專利名稱：一種植物油中植物甾醇的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食用油營養(yǎng)添加劑檢測的技術(shù)領(lǐng)域，具體的涉及ー種植物油中植物甾醇的檢測方法。
背景技術(shù)：
植物油是植物留醇含量較為豐富的食品之一，而其中玉米油中的植物留醇含量較高。近年來，隨著心血管疾病的頻繁發(fā)生，人們的保健意識也隨之增強，植物留醇作為ー種極具營養(yǎng)價值的營養(yǎng)添加劑廣泛用于食品中以降低人體膽固醇。植物留醇對人體具有較強的抗炎作用，具有能夠抑制人體對膽固醇的吸收、促進(jìn)膽固醇的降解代謝、抑制膽固醇的生 化合成等作用；用于預(yù)防治療冠狀動脈粥樣硬化類的心臟病，對治療潰瘍、皮膚鱗癌、宮頸癌等有明顯的療效；可促進(jìn)傷ロ愈合，使肌肉增生、增強毛細(xì)血管循環(huán)；還可作為膽結(jié)石形成的阻止劑?，F(xiàn)有植物留醇的檢測方法主要有酶法、化學(xué)特征反應(yīng)鑒定法、薄層層析法、紅外光譜法、氣相色譜法等。其中酶法只能測定總留醇含量，不能檢測各留醇組分分別的含量，這些方法操作過程復(fù)雜，成本高，安全性能差。應(yīng)用化學(xué)特征反應(yīng)鑒定法、薄層層析法、紅外光譜法等普遍存在的缺點是鑒定能力低，對樣品的純度要求高，有的甚至安全性很差。應(yīng)用氣相色譜法檢測因使用高壓以及可燃性氣體，從而對其的安全性要求較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對上述存在的缺陷而提供ー種植物油中植物留醇的檢測方法，該方法操作簡單，精確度、安全性高，經(jīng)濟實恵。本發(fā)明的技術(shù)方案為ー種植物油中植物留醇的檢測方法，其步驟如下(1)樣品的處理首先稱取O. Ig Ig樣品放于皂化瓶中，然后在皂化瓶中加入30mL 50mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%的KOH水溶液和70mL IOOmL的無水こ醇(分析純)，搖勻，最后加入3 4顆沸石；(2)樣品的皂化待步驟(I)完成后，將皂化瓶接于回流冷凝管上，在溫度為90°C 100°C的條件下進(jìn)行皂化，皂化時間為2h 3h ;(3)提取皂化物待步驟(2)皂化完成后，用30mL 50mL的無水こ醚(分析純)提取劑提取皂化瓶中與沸石上的皂化物，將提取液轉(zhuǎn)入分液漏斗I中，靜置待提取液分層后上層液體留于分液漏斗I中，將下層液體移入分液漏斗II中，然后在分液漏斗II中加入無水こ醚(分析純)進(jìn)行反復(fù)提取3 4次，靜置分層后將分液漏斗II中的上層液體與分液漏斗I的上層液體合并，得到最終的こ醚提取液；(4)乙醚提取液的處理用30 mL 50mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的NaCL水溶液反復(fù)清洗步驟(3)所得的こ醚提取液，振蕩分層，棄去下層液體，重復(fù)清洗直到棄去的下層液體呈中性，得到的上層液體即為所需提取物；(5)提取物的處理將步驟(4)中所得的提取物通過盛有5g無水硫酸鈉的過濾器進(jìn)行過濾，將所得的濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器的圓底蒸發(fā)瓶中，然后將圓底蒸發(fā)瓶連接蒸發(fā)儀器進(jìn)行提取劑無水こ醚的蒸發(fā)，待無水こ醚完全蒸發(fā)后，得到所需植物甾醇，取下圓底蒸發(fā)瓶用純乙醇多次清洗溶解圓底蒸發(fā)瓶中的植物甾醇，然后轉(zhuǎn)入到IOOmL容量瓶中用純乙醇定容,最后經(jīng)0. 45um的微孔濾膜過濾于25mL容量瓶中，試樣的制備完成；
