的圓孔用洗液搶吸取IOy L的羊抗鼠二抗和CLB-BSA偶聯(lián)物均勻的滴加到制作的圓孔處，用封阻劑進行封閉 30min,蒸餾水反復沖洗三次，取出自然晾干，備用。(4)膠體金免疫試紙條的組裝取一定長度的PVC板，采用機械沖壓打孔法，在PVC板上中部等距離制作兩個直徑為Icm的圓孔，對齊將硝酸纖維素膜黏貼上(所述硝酸纖維素膜上與所述PVC板上的兩個圓孔相對應的圓形區(qū)域包被有CLB-BSA的T區(qū)條帶和包被有羊抗鼠二抗的C區(qū)條帶，C區(qū)條帶靠近吸水紙端，T區(qū)條帶靠近膠體金保護墊端)；在硝酸纖維素膜上部的一側(cè)粘貼上吸水紙，該吸水紙與硝酸纖維素膜部分重疊；在硝酸纖維素膜上部相對于吸水紙而言的另一側(cè)粘貼上膠體金保護墊，該膠體金保護墊與硝酸纖維素膜部分重疊；在膠體金保護墊上相對于硝酸纖維素膜而言的另一側(cè)貼上玻璃纖維，該玻璃纖維與膠體金保護墊部分重疊。配制不同濃度的CLB標準液進行檢測。(5)結(jié)合光電型傳感器定量檢測鹽酸克倫特羅將顯色后好的試紙條剪切成尺寸為3X0. 9cm的條子，放到光電型傳感器上進行檢測，光電型傳感器產(chǎn)生電信號強度與試紙條的顏色深淺呈反比，一般肉眼觀測不到的顏色，光電型傳感器也讀出光電信號值，根據(jù)電信號的強度，間接計算出鹽酸克倫羅的濃度， 從而可以定量檢測鹽酸克倫特羅。實施例3本實施例的免疫膠體金試紙條的制備及其和光電型傳感器相結(jié)合定量檢測鹽酸克倫特羅的方法步驟如下(I)膠體金溶液的制備在制備免疫膠體金試紙條之前，把所需要的實驗儀器酸泡20h，首選制備膠體金溶液，用量筒量取IOOmL的蒸餾水，加入1%氯金酸400 iiL，加熱到沸騰時，再加入1%的檸檬酸三鈉500 y L，加熱到溶液呈紫紅色，關小火再燒10分鐘即可。(2)膠體金保護墊的制作用干凈的移液管吸取IOmL的膠體金溶液到小燒杯中，吸取15 ii L的抗體加入ImL的Tris-HCl緩沖液中，將其混合液在攪拌的過程中加入膠體金溶液中，等50min后，用碳酸鉀條PH大于8. 5，等一段時間后，加入牛血清白蛋白(BSA) 150 u L，等一段時間之后，將其均勻分裝到6個離心管離心，棄其上清液，用洗滌劑(吸取聚乙二醇200070ii L、碳酸鉀 220 u L、聚乙烯二醇70 u L，Tris-HCl緩沖液22mL配制成洗滌劑)洗滌，再離心一次，棄掉上清液，收集紅色沉淀，將其均勻的滴加到膠體金保護墊上。(3)在硝酸纖維素膜的圓孔處滴加二抗和抗原將硝酸纖維素膜在封阻劑(取7%脫脂奶粉8g/L，加入0. 4g/L的甘氨酸，配制成封阻劑)中搖晃40min，用圓規(guī)在硝酸纖維素膜上制作兩個直徑為Icm的圓孔用洗液搶吸取15y L的羊抗鼠二抗和CLB-BSA偶聯(lián)物均勻的滴加到制作的圓孔處，用封阻劑進行封閉 50min，蒸餾水沖洗，取出自然晾干，備用。(4)膠體金免疫試紙條的組裝取一定長度的PVC板，采用機械沖壓打孔法，在PVC板上中部等距離制作兩個直徑為Icm的圓孔，對齊將硝酸纖維素膜黏貼上(所述硝酸纖維素膜上與所述PVC板上的兩個圓孔相對應的圓形區(qū)域包被有CLB-BSA的T區(qū)條帶和包被有羊抗鼠二抗的C區(qū)條帶，C區(qū)條帶靠近吸水紙端，T區(qū)條帶靠近膠體金保護墊端)；在硝酸纖維素膜上部的一側(cè)粘貼上吸水紙，該吸水紙與硝酸纖維素膜部分重疊；在硝酸纖維素膜上部相對于吸水紙而言的另一側(cè)粘貼上膠體金保護墊，該膠體金保護墊與硝酸纖維素膜部分重疊；在膠體金保護墊上相對于硝酸纖維素膜而言的另一側(cè)貼上玻璃纖維，該玻璃纖維與膠體金保護墊部分重疊。配制不同濃度的CLB標準液進行檢測。(5)結(jié)合光電型傳感器定量檢測鹽酸克倫特羅將顯色后的試紙條剪切成尺寸為3X0. 9cm的條子，放到光電型傳感器上進行檢測，光電型傳感器產(chǎn)生的電信號的強度與試紙條的顏色深淺呈反比，一般肉眼觀測不到的顏色，光電型傳感器也讀出光電信號值，根據(jù)電信號的強度，間接計算出鹽酸克倫羅的濃度，從而可以定量檢測鹽酸克倫特羅。實施例4本實施例的免疫膠體金試紙條的制備及其和光電型傳感器相結(jié)合定量檢測鹽酸克倫特羅的方法步驟如下(I)膠體金溶液的制備在制備免疫膠體金試紙條之前，把所需要的實驗儀器酸泡24h，首選制備膠體金溶液，用量筒量取300mL的蒸餾水，加入1%氯金酸500 iiL，加熱到沸騰時，再加入1%的檸檬酸三鈉400 u L，加熱到溶液呈紫紅色，關小火再燒8分鐘即可。