一種c-肽定量測定試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于糖尿病的輔助診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及人體血清或尿液中c-肽定量測 定的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是由于胰島素分泌缺陷或胰島素作用障礙所致的以高血糖為特征的代謝 性疾病。C-肽是胰島細(xì)胞的分泌產(chǎn)物，它與胰島素有一個共同的前體一一胰島素原。一個 分子的胰島素原經(jīng)酶切后，裂解成一個分子的胰島素和一個分子的C-肽。在使用胰島素治 療的糖尿病病人中，胰島素的測定會受到外源性胰島素和外周循環(huán)抗體的干擾。但進(jìn)行胰 島素治療的病人所檢測到的胰島素抗體對C-肽沒有顯著干擾。C-肽從人體產(chǎn)生后，不被肝 細(xì)胞所攝取，主要在腎臟代謝并從腎臟排出體外。C-肽無生物活性，也不與細(xì)胞膜上的受體 結(jié)合，且不被降解C-肽的測定方法是比胰島素本身更為可靠的指示胰島素分泌水平的方 法。另外，對于應(yīng)用外源性胰島素的測定，由于C-肽與胰島素抗體無交叉反應(yīng)，不受胰島素 抗體干擾，外源性胰島素又不含C-肽，故C-肽測定顯得更為重要，從而了解胰島細(xì)胞功能 情況，對于指導(dǎo)治療有積極作用。
[0003] 目前臨床上用于測定C-肽的方法主要有放射免疫分析、酶聯(lián)免疫分析、時間分辨 熒光免疫分析和化學(xué)發(fā)光免疫分析等。放射免疫分析受方法本身工作原理的限制，其靈敏 度及抗干擾能力差，存在放射線輻射和污染等問題，已基本上退出市場。而酶聯(lián)免疫分析受 方法學(xué)的限制，特異性和靈敏性有待提高，一般作為初篩，現(xiàn)階段還不能作為定性、定量手 段。時間分辨熒光免疫分析進(jìn)行超微量分析的時候，會受到激發(fā)光的雜散光影響，進(jìn)而導(dǎo)致 靈敏度受到限制?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析較其它分析方法高靈敏度、高特異性、操作方便、線性 范圍廣、分析快，是現(xiàn)階段的主流分析方法。而找到一種新的、能替代化學(xué)發(fā)光免疫分析的 技術(shù)方法也是至關(guān)重要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明采用磁性分離技術(shù)與免疫反應(yīng)結(jié)合，通過采用吖啶酯或吖啶磺酰胺或磺酰 胺衍生物作為標(biāo)記物，提供一種高靈敏度、高特異性、操作方便、線性范圍廣、分析快速的C-肽定量檢測試劑盒。檢測樣本既可以是離體血清，也可以是離體尿液，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠， 且該C-肽定量測定試劑盒在制備過程中添加有防腐劑，使得該試劑盒保存年限久。
[0005] 本發(fā)明提供的利用化學(xué)發(fā)光磁性微粒免疫檢測技術(shù)，通過雙抗體夾心法定量檢測 人血清或尿液中C-肽含量的試劑盒，能快速檢測血清或尿液中C-肽含量，且檢測結(jié)果具有 很高的靈敏度和特異性。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下：
[0007] -種C-肽定量測定試劑盒，其特征在于:包括抗C-肽抗體包被的磁性微粒、[? 丫啶酯 標(biāo)記的抗C-肽抗體；
[0008]所述抗C-肽抗體包被的磁性微粒包括帶有羧基或?qū)妆交酋；拇判晕⒘?、抗C- 肽抗體、包被緩沖液、保存液、封閉液；
[0009] 所述吖啶酯標(biāo)記的抗c-肽抗體由標(biāo)記物、抗c-肽抗體、標(biāo)記緩沖液、保存液制備而 成;所述標(biāo)記物為吖啶酯或吖啶磺酰胺或吖啶磺酰胺衍生物中的任意一種。
