專利名稱：一種鑒別銀杏葉制劑中原花青素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于分析和鑒別分析物或待分析樣本中含有原花青素的方法，具體為銀杏葉制劑中是否有摻假其他來源原花青素的鑒別方法。
背景技術(shù)：
銀杏是目前世界上存活的最古老的樹種之一，其制劑、保健食品已經(jīng)成為當(dāng)今世界市場(chǎng)上最熱門的植物產(chǎn)品之一。銀杏葉提取物的藥用價(jià)值很高，具有拮抗血小板活化因子、清除自由基、抗炎、抗過敏、擴(kuò)張血管、保護(hù)心腦血管、改善外周血液循環(huán)、降低血清膽固
醇及輔助抗癌等多種藥理學(xué)活性。銀杏內(nèi)酯和黃酮是產(chǎn)生上述藥理學(xué)活性的主要成分，也是銀杏葉提取物的主要有效成分和質(zhì)量控制指標(biāo)。近年研究發(fā)現(xiàn)了銀杏中含原花青素，其同樣具有廣泛的藥理學(xué)活性，是銀杏葉制劑產(chǎn)生療效的又一主要成分。原花青素是一類由若干個(gè)兒茶素類化合物聚合而成，具有黃烷-3-醇結(jié)構(gòu)的植物多酹類化合物。原花青素在自然界中有多種亞型，包括Propelargonidin (單體為阿夫兒茶精和表阿夫兒茶精)、Procyanidin (單體為兒茶素和表兒茶素)、Prodelphinidin(單體為沒食子兒茶素和表沒食子兒茶素)、Profisetinidin (單體為非瑟酮醇和表非瑟酮醇)、Prorobinetinidin (單體為洋槐兒茶精和表洋槐兒茶精)。不同植物中的原花青素，其單體組成及比例都是不同的。大部分植物原花青素以兒茶素和表兒茶素組成的Procyanidin為主。而銀杏原花青素則主要由沒食子兒茶素和表沒食子兒茶素組成，即Prodelphinidin,其比例高達(dá)85%。到目前為止,Prodelphinidin僅發(fā)現(xiàn)存在于美國(guó)山核桃(Carya illionensis)的髓心及銀杏葉中。用于分析原花青素的方法有很多，曾有學(xué)者應(yīng)用正相-高效液相色譜法將可可、草莓的原花青素按聚合度大小進(jìn)行分離，這是一種有效的分析原花青素組成的手段。但目前，銀杏原花青素的研究仍處于起步階段，對(duì)銀杏葉制劑中原花青素的分析，包括定性和定量分析，均沒有文獻(xiàn)報(bào)道。由于現(xiàn)在國(guó)家銀杏葉制劑產(chǎn)品的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)較低，造成了有不法商人用別的低價(jià)產(chǎn)品摻入銀杏中制劑產(chǎn)品中，制備出檢測(cè)合格的銀杏葉制劑假貨，危害到人民群眾的用藥安全，危險(xiǎn)性極大。目前對(duì)銀杏黃酮的檢測(cè)已有專屬方法，但其要求較高，應(yīng)用受限。而銀杏葉制劑中原花青素的真假鑒別未見相關(guān)報(bào)道，因此在檢測(cè)方面是一個(gè)空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于分析銀杏葉制劑中原花青素的方法，該方法能去除絕大多數(shù)雜質(zhì)的干擾，快速將銀杏葉原花青素按聚合度的大小進(jìn)行分離，并根據(jù)不同來源原花青素圖譜的不同，用于鑒別銀杏制劑中有沒有摻假。本發(fā)明人在對(duì)銀杏葉制劑中原花青素研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，雖然多種植物中都含有原花青素，但由于植物來源不同，其中的原花青素含量不同，種類也不同，也表現(xiàn)出不同的功效。目前雖然對(duì)原花青素的相關(guān)研究較多，但都集中于單一來源的原花青素檢測(cè)，對(duì)不同來源的原花青素沒有進(jìn)行有效的比較，特別是對(duì)于兩種或多種不同來源的原花青素檢測(cè)沒有研究。對(duì)原花青素檢測(cè)則主要集中于含量，因此如市場(chǎng)上有低價(jià)格的原花青素產(chǎn)品如葡萄籽原花青素?fù)郊儆阢y杏葉原花青素中，目前沒有方法檢測(cè)出。而由于不同成分功效不同，這種摻假行為對(duì)產(chǎn)品的危害極大。