(2)膠體金保護墊的制作用干凈的移液管吸取IOmL的膠體金溶液到小燒杯中，吸取20 ii L的抗體加入ImL 的Tris-HCl緩沖液中，將其混合液在攪拌的過程中加入膠體金溶液中，等60min后，用碳酸鉀調(diào)PH大于8. 5，等一段時間后，加入牛血清白蛋白(BSA) 200 u L，等一段時間之后，將其均勻分裝到6個離心管中離心，棄其上清液，用洗滌劑(吸取聚乙二醇2000100U L、碳酸鉀 300 u L、聚乙烯二醇100 u L，Tris-HCl緩沖液30mL配制成洗滌劑)洗滌，再離心一次，棄掉上清液，收集紅色沉淀，將其均勻的滴加到膠體金保護墊上。(3)在硝酸纖維素膜的圓孔處滴加二抗和抗原
將硝酸纖維素膜在封阻劑(取10%脫脂奶粉10g/L，加入0. 5g/L的甘氨酸，配制成封阻劑)中搖晃60min，用圓規(guī)在硝酸纖維素上面制作兩個直徑為Icm的圓孔用洗液搶吸取20y L的羊抗鼠二抗和CLB-BSA偶聯(lián)物均勻的滴加到制作的圓孔處，用封阻劑進行封閉 60min，蒸餾水沖洗，取出自然晾干，備用。(4)膠體金免疫試紙條的組裝取一定長度的PVC板，采用機械沖壓打孔法，在PVC板上中部等距離制作兩個直徑為Icm的圓孔，對齊將硝酸纖維素膜黏貼上(所述硝酸纖維素膜上與所述PVC板上的兩個圓孔相對應的圓形區(qū)域包被有CLB-BSA的T區(qū)條帶和包被有羊抗鼠二抗的C區(qū)條帶，C區(qū)條帶靠近吸水紙端，T區(qū)條帶靠近膠體金保護墊端)；在硝酸纖維素膜上部的一側(cè)粘貼上吸水紙，該吸水紙與硝酸纖維素膜部分重疊；在硝酸纖維素膜上部相對于吸水紙而言的另一側(cè)粘貼上膠體金保護墊，該膠體金保護墊與硝酸纖維素膜部分重疊；在膠體金保護墊上相對于硝酸纖維素膜而言的另一側(cè)貼上玻璃纖維，該玻璃纖維與膠體金保護墊部分重疊。配制不同濃度的CLB標準液進行檢測。(5)結(jié)合光電型傳感器定量檢測鹽酸克倫特羅將顯色后的試紙條剪切成尺寸為3X0. 9cm的條子，放到光電型傳感器上進行檢測，光電型傳感器產(chǎn)生的電信號強度與試紙條的顏色深淺呈反比，一般肉眼觀測不到的顏色，光電型傳感器也讀出光電信號值，根據(jù)電信號的強度，間接計算出鹽酸克倫羅的濃度， 從而可以定量檢測鹽酸克倫特羅。綜上所述，本發(fā)明靶物質(zhì)針對性強，準確率高，檢測速度快，顯色后的免疫膠體金試紙條在光電型傳感器上檢測時間為2min，克服了傳統(tǒng)免疫膠體金試紙條檢測CLB的缺陷，實現(xiàn)了定量檢測鹽酸克倫特羅，同時還具有檢測迅速、特異性強、操作簡便、便于攜帶、 可實現(xiàn)現(xiàn)場檢測等優(yōu)點，可滿足出入境、海關和超市等部門機構(gòu)定量檢測CLB的要求，具有很好的應用前景。
權(quán)利要求
1.一種免疫膠體金試紙條，包括玻璃纖維、膠體金保護墊、支撐板、NC膜和吸水紙，其特征在于，所述吸水紙、NC膜、膠體金保護墊、玻璃纖維設置在所述支撐板上并依次相互部分重疊；所述支撐板上設有兩個圓孔，所述NC膜上與所述支撐板上的兩個圓孔相對應的圓形區(qū)域包被有CLB-BSA的T區(qū)條帶和包被有羊抗鼠二抗的C區(qū)條帶，所述膠體金保護墊含有膠體金標記的抗鹽酸克倫特羅的抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的免疫膠體金試紙條，其特征在于，所述支撐板為PVC板，所述圓孔為1cm。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的免疫膠體金試紙條，其特征在于，所述膠體金保護墊含有的抗鹽酸克倫特羅抗體的體積為4 20 μ L。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫膠體金試紙條，其特征在于，所述膠體金保護墊的制備方法如下a、制備膠體金溶液；b、將4 20μ L的抗鹽酸克倫特羅的抗體加入ImL的Tris-HCl緩沖液中，混合攪拌過程中加入IOml膠體金溶液,攪拌10 60min后,用碳酸鉀調(diào)pH大于8. 5,而后加入100 200 μ L BSA,靜置、離心，棄上清液，用洗滌液洗滌，再離心一次，棄上清液，收集紅色沉淀， 將其均勻的滴加到保護墊上，即得。