[0010] 優(yōu)選地，所述帶有羧基的抗C-肽抗體包被的磁性微粒還包括活化劑和偶聯(lián)劑，所 述帶有羧基的抗C-肽抗體包被的磁性微粒的制備方法如下：
[0011 ] 1)配制所述包被緩沖液、封閉液、保存液、活化劑、偶聯(lián)劑；
[0012] 2)抗C-肽抗體預(yù)處理:取所述抗C-肽抗體用超濾離心管進(jìn)行離心，棄掉濾液，往濃 縮的抗體中加入包被緩沖液，繼續(xù)離心，重復(fù)4-6次，然后將離心管倒置離心，濃縮收集抗體 備用；
[0013] 3)制備抗C-肽抗體包被的磁性微粒:取所述帶有羧基的磁性微粒用包被緩沖液清 洗4-6次，磁分離去除上清液，加入活化劑和偶聯(lián)劑，用漩渦混合器充分混勻懸浮磁性微粒， 反應(yīng)30-40min;再用包被緩沖液清洗4-6次，磁分離架上去除上清液，添加步驟2)預(yù)處理過 的抗C-肽抗體，添加包被緩沖液，在25°C下，用漩渦混合器旋轉(zhuǎn)包被15-20小時;反應(yīng)完成后 用包被緩沖液清洗4-6次，磁分離去除上清液，加入封閉液，在25 °C下，用漩渦混合器旋轉(zhuǎn)包 被4-5小時，最后用保存液清洗4-6次，用保存液稀釋后，2-8 °C保存。
[0014] 優(yōu)選地，所述帶有甲苯磺酰基的抗c-肽抗體包被的磁性微粒還包括催化劑，所述 帶有甲苯磺酰基的抗C-肽抗體包被的磁性微粒的制備方法如下：
[0015] 1)配制所述包被緩沖液、封閉液、保存液、催化劑；
[0016] 2)抗C-肽抗體預(yù)處理:取所述抗C-肽抗體用超濾離心管進(jìn)行離心，棄掉濾液，往濃 縮的抗體中加入包被緩沖液，繼續(xù)離心，重復(fù)4-6次，然后將離心管倒置離心，濃縮收集抗體 備用；
[00?7] 3)制備抗C-肽抗體包被的磁性微粒:取所述帶有對甲苯磺?；拇判晕⒘Ｓ冒?緩沖液清洗4-6次，磁分離去除上清液，加入催化劑，用漩渦混合器充分混勻懸浮磁性微粒， 反應(yīng)30-40min;再用包被緩沖液清洗4-6次，磁分離去除上清液，添加步驟2)預(yù)處理過的抗 C-肽抗體，添加包被緩沖液，在25 °C下，用漩渦混合器旋轉(zhuǎn)包被15-20小時;反應(yīng)完成后用包 被緩沖液清洗4-6次，磁分離去除上清液，加入封閉液，在25 °C下，用漩渦混合器旋轉(zhuǎn)包被4-5小時，最后用保存液清洗4-6次，用保存液稀釋后，2-8 °C保存。
[0018] 優(yōu)選地，所述吖啶酯標(biāo)記的抗C-肽抗體的制備方法如下：
[0019] 1)配制所述標(biāo)記緩沖液、保存液；
[0020] 2)抗C-肽抗體預(yù)處理:取所述抗C-肽抗體用超濾離心管進(jìn)行離心，棄掉濾液，往濃 縮的抗體中加入標(biāo)記緩沖液，繼續(xù)離心，重復(fù)4-6次，然后將離心管倒置離心，濃縮收集抗體 備用；
[0021] 3)制備吖啶酯標(biāo)記的抗C-肽抗體:將所述標(biāo)記物加入步驟2)預(yù)處理的抗體中，添 加標(biāo)記緩沖液，避光37°C震蕩反應(yīng)16小時，反應(yīng)完成后，用快速高效蛋白純化系統(tǒng)純化，去 除未結(jié)合的標(biāo)記物，收集標(biāo)記的抗體，用保存液稀釋后，2-8 °C保存。優(yōu)選地，所述C-肽定量 測定試劑盒還包括樣本稀釋液、反應(yīng)清洗液、預(yù)激發(fā)液、激發(fā)液、C-肽標(biāo)準(zhǔn)品。
[0022]優(yōu)選地，所述樣本稀釋液為添加有表面活性劑和防腐劑的Tris緩沖液或MES緩沖 液或磷酸緩沖液。
[0023]優(yōu)選地，所述反應(yīng)清洗液為添加有表面活性劑和防腐劑、濃度為0.01M磷酸鹽緩沖 液組成。
[0024] 優(yōu)選地，所述預(yù)激發(fā)液為濃度為13_14g/L過氧化氫和濃度為3_4g/L硝酸組成的水 溶液。
[0025] 優(yōu)選地，所述激發(fā)液為氫氧化鈉水溶液。