因此一種簡(jiǎn)單、反應(yīng)靈敏、快速的對(duì)原花青素?fù)郊俚臋z測(cè)方法對(duì)保證人民用藥安全意義重大。本發(fā)明人在長(zhǎng)期研究中發(fā)現(xiàn)，銀杏葉中的原花青素和其它植物來源的原花青素不同，如目前市場(chǎng)上低價(jià)的葡萄籽原花青素每個(gè)聚合度均只出一個(gè)峰，而銀杏原花青素從二聚體開始，均有2 3個(gè)特征峰。如有效的加以利用，可成為鑒別銀杏葉中是否摻假其它原花青素的關(guān)鍵點(diǎn)。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了以下一種解決方法，主要包括以下內(nèi)容
I.銀杏葉制劑樣品前處理
由于銀杏葉制劑中雜質(zhì)成分會(huì)影響原花青素的測(cè)定，因此需要對(duì)銀杏葉制劑進(jìn)行前處理。前處理主要有三步1、將銀杏葉制劑制成水溶液并上樣于30-60目的聚酰胺樹脂；11、去除20%丙酮溶液洗脫部位；111、收集80%丙酮溶液洗脫部位并干燥后用適量甲醇使其完全溶解。根據(jù)銀杏葉制劑來源不同，固體制劑和液體制劑的上述前處理方法分述如下
(I)固體制劑將銀杏葉制劑粉碎后，用20%丙酮溶液超聲輔助溶解，過濾，去除不溶性
輔料；將濾液上樣于30 60目的聚酰胺樹脂，上樣完成后用3 4倍體積的20%丙酮溶液洗脫，棄去該部位的洗脫液；再用3 4倍體積的80%丙酮溶液洗脫，得80%丙酮部位的洗脫液；將80%丙酮部位洗脫液回收至無丙酮味，用等體積乙酸丁酯萃取2次，棄去有機(jī)相，回收水相至干；殘?jiān)眠m量甲醇使其完全溶解，即得甲醇溶解液。(2)液體制劑將銀杏葉制劑直接上樣于30 60目的聚酰胺樹脂，上樣完成后用3 4倍體積的20 %丙酮溶液洗脫，棄去該部位的洗脫液；再用3 4倍體積的80%丙酮溶液洗脫，80%丙酮部位的洗脫液；將80%丙酮部位洗脫液回收至無丙酮味，用等體積乙酸丁 酯萃取2次，棄去有機(jī)相，回收水相至干；殘?jiān)眠m量甲醇使其完全溶解，即得甲醇溶解液。2.正相-高效液相色譜去(NP-HPLC)分離上述甲醇溶解液，并用HPLC進(jìn)行檢測(cè)，其中NP-HPLC色譜條件如下
(1)固定相為phenomenex 二兀醇柱(250X4. 6 mm, 5 μ m)；
(2)流動(dòng)相為(A)乙腈，(B)甲醇/水/乙酸(95/3/2，V/V/V);流動(dòng)相梯度為O 10min 0 12%B ；10 10. 01 min 12 15%B ； 10. 01 30 min 15 45%B ；30 35 min 45%B ;35 40 min 45 0%B ；
(3)流速為I. O ml/min ；
(4)檢測(cè)波長(zhǎng)突光激發(fā)波長(zhǎng)276nm ;發(fā)射波長(zhǎng)316 nm ；
(5)進(jìn)樣量為20UL03.色譜圖對(duì)比
將上述方法所得的色譜圖，與純銀杏葉提取物色譜圖進(jìn)行對(duì)比，如有摻假情況，則色譜圖與純銀杏葉提取物色譜圖會(huì)有明顯不同。
通過上述方法可用于檢測(cè)銀杏葉制劑中原花青素是否有摻假，并且反應(yīng)非常靈敏，極少量的原花青素?fù)郊偌纯捎帽景l(fā)明方法檢測(cè)出，能檢測(cè)出銀杏葉提取物中摻O. 5%以上的其它來源原花青素，也就是O. 5%以上的原花青素?fù)郊倬涂赏ㄟ^本發(fā)明方法加以檢測(cè)鑒別。本發(fā)明不僅可用于銀杏葉提取物制劑中原花青素是否有摻假，還可用于含銀杏葉提取物的食品、保健品、醫(yī)藥品和/或化妝品，如銀杏葉片、銀杏葉注射液、銀杏葉膠囊保健品等等；涉及的摻假原花青素的來源包括葡萄籽\松樹片、蘋果、山楂、花生、番荔枝、野草毒、越橘、酸果曼、蓮房等等。通過本發(fā)明中的方法檢測(cè)銀杏葉制劑中的原花青素，受外界干擾少。本發(fā)明中對(duì)分析用樣本的前處理方法，可以去除絕大多數(shù)雜質(zhì)的干擾。采用本發(fā)明的方法對(duì)純銀杏葉提取物、銀杏葉片、銀杏葉膠囊、銀杏葉注射劑進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)圖譜形狀一致，在所有圖譜中均可見原花青素二聚體的兩個(gè)明顯特征峰、三聚體和四聚體特征峰。而其它檢測(cè)方法則因存在大量的雜質(zhì)，不能有效辨別其中的部分特征峰。說明本發(fā)明的方法特異性高，制劑中的其它成分不影響本發(fā)明方法的測(cè)定。