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫膠體金試紙條，其特征在于，所述步驟a具體為在 100 300mL蒸餾水中，加入I %的氯金酸100 500 μ L，加熱到沸騰時，再加入1%的檸檬酸三鈉100 500 μ L，繼續(xù)加熱到溶液呈紫紅色后低溫維持3 lOmin，即得。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的免疫膠體金試紙條，其特征在于，所述步驟b中洗滌劑由聚乙二醇2000 10 100 μ L、碳酸鉀100 300 μ L、聚乙烯二醇10 100 μ L和Tris-HCl 緩沖液10 30ml配制而成。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的免疫膠體金試紙條，其特征在于，所述硝酸纖維素膜上包被的CLB-BSA和羊抗鼠二抗的體積為2 20 μ L。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的免疫膠體金試紙條，其特征在于，所述硝酸纖維素膜的制備方法如下a、制備CLB-BSA ；b、在所述硝酸纖維素膜上與支撐板上兩圓孔相對應的圓形區(qū)域均勻的滴加2 20μ L 的羊抗鼠二抗和CLB-BSA，用封阻劑封閉20 60min，蒸餾水沖洗，取出自然晾干，即得。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的免疫膠體金試紙條，其特征在于，所述CLB-BSA制備方法如下取CLBlOmg,加入2mL預冷的O. 2mol/L鹽酸至全部溶解,冷卻至零度，30min后，加入 120mg NaNO2溶液，然后將上述溶液加入4mL O. lmol/L的碳酸鹽緩沖液中，混勻后在零度靜止Ih,以SephadexG50凝膠純化，用ρΗ7· 4的O. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液洗脫，_20°C保存?zhèn)溆茫凰鎏妓猁}緩沖液中含有40mg的BSA。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的免疫膠體金試紙條，其特征在于，所述封阻劑由I 10%脫脂奶粉2 10g/L和O. I O. 5g/L的甘氨酸配制而成。
11.一種用如權(quán)利要求I所述的免疫膠體金試紙條和光電傳感器定量檢測CLB的方法， 其特征在于，包括如下步驟a、經(jīng)測試后的免疫膠體金試紙條，放在光電傳感器的測試區(qū)內(nèi)檢測；b、光電型傳感器將檢測區(qū)域反射的光轉(zhuǎn)換成電信號，根據(jù)電信號的強度，計算出CLB 的濃度。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述免疫膠體金試紙條和光電傳感器定量檢測CLB的方法，其特征在于，步驟a中所述測試后的免疫膠體金試紙條剪切成3cmX0. 9cm大小的條子后再進行檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種免疫膠體金試紙及其配合光電傳感器定量檢測CLB的方法。該免疫膠體金試紙條包括設置在支撐板上并依次相互部分重疊的吸水紙、NC膜、膠體金保護墊、玻璃纖維；所述支撐板上設有兩個圓孔，所述NC膜上與所述支撐板上的兩個圓孔相對應的圓形區(qū)域包被有CLB-BSA的T區(qū)條帶和包被有羊抗鼠二抗的C區(qū)條帶，所述膠體金保護墊含有膠體金標記的抗鹽酸克倫特羅的抗體。本發(fā)明定量檢測CLB的方法，步驟如下經(jīng)測試后的免疫膠體金試紙條，放在光電傳感器的測試區(qū)內(nèi)檢測；光電型傳感器將檢測區(qū)域反射的光轉(zhuǎn)換成電信號，根據(jù)電信號的強度，計算出CLB的濃度。本發(fā)明具有能夠定量檢測、檢測迅速、特異性強、操作簡便、便于攜帶等優(yōu)點。
文檔編號G01N21/27GK102590518SQ20121002788
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月8日
發(fā)明者劉國艷, 尹璐, 張洪才, 柴春彥 申請人:上海交通大學