(6)試樣的測試用進(jìn)樣針吸取步驟(5)所得的試樣18 uL 22uL，在進(jìn)樣溫度為40°C 50°C,波長為200 nm 250nm,流速為0. 5 mL/min I. 2mL/min的條件下米用高效液相色譜儀得到色譜圖，然后利用外標(biāo)法將色譜圖中各留醇的峰面積與相對應(yīng)留醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線對照得出試樣中各甾醇的濃度。所述步驟(6)中高效液相色譜外標(biāo)法的標(biāo)準(zhǔn)曲線制備步驟如下用進(jìn)樣針分別吸取濃度為 lmg/ml、0. 8mg/ml、0. 6mg/ml、0.4mg/ml、0.2 mg/ml>0 mg/ml 的對照品溶液 18uL 22uL，依照步驟(6)所選定的進(jìn)樣條件進(jìn)樣溫度40°C 50°C，波長200 nm 250nm，流速0. 5 mL/min I. 2mL/min,測定各濃度下的峰面積值，以進(jìn)樣溶液濃度為縱坐標(biāo),相應(yīng)的峰面積為橫坐標(biāo)，繪制得標(biāo)準(zhǔn)曲線。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明的檢測方法在提取皂化物時所采用的提取劑為無水乙醚(分析純)，無水乙醚的毒性低，價格低廉，氣味比較溫和，對人體沒有太大傷害，并且根據(jù)單一變量原則，在本發(fā)明所述的檢測步驟及檢測條件下分別采用正己烷、丙酮、乙醚三種不同的提取劑進(jìn)行對比實驗，得出無水乙醚對留醇的提取效果好，雜質(zhì)少，使得后續(xù)試樣檢測所出的色譜圖雜質(zhì)峰少，各留醇的峰面積大，便于進(jìn)一步的分析。
下面通過三例實驗對比進(jìn)行詳細(xì)說明。實驗一 (I)樣品的處理首先稱取Ig樣品放于皂化瓶中，然后在皂化瓶中加入30mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%的KOH水溶液和70mL的無水乙醇(分析純)，搖勻，最后加入3 4顆沸石；(2)樣品的皂化待步驟(I)完成后，將皂化瓶接于回流冷凝管上，在溫度為95°C的條件下進(jìn)行皂化，皂化時間為2. 5h ；(3)提取皂化物待步驟(2)皂化完成后，用50mL的正己烷提取劑提取皂化瓶中與沸石上的皂化物，將提取液轉(zhuǎn)入分液漏斗I中，靜置待提取液分層后上層液體留于分液漏斗I中，將下層液體移入分液漏斗II中，然后在分液漏斗II中加入正己烷進(jìn)行反復(fù)提取3 4次，靜置分層后將分液漏斗II中的上層液體與分液漏斗I的上層液體合并，得到最終的正己烷提取液；(4)正己烷提取液的處理用30 mL 50mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的NaCL水溶液反復(fù)清洗步驟(3)所得的正己烷提取液，振蕩分層，棄去下層液體，重復(fù)清洗直到棄去的下層液體呈中性，得到的上層液體即為所需提取物；(5)提取物的處理將步驟(4)中所得的提取物通過盛有5g無水硫酸鈉的過濾器進(jìn)行過濾，將所得的濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器的圓底蒸發(fā)瓶中，然后將圓底蒸發(fā)瓶連接蒸發(fā)儀器進(jìn)行提取劑正己烷的蒸發(fā)，待正己烷完全蒸發(fā)后，得到所需植物留醇，取下圓底蒸發(fā)瓶用純乙醇多次清洗溶解圓底蒸發(fā)瓶中的植物甾醇，然后轉(zhuǎn)入到IOOmL容量瓶中用純乙醇定容，最后經(jīng)0. 45um的微孔濾膜過濾于25mL容量瓶中，試樣的制備完成；(6)試樣的測試用進(jìn)樣針吸取步驟(5)所得的試樣20uL，在進(jìn)樣溫度為45°C，波長為210nm，流速為I mL/min的條件下利用高效液相色譜儀所得的最終色譜圖見圖I。實驗二 (I)樣品的處理首先稱取Ig樣品放于皂化瓶中，然后在皂化瓶中加入 30mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%的KOH水溶液和70mL的無水乙醇(分析純)，搖勻，最后加入3 4顆沸石；(2)樣品的皂化待步驟(I)完成后，將皂化瓶接于回流冷凝管上，在溫度為95°C的條件下進(jìn)行皂化，皂化時間為2. 5h ；(3)提取皂化物待步驟(2)皂化完成后，用50mL的丙酮提取劑提取皂化瓶中與沸石上的皂化物，將提取液轉(zhuǎn)入分液漏斗I中，靜置待提取液分層后上層液體留于分液漏斗I中，將下層液體移入分液漏斗II中，然后在分液漏斗II中加入丙酮進(jìn)行反復(fù)提取3 4次，靜置分層后將分液漏斗II中的上層液體與分液漏斗I的上層液體合并，得到最終的丙酮提取液；(4)丙酮提取液的處理用30 mL 50mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的NaCL水溶液反復(fù)清洗步驟(3)所得的丙酮提取液，振蕩分層，棄去下層液體，重復(fù)清洗直到棄去的下層液體呈中性，得到的上層液體即為所需提取物；(5)提取物的處理將步驟