本發(fā)明人首先對(duì)純銀杏葉原花青素進(jìn)行了檢測(cè)，具體結(jié)果見實(shí)施例I。本發(fā)明中高效液相色譜法測(cè)定方法參見《中國(guó)藥典》2010年版I部附錄VI D高效液相色譜法，具體儀器條件等參見具體檢測(cè)過程及實(shí)施例。本發(fā)明適用于各種劑型的銀杏葉制劑中原花青素的分析和鑒別，前處理方法簡(jiǎn)單、操作步驟少；分析方法快速、準(zhǔn)確；鑒別真?zhèn)畏椒ㄈ菀?、判斷指?biāo)清晰明確。因此，本發(fā)明的方法對(duì)銀杏葉各種劑型的制劑、含銀杏葉提取物的食品、保健品、醫(yī)藥品和/或化妝品中原花青素的快速分析和鑒別，是合適的方法。借鑒并改良上述分析方法，使其適用并應(yīng)用于銀杏葉制劑中原花青素的分析，對(duì)于銀杏葉制劑標(biāo)準(zhǔn)的提高及產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)一步發(fā)展意義重大。


圖I為實(shí)施例I :銀杏葉原花青素(A)和葡萄籽原花青素(B)的NP-HPLC色譜2為實(shí)施例2 :銀杏葉片劑中原花青素的NP-HPLC色譜圖(A)樣I :未經(jīng)任何前處理的樣本；(B)樣2 :經(jīng)聚酰胺純化，未經(jīng)乙酸丁酯萃取的樣本；(C)樣3 :經(jīng)本發(fā)明方法完全前處理的樣本
圖3為實(shí)施例3 :銀杏葉膠囊劑中原花青素的NP-HPLC色譜4為實(shí)施例4 :銀杏葉注射劑中原花青素的NP-HPLC色譜5為實(shí)施例5 :摻假銀杏葉制劑中原花青素的NP-HPLC色譜圖(A)摻入O. 5%葡萄籽原花青素；(B)摻入I. 0%葡萄籽原花青素；(C)摻入2. 0%葡萄籽原花青素；(D)摻入4. 0%葡萄籽原花青素；(E)未摻假。
具體實(shí)施例方式 本發(fā)明結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說明如下
實(shí)施例I銀杏葉原花青素檢測(cè)及與葡萄籽原花青素的對(duì)比
取自制的銀杏原花青素提取物(原花青素含量為95%)和葡萄籽原花青素提取物(原花青素含量為96%)，分別溶于甲醇，過濾后，進(jìn)行HPLC檢測(cè)
設(shè)備Aglient 1200型高效液相色譜儀；Diamonsil C18色譜柱5 μ m 4. 6X 1 50mm色譜條件
(1)固定相為phenomenex 二兀醇柱(250X4. 6 mm, 5 μ m)；
(2)流動(dòng)相為(A)乙腈，(B)甲醇/水/乙酸(95/3/2，V/V/V);流動(dòng)相梯度為O 10min 0 12 %B ; 10 10. 01 min : 12 15 %B ; 10. 01 30 min : 15 45 %B ;30 35 min 45 %B ; 35 40 min :45 O %B ；
(3)流速為I. O ml/min ；
(4)檢測(cè)波長(zhǎng)突光激發(fā)波長(zhǎng)276nm ;發(fā)射波長(zhǎng)316 nm ；
(5)進(jìn)樣量為20UL0 結(jié)果見圖1，從HPLC色譜圖中可以發(fā)現(xiàn)，葡萄籽原花青素每個(gè)聚合度均只出一個(gè)峰，而銀杏原花青素從二聚體開始，均有2 3個(gè)特征峰，其原因是構(gòu)成銀杏的原花青素組成與葡萄籽的原花青素組成不同。實(shí)施例2銀杏葉片劑中原花青素的分析
樣品來源銀杏葉片(廠家浙江康恩貝制藥股份有限公司，批號(hào)20100709)
