一種新型檢測內(nèi)外源性胰島素的免疫質(zhì)譜試劑盒的制作方法【專利摘要】本發(fā)明涉及內(nèi)源性胰島素、外源性胰島素的免疫質(zhì)譜試劑盒及制備方法，屬于蛋白質(zhì)檢測【
技術(shù)領(lǐng)域：
】，該試劑盒包括一小管含C14同位素標(biāo)記的內(nèi)、外源性胰島素的標(biāo)準(zhǔn)品；一小管含抗胰島素抗體的磁珠；一小管緩沖液；一小管洗脫液；一小管能量吸收分子飽和溶液，上述各小管置于4℃冷藏盒中。本發(fā)明可用于體外樣品檢測和預(yù)后判斷的免疫質(zhì)譜試劑盒。本方法精確、方便且快捷。【專利說明】一種新型檢測內(nèi)外源性胰島素的免疫質(zhì)譜試劑盒【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及一種非侵入性檢測、評估糖尿病病人試劑盒的新方法，其特征是采用質(zhì)譜[0002]法對樣品中已被特異性抗體捕獲的胰島素進(jìn)行精確地鑒別、檢測?！?br>背景技術(shù)：
】[0003]不論是細(xì)胞的正常功能還是病理特性都在一定程度上取決于細(xì)胞所表達(dá)的蛋白質(zhì)功能。因此，鑒定人體內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)的區(qū)別，可用于體外疾病樣本的篩查，并最終用于藥物開發(fā)和疾病治療。而要進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)和功能的差異化分析，要求能夠達(dá)到分辨細(xì)胞內(nèi)分子的復(fù)雜混合物的程度。但細(xì)胞內(nèi)許多物質(zhì)往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用這些常規(guī)手段難以進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)序列鑒定分析；用抗體-質(zhì)譜聯(lián)合可克服這一技術(shù)缺點(diǎn)。[0004]胰島素是由胰島β細(xì)胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的激動而分泌的一種蛋白質(zhì)激素。先分泌的是由84個氨基酸組成的長鏈多肽-胰島素原(pro-1nsulin)，經(jīng)專一性蛋白酶-胰島素原轉(zhuǎn)化酶(PCl和PC2)和羧肽酶E的作用，將胰島素原中間部分(C鏈)切下，而胰島素原的羧基端部分(A鏈)和氨基端部分(B鏈)通過二硫鍵結(jié)合在一起形成胰島素，人類內(nèi)源性胰島素分子量為5807.6460。成熟的胰島素儲存在胰島β細(xì)胞內(nèi)的分泌囊泡中，以與鋅離子配位的六聚體方式存在。在外界刺激下胰島素隨分泌囊泡釋放至血液中，并發(fā)揮其生理作用。胰島素的分泌分成兩部分，一部分幫助維持空腹血糖正常而分泌的胰島素，稱為基礎(chǔ)胰島素；基礎(chǔ)胰島素是胰島細(xì)胞24小時持續(xù)脈沖式分泌的胰島素，主要用于維持空腹血糖水平的正常；另一部分則是為了降低餐后血糖升高、維持餐后血糖正常而分泌的胰島素，稱為餐時胰島素。餐時胰島素的早時相分泌控制了餐后血糖升高的幅度和持續(xù)時間，其主要的作用是抑制肝臟內(nèi)源性葡萄糖的生成。通過該作用機(jī)制，血糖在任何時間均被控制在接近空腹?fàn)顟B(tài)的水平；餐后血糖的峰值在7.0mmol/L以下,并且血糖水平高于5.5mmol/L的時間不超過30分鐘。I型糖尿病患者在確診糖尿病之前，大部分患者胰島β細(xì)胞發(fā)生自身免疫性破壞，導(dǎo)致餐時和基礎(chǔ)胰島素分泌均減少。2型糖尿病患者胰島β細(xì)胞功能異常進(jìn)展緩慢，常常表現(xiàn)為外周胰島素抵抗，但是也同時存在胰島素一相分泌減少，因而可以出現(xiàn)空腹血糖正常而餐后血糖升高的情況。最終，餐后血糖水平可達(dá)到非糖尿病的生理狀態(tài)時的4倍，并且在進(jìn)餐后血糖升高持續(xù)數(shù)小時，以至于在下一餐前仍然顯著升高。[0005]目前彌補(bǔ)餐時胰島素分泌不足的外源性胰島素制劑有牛胰島素(分子量為5733.5666)、豬胰島素(分子量為5777.6197)、InsulinGlargine(分子量為6064.1110)坐寸ο[0006]美國糖尿病學(xué)會(ADA)與歐洲糖尿病學(xué)會(EASD)指南均建議，在生活方式干預(yù)和口服糖尿病治療后，如果血糖控制仍不滿意，應(yīng)盡早開始胰島素治療，且首選基礎(chǔ)胰島素與口服降糖藥合用。若此療法仍不能控制血糖，根據(jù)該指南的治療線路圖，建議在此基礎(chǔ)上在就餐時再加用速效胰島素。