(4)中所得的提取物通過盛有5g無水硫酸鈉的過濾器進(jìn)行過濾，將所得的濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器的圓底蒸發(fā)瓶中，然后將圓底蒸發(fā)瓶連接蒸發(fā)儀器進(jìn)行提取劑丙酮的蒸發(fā)，待丙酮完全蒸發(fā)后，得到所需植物留醇，取下圓底蒸發(fā)瓶用純乙醇多次清洗溶解圓底蒸發(fā)瓶中的植物甾醇，然后轉(zhuǎn)入到IOOmL容量瓶中用純乙醇定容，最后經(jīng)0. 45um的微孔濾膜過濾于25mL容量瓶中，試樣的制備完成；(6)試樣的測試用進(jìn)樣針吸取步驟(5)所得的試樣20uL，在進(jìn)樣溫度為45°C，波長為210nm，流速為I mL/min的條件下利用高效液相色譜儀所得的最終色譜圖見圖2。實驗三(I)樣品的處理首先稱取Ig樣品放于皂化瓶中，然后在皂化瓶中加入 30mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%的KOH水溶液和70mL的無水乙醇(分析純)，搖勻，最后加入3 4顆沸石；(2)樣品的皂化待步驟(I)完成后，將皂化瓶接于回流冷凝管上，在溫度為95°C的條件下進(jìn)行皂化，皂化時間為2. 5h ；(3)提取皂化物待步驟(2)皂化完成后，用50mL的無水乙醚(分析純)提取皂化瓶中與沸石上的皂化物，將提取液轉(zhuǎn)入分液漏斗I中，靜置待提取液分層后上層液體留于分液漏斗I中，將下層液體移入分液漏斗II中，然后在分液漏斗II中加入無水乙醚進(jìn)行反復(fù)提取3 4次，靜置分層后將分液漏斗II中的上層液體與分液漏斗I的上層液體合并，得到最終的乙醚提取液；(4)乙醚提取液的處理用30 mL 50mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的NaCL水溶液反復(fù)清洗步驟(3)所得的乙醚提取液，振蕩分層，棄去下層液體，重復(fù)清洗直到棄去的下層液體呈中性，得到的上層液體即為所需提取物；(5)提取物的處理將步驟(4)中所得的提取物通過盛有5g無水硫酸鈉的過濾器進(jìn)行過濾，將所得的濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器的圓底蒸發(fā)瓶中，然后將圓底蒸發(fā)瓶連接蒸發(fā)儀器進(jìn)行提取劑無水乙醚的蒸發(fā)，待無水乙醚完全蒸發(fā)后，得到所需植物留醇，取下圓底蒸發(fā)瓶用純乙醇多次清洗溶解圓底蒸發(fā)瓶中的植物甾醇，然后轉(zhuǎn)入到IOOmL容量瓶中用純乙醇定容,最后經(jīng)0. 45um的微孔濾膜過濾于25mL容量瓶中，試樣的制備完成；(6)試樣的測試用進(jìn)樣針吸取步驟(5)所得的試樣20uL，在進(jìn)樣溫度為45°C，波長為210nm，流速為I mL/min的條件下利用高效液相色譜儀所得的最終色譜圖見圖3。由上述實驗一、實驗二、實驗三以及相應(yīng)的圖I、圖2、圖3分析可得無水乙醚對甾醇的提取效果好，雜質(zhì)少，使得后續(xù)試樣檢測所出的色譜圖雜質(zhì)峰少，各留醇的峰面積大，便于進(jìn)一步的分析。本發(fā)明所述檢測方法中在對提取液進(jìn)行清洗時所使用的是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的NaCL水溶液，在溫度較低的情況下提取液的乙醚層和水層很難分離，若用去離子水清洗時分層效果不明顯而且極易乳化，從而增加了清洗時間，造成植物留醇的流失，而NaCL是強電解質(zhì)，可以破壞膠體溶液的雙電子層結(jié)構(gòu)，使之聚合，所以用一定濃度的NaCL水溶液可以將提取液中乙醚層里的水清洗出來，縮短清洗時間，減少植物留醇的流失。本發(fā)明所述的檢測方法操作簡單，精確度、安全性高，經(jīng)濟實惠，該檢測方法在較溫和的檢測條件下進(jìn)行，不會破壞樣品的性質(zhì)。