[0026]優(yōu)選地，所述C-肽標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法如下：
[0027] (1)配制標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液；
[0028] (2)制備所述C-肽標(biāo)準(zhǔn)品：用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液溶解C-肽抗原，配制目標(biāo)濃度為60ng/ mL的C-肽抗原高濃度原液，采用C-肽標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)示，測出其實際濃度值，根據(jù)實際濃度 值，用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋配制不同濃度C-肽標(biāo)準(zhǔn)品，配制好的C-肽標(biāo)準(zhǔn)品分裝到西林瓶中， 每瓶lmL，凍干后，2-8°C保存。
[0029]本發(fā)明的有益技術(shù)效果如下：
[0030] 本發(fā)明采用磁性分離技術(shù)與免疫反應(yīng)結(jié)合，通過采用吖啶酯或吖啶磺酰胺或吖啶 磺酰胺衍生物作為標(biāo)記物，提供一種高靈敏度、高特異性、操作方便、線性范圍廣、分析快速 的C-肽定量測定試劑盒。檢測樣本既可以是血清，也可以是尿液，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，且該 C-肽定量測定試劑盒在制備過程中添加防腐劑，使得該試劑盒保存年限久，可保存一年之 久。
【具體實施方式】
[0031] 下面對本發(fā)明作進(jìn)一步說明：
[0032]本發(fā)明的C-肽定量測定試劑盒包括抗C-肽抗體包被的磁性微粒(M試劑）、吖啶酯 標(biāo)記的抗C-肽抗體(R試劑）、樣本稀釋液、C-肽標(biāo)準(zhǔn)品、反應(yīng)清洗液、預(yù)激發(fā)液、激發(fā)液。 [0033] 實施例一
[0034]該實施例中所述抗C-肽抗體包被的磁性微粒(M試劑)表面帶有羧基，其抗C-肽抗 體為單克隆抗體，磁性微粒粒徑為1.5μηι。
[0035]所述抗C-肽抗體包被的磁性微粒的制備方法如下：
[0036] (1)溶液的配制：
[0037]包被緩沖液:0.05Μ 2-(Ν-嗎啡啉）乙磺酸(MES)緩沖液，其中所述包被緩沖液ρΗ = 5.5；
[0038]活化劑：100mL包被緩沖液添加 lg二氯化乙烯(EDC);
[0039] 偶聯(lián)劑：100mL包被緩沖液添加2g N-羥基丁二酰亞胺(NHS);
[0040]封閉液：100mL包被緩沖液添加5g牛血清蛋白（BSA);
[00411 保存液：由濃度為25mM Tris-HCl溶液或MES溶液或者3-(N-嗎啉）丙磺酸溶液 (M0PS)、濃度為0.15M NaCl溶液、質(zhì)量百分比為0.5%BSA、質(zhì)量百分比為2%海藻糖或者蔗 糖、質(zhì)量百分比為1%疊氮鈉、質(zhì)量百分比為0.05%Tween-20或Triton X-100組成，其中所 述保存液pH=7.3。
[0042] (2)抗C-肽抗體包被的磁性微粒制備過程：
[0043] 取lmg抗C-肽抗體，用30K或50K的超濾離心管在8000-10000r/min下離心3_5min， 棄掉濾液及濾液中含有的疊氮鈉或一級胺，然后將濃縮的抗C-肽抗體加入包被緩沖液，繼 續(xù)離心，重復(fù)4-6次，將離心管倒置離心l-2min收集超濾過的抗體備用；取40-100mg帶羧基 的磁性微粒用包被緩沖液清洗4-6次，磁分離去除上清液，加入160yL活化劑和250yL偶聯(lián) 劑，用漩渦混合器充分混勻懸浮的磁性微粒，反應(yīng)30-40min，再用包被緩沖液清洗4-6次，磁 分離去除上清液，加入預(yù)處理過的抗體，添加包被緩沖液至總體積為lmL，在25°C下，