目前用于彌補(bǔ)基礎(chǔ)胰島素不足的制劑主要有基礎(chǔ)胰島素類似物地特胰島素等。胰島素由胰島素降解酶(insulindegradingenzyme,IDE)降解。胰淀素和β淀粉樣多肽也是IDE的底物。[0007]傳統(tǒng)用于胰島素檢測試劑盒及制備方法為ELISA等傳統(tǒng)免疫分析技術(shù)，ELISA等傳統(tǒng)免疫分析技術(shù)主要依靠間接的化學(xué)或放射測定法。舉例講，胰島素的檢測試劑盒制備方法為先將抗胰島素抗體(第一個抗體)結(jié)合至固相表面(如玻璃)，然后將含胰島素的樣品(如血清)，加至這個已標(biāo)有抗胰島素抗體的容器中；這樣，胰島素就會結(jié)合至抗體上，然后洗脫未結(jié)合的物質(zhì)；再加上已標(biāo)有酶、放射性或化學(xué)發(fā)光性的抗胰島素抗體(第二個抗體)，這樣就可以檢測出胰島素的總含量。這種方法學(xué)的缺點(diǎn)是無法測出胰島素的單個氨基酸變異(如胰島素的N或C端丟失了一個或數(shù)個氨基酸，胰島素被甲基，?；刃揎?，胰島素的異構(gòu)體)；即通常被用于傳統(tǒng)檢測胰島素試驗(yàn)是檢測所謂的總胰島素量。[0008]因?yàn)閭鹘y(tǒng)胰島素檢測常常是針對病人胰島素總體水平，無法直接鑒定內(nèi)源性胰島素與外源性胰島素水平，這樣就增加了胰島素個體化活性水平控制的難度。[0009]目前在進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析時還沒有發(fā)現(xiàn)一個用于臨床直接鑒定內(nèi)源性胰島素與外源性胰島素檢測的標(biāo)準(zhǔn)化免疫質(zhì)譜試劑盒。【
發(fā)明內(nèi)容】[0010]本發(fā)明的目的是克服已有技術(shù)的不足之處，提出一種用于檢測內(nèi)源性胰島素與外源性胰島素的免疫質(zhì)譜試劑盒及制備方法，該試劑盒為內(nèi)源性胰島素與外源性胰島素檢測提供了新的途徑，并為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的內(nèi)源性胰島素生物標(biāo)志提供了基礎(chǔ)。[0011]本發(fā)明提出的用于檢測內(nèi)源性胰島素與外源性胰島素的免疫質(zhì)譜試劑盒，其特征在于,該試劑盒包括:[0012]一小管含C14同位素標(biāo)記的內(nèi)、外源性胰島素的標(biāo)準(zhǔn)品，10?30μI;[0013]一小管含抗胰島素抗體的磁珠，30?50μI;[0014]一小管緩沖液，300?500μ1，該緩沖液為50?IOOmMPBS,pH值為7.0?8.0;[0015]一小管洗脫液，10?50μI,該洗脫液為I?5%三氟乙酸的水溶液；[0016]一小管能量吸收分子飽和溶液，5?10μL，該溶液由能量吸收分子溶解在含30?60%乙腈和0.5?I%三氟乙酸的水溶液中構(gòu)成，該能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羥基苯甲酸之中的任一種；上述各小管置于4°C冷藏盒中。[0017]本發(fā)明提出的上述免疫質(zhì)譜試劑盒制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟:[0018]I)含內(nèi)、外源性胰島素的標(biāo)準(zhǔn)品的制備:[0019]用重組DNA技術(shù)，將載內(nèi)源性人胰島素的基因系列寡核苷酸注入大腸桿菌內(nèi)，合成時，加入C14同位素-精氨酸，使合成的內(nèi)源性人胰島素帶有C14同位素；用質(zhì)譜測試C14同位素標(biāo)記的內(nèi)源性胰島素的標(biāo)準(zhǔn)品分子量為5809.6460；[0020]所述人胰島素其化學(xué)結(jié)構(gòu)為:[0021]A鏈:GIVEQCCTSICSLYQLENYCN[0022]B鏈:FVNQHLCGSHLVEALYLVCGER(C14)GFFYTPKT[0023]注:B鏈22位合成中加入了同位素C14-精氨酸(R_)[0024]同理，用重組DNA技術(shù)，將載外源性豬胰島素的基因系列寡核苷酸注入大腸桿菌內(nèi)，合成時，加入C14同位素-精氨酸，使合成的外源性豬胰島素帶有C14同位素；用質(zhì)譜測試C14同位素標(biāo)記的外源性豬胰島素的標(biāo)準(zhǔn)品分子量為5779.6197；[0025]2)制備含抗胰島素抗體的磁珠:基質(zhì)是任何能與抗體選擇性或特異性結(jié)合的物質(zhì)。