圖I為采用正己烷作為提取劑進(jìn)行實驗所得色譜圖。其中36為菜籽甾醇，37為豆甾醇，38為菜油甾醇，41為β谷甾醇。圖2為采用丙酮作為提取劑進(jìn)行實驗所得色譜圖。其中29為菜籽甾醇，30為豆甾醇，31為菜油甾醇，34為β谷甾醇。圖3為采用こ醚作為提取劑進(jìn)行實驗所得色譜圖。其中19為菜籽甾醇，20為豆甾醇，21為菜油甾醇，24為β谷甾醇。 圖4為豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖5菜油甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。 圖6 β谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖7菜籽甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實施例方式下面通過實施例一對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。實施例一
(I)樣品的處理首先稱取Ig樣品放于皂化瓶中，然后在皂化瓶中加入30mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%的KOH水溶液和70mL的無水こ醇(分析純)，搖勻，最后加入3 4顆沸石；(2)樣品的皂化待步驟(I)完成后，將皂化瓶接于回流冷凝管上，在溫度為95°C的條件下進(jìn)行皂化，皂化時間為2. 5h ；(3)提取皂化物待步驟(2)皂化完成后，用50mL的無水こ醚(分析純)提取皂化瓶中與沸石上的皂化物，將提取液轉(zhuǎn)入分液漏斗I中，靜置待提取液分層后上層液體留于分液漏斗I中，將下層液體移入分液漏斗II中，然后在分液漏斗II中加入無水こ醚進(jìn)行反復(fù)提取3 4次，靜置分層后將分液漏斗II中的上層液體與分液漏斗I的上層液體合并，得到最終的こ醚提取液；(4)こ醚提取液的處理用30 mL 50mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的NaCL水溶液反復(fù)清洗步驟(3)所得的こ醚提取液，振蕩分層，棄去下層液體，重復(fù)清洗直到棄去的下層液體呈中性，得到的上層液體即為所需提取物；(5)提取物的處理將步驟
(4)中所得的提取物通過盛有5g無水硫酸鈉的過濾器進(jìn)行過濾，將所得的濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器的圓底蒸發(fā)瓶中，然后將圓底蒸發(fā)瓶連接蒸發(fā)儀器進(jìn)行提取劑無水こ醚的蒸發(fā)，待無水こ醚完全蒸發(fā)后，得到所需植物留醇，取下圓底蒸發(fā)瓶用純こ醇多次清洗溶解圓底蒸發(fā)瓶中的植物甾醇，然后轉(zhuǎn)入到IOOmL容量瓶中用純こ醇定容，最后經(jīng)O. 45um的微孔濾膜過濾于25mL容量瓶中，試樣的制備完成；(6)試樣的測試用進(jìn)樣針吸取步驟(5)所得的試樣20uL，在進(jìn)樣溫度為45°C，波長為210nm，流速為I mL/min的條件下采用高效液相色譜儀得到色譜圖，然后利用外標(biāo)法將色譜圖中各留醇的峰面積與相對應(yīng)留醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線對照得出試樣中各留醇的濃度，高效液相色譜儀所得色譜圖見圖3。所述步驟(6)中高效液相色譜外標(biāo)法的標(biāo)準(zhǔn)曲線制備步驟如下用進(jìn)樣針分別吸取濃度為 lmg/ml、0. 8mg/ml、0. 6mg/ml、O. 4mg/ml>0. 2 mg/ml>0 mg/ml 的對照品溶液20uL,依照步驟(6)所選定的進(jìn)樣條件進(jìn)樣溫度50°C,波長210nm,流速I. 2mL/min,測定各濃度下的峰面積值，以進(jìn)樣溶液濃度為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為橫坐標(biāo)，繪制得標(biāo)準(zhǔn)曲線。豆甾醇、菜油甾醇、β谷甾醇、菜籽甾醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線如下。
①豆甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制見表格I、圖4。表格I :豆甾醇對照品溶液進(jìn)樣數(shù)據(jù)。
權(quán)利要求
1.一種植物油中植物留醇的檢測方法，其步驟如下(1)樣品的處理首先稱取0.Ig Ig樣品放于皂化瓶中，然后在皂化瓶中加入30mL 50mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%的KOH水溶液和70mL IOOmL的無水乙醇(分析純),搖勻,最后加入3 4顆沸石；(2)樣品的阜化待步驟(I)完成后，將皂化瓶接于回流冷凝管上，在溫度為90°C 100°C的條件下進(jìn)行皂化，皂化時間為2h 3h ；(3)提取皂化物待步驟(2)皂化完成后，用30mL 50mL的無水乙醚(分析純)提取劑提取皂化瓶中與沸石上的皂化物，將提取液轉(zhuǎn)入分液漏斗I中，靜置待提取液分層后上層液體留于分液漏斗I中，將下層液體移入分液漏斗II中，然后在分液漏斗II中加入無水乙醚(分析純)進(jìn)行反復(fù)提取3 4次，靜置分層后將分液漏斗II中的上層液體與分液漏斗I的上層液體合并，得到最終的乙醚提取液；(4)乙醚提取液的處理用30 mL 50mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的NaCL水溶液反復(fù)清洗步驟(3)所得的乙醚提取液，振蕩分層，棄去下層液體，重復(fù)清洗直到棄去的下層液體呈中性，得到的上層液體即為所需提取物；(5)提取物的處理將步驟(4)中所得的提取物通過盛有5g無水硫酸鈉的過濾器進(jìn)行過濾，將所得的濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器的圓底蒸發(fā)瓶中，然后將圓底蒸發(fā)瓶連接蒸發(fā)儀器進(jìn)行提取劑無水乙醚的蒸發(fā)，待無水乙醚完全蒸發(fā)后，得到所需植物留醇，取下圓底蒸發(fā)瓶用純乙醇多次清洗溶解圓底蒸發(fā)瓶中的植物甾醇，然后轉(zhuǎn)入到IOOmL容量瓶中用純乙醇定容,最后經(jīng)0. 45um的微孔濾膜過濾于25mL容量瓶中，試樣的制備完成；(6)試樣的測試用進(jìn)樣針吸取步驟(5)所得的試樣18 uL 22uL，在進(jìn)樣溫度為40°C 50°C，波長為200 nm 250nm,流速為0. 5 mL/min I. 2mL/min的條件下采用高效液相色譜儀得到色譜圖,然后利用外標(biāo)法將色譜圖中各留醇的峰面積與相對應(yīng)留醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線對照得出試樣中各甾醇的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的植物油中植物留醇的檢測方法，其特征在于，所述步驟(6)中高效液相色譜外標(biāo)法的標(biāo)準(zhǔn)曲線制備步驟如下用進(jìn)樣針分別吸取濃度為lmg/ml、0. 8mg/ml、0.6mg/ml、0.4mg/ml、0.2 mg/ml>0 mg/ml 的對照品溶液 18 uL 22uL,依照步驟(6)所選定的進(jìn)樣條件進(jìn)樣溫度40°C 50°C,波長200 nm 250nm,流速0. 5 mL/min I. 2mL/min，測定各濃度下的峰面積值，以進(jìn)樣溶液濃度為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為橫坐標(biāo)，繪制得標(biāo)準(zhǔn)曲線。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種植物甾醇的檢測方法，采用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測，其主要包括以下步驟樣品制備，所述樣品制備包括試樣的皂化、乙醚提取皂化物、水洗乙醚提取物、過濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)溶劑收集濾液、微孔濾膜抽濾并定容；樣品測試包括樣品進(jìn)樣、檢測結(jié)果的分析。本發(fā)明檢測方法樣品制備簡單，成本較低，設(shè)備條件要求不高，且操作簡潔。
文檔編號G01N30/06GK102636583SQ201210075758
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月21日
發(fā)明者王月華, 王洪堯, 王萍 申請人:山東三星玉米產(chǎn)業(yè)科技有限公司