舉例說明，ProteinA、ProteinG可選擇性或特異性結(jié)合抗體的Fe位點(diǎn)。洗去基質(zhì)未吸附的物質(zhì)；用Carbodiimide方法(CarbodiimideMethod)將帶有羧酸基團(tuán)標(biāo)記的磁性珠上基質(zhì)與抗胰島素抗體的氨基基團(tuán)結(jié)合(GunnDL,etal.PreparationofsensitiveandstableerythrocytesbythecarbodiimidemethodforthedetectionofprimaryandsecondaryIgMandIgGantibody.JImmunolMethods.1972;I(4):381-389.)，或用streptavidin標(biāo)記的磁性珠上基質(zhì)與biotin標(biāo)記的抗胰島素抗體結(jié)合；置磁性處理器上，15?25°C孵育20?40分鐘，除去液體；[0026]3)配制50?IOOmMPBS(Phosphate-BufferedSaline)，pH值為7.0?8.0緩沖液、配制I?5%三氟乙酸的洗脫液，分別分裝成300?500μI小管和10?50μI小管；[0027]4)將能量吸收分子溶解于30?60%乙腈和0.5?1%三氟乙酸的水溶液中，制成能量吸收分子飽和溶液，并分裝成5?10μI小管，該能量吸收分子可采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羥基苯甲酸之中的任一種；[0028]5)將上述分裝好的各小管置于4°C冷藏箱中。[0029]免疫質(zhì)譜試劑盒檢測胰島素的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)步驟包括:[0030]1.稀釋:將生物樣品先用緩沖液稀釋30?50倍，將樣品充分混勻；[0031]2.結(jié)合:將上述標(biāo)本100μI加至標(biāo)有特異性抗體的磁珠的PCR管中，置磁性處理器上，15?25°C孵育20?40分鐘，除去液體；[0032]3.洗去非特異結(jié)合:加100μI緩沖液至已裝好磁珠的PCR管，置磁性處理器上孵育I?5分鐘，除去液體，重復(fù)上述操作兩次；[0033]4.洗脫:加10μI洗脫液I?5分鐘，洗脫標(biāo)本至上清液；[0034]5.離子化:取5μI上清液移至另一個PCR管中，加入5μI能量吸收分子飽和溶液充分混勻；[0035]6.取IμI混合溶液加樣至質(zhì)譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然干燥金屬片;[0036]7.將上述金屬片加入質(zhì)譜儀中，就會生成質(zhì)譜；[0037]8.外部使用多肽分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來校正質(zhì)量精確性，所有樣本均進(jìn)行雙份檢測以減少實(shí)驗(yàn)誤差。[0038]上述的生物標(biāo)志是利用一臺質(zhì)譜儀來檢測的；該設(shè)備的質(zhì)量精確度約為0.001%。[0039]用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，通過分析血清蛋白指紋峰，發(fā)現(xiàn)下述生物標(biāo)志可以用于區(qū)分內(nèi)、夕卜源性人胰島素變異表達(dá)(表一)。[0040]表一、區(qū)分內(nèi)、外源性人胰島素[0041]【權(quán)利要求】1.一種檢測內(nèi)源性胰島素、外源性胰島素的免疫質(zhì)譜試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括:一小管含C14同位素標(biāo)記的內(nèi)、外源性胰島素的標(biāo)準(zhǔn)品，10?30μI;一小管含抗胰島素抗體的磁珠，30?50μI;一小管緩沖液，300?500μ1，該緩沖液為50?IOOmMPBS,pH值為7.0?8.0;一小管洗脫液，10?50μI,該洗脫液為I?5%三氟乙酸的水溶液；一小管能量吸收分子飽和溶液，5?10μ1，該溶液由能量吸收分子溶解在含30?60%乙腈和0.5?I%三氟乙酸的水溶液中構(gòu)成，上述各小管置于4°C冷藏盒中。2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述能量吸收分子采用肉桂酸衍生物、芥子酸、二羥基苯甲酸之中的任一種?！疚臋n編號】G01N27/62GK103454433SQ201210180866【公開日】2013年12月18日申請日期:2012年6月5日優(yōu)先權(quán)日:2012年6月5日【發(fā)明者】許洋申請人:許洋