樣I :取片劑2片，研磨至細(xì)粉，用甲醇溶解，過濾，即得。樣2 :取片劑2片，研磨至細(xì)粉，用16ml 20%丙酮溶液、超聲輔助溶解，過濾，去除不溶性輔料；將濾液上樣于30 60目的聚酰胺樹脂，上樣完成后用3 4倍體積的20%丙酮溶液洗脫，棄去該部位；再用3 4倍體積的80%丙酮溶液洗脫，得80%丙酮部位；將80%丙酮部位回收至干；殘?jiān)眉状既芙?，即得甲醇溶解液。? :取片劑2片，研磨至細(xì)粉，用16ml 20%丙酮溶液、超聲輔助溶解，過濾，去除不溶性輔料；將濾液上樣于30 60目的聚酰胺樹脂，上樣完成后用3 4倍體積的20%丙酮溶液洗脫，棄去該部位；再用3 4倍體積的80%丙酮溶液洗脫，得80%丙酮部位；將80%丙酮部位回收至無丙酮味，用等體積乙酸丁酯萃取2次，棄去有機(jī)相，回收水相至干；殘?jiān)眉状既芙?，即得甲醇溶解液。上?個(gè)樣本，分別用實(shí)施例I中的色譜條件進(jìn)行原花青素的分離，結(jié)果見圖2。從HPLC色譜圖中可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過前處理的銀杏葉片劑(樣3)中，原花青素二聚體在14min左右和15min左右有兩個(gè)明顯的特征峰，同時(shí)三聚體和四聚體的特征峰也可分辨出來；未經(jīng)任何前處理的樣1，由于存在大量的雜質(zhì)，因此幾乎未出現(xiàn)原花青素的特征峰；經(jīng)聚酰胺樹脂純化、未經(jīng)有機(jī)溶劑萃取的樣2，在去除了大量的雜質(zhì)后，可以分辨出原花青素二聚體的兩個(gè)特征峰，但由于仍存在較多的雜質(zhì)，因此，三聚體較難辨別。實(shí)施例3銀杏葉膠囊劑中原花青素的分析
樣品來源天保寧膠囊(保健品，杭州康恩貝制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20110516)
取膠囊劑2片，打開膠囊，倒出內(nèi)容物，研磨至細(xì)粉，用16ml 20%丙酮溶液、超聲輔助溶解，過濾，去除不溶性輔料。將濾液上樣于30 60目的聚酰胺樹脂，上樣完成后用3 4倍體積的20%丙酮溶液洗脫，棄去該部位；再用3 4倍體積的80%丙酮溶液洗脫，得80%丙酮部位；將80%丙酮部位回收至無丙酮味，用等體積乙酸丁酯萃取2次，棄去有機(jī)相，回收水相至干；殘?jiān)眉状既芙猓吹眉状既芙庖?。用?shí)施例I中的色譜條件進(jìn)行原花青素的分離，結(jié)果見圖3。從HPLC色譜圖可清楚的分辨中原花青素二聚體的兩個(gè)明顯的特征峰，以及三聚體和四聚體的特征峰。
實(shí)施例4銀杏葉注射劑中原花青素的分析
樣品來源銀杏葉注射劑(德國(guó)威瑪舒培博士藥廠生產(chǎn)，批號(hào)20110423)
取銀杏葉注射劑一支，直接上樣于30 60目的聚酰胺樹脂，上樣完成后用3 4倍體積的20%丙酮溶液洗脫，棄去該部位；再用3 4倍體積的80%丙酮溶液洗脫，得80%丙酮部位；將80%丙酮部位回收至無丙酮味，用等體積乙酸丁酯萃取2次，棄去有機(jī)相，回收水相至干；殘?jiān)眉状既芙猓吹眉状既芙庖?。用?shí)施例I中的色譜條件進(jìn)行原花青素的分離，結(jié)果見圖4。由HPLC色譜圖同樣可清楚的分辨中原花青素二聚體的兩個(gè)明顯的特征峰，以及三聚體和四聚體的特征峰。實(shí)施例5摻假銀杏葉制劑中原花青素的分析
在銀杏葉提取物中模擬摻假葡萄籽提取物，并進(jìn)行了相關(guān)檢測(cè)。稱取自制4份銀杏提取物，分別為I. 99g、l. 98g、l. 96g、l. 92g ;依次加入葡萄籽提取物O. 01g、0. 02g、0. 04g、O. 08g，即摻假量分別為O. 5%、1. 0%、2. 0%、4. 0%。將上述四份摻假制劑分別用200ml 20%丙酮溶液、超聲輔助溶解，過濾，去除不溶性輔料；將濾液上樣于30 60目的聚酰胺樹脂，上樣完成后用3 4倍體積的20%丙酮溶液洗脫，棄去該部位；再用3 4倍體積的80%丙酮溶液洗脫，得80%丙酮部位；將80%丙酮部位回收至無丙酮味，用等體積乙酸丁酯萃取2次，棄去有機(jī)相，回收水相至干；殘?jiān)眉状既芙?，即得甲醇溶解液。用?shí)施例I中的色譜條件進(jìn)行原花青素的分離，結(jié)果見圖5。由HPLC色譜圖可得，摻入葡萄籽原花青素的銀杏提取物HPLC特征峰發(fā)生了明顯的改變①二聚體兩個(gè)峰的特征發(fā)生改變14min左右的峰為Procyanidin的二聚體峰，15min左右的峰為Prodelphinidin特有的二聚體峰，因此加入葡萄籽原花青素后，前峰較后峰的出峰強(qiáng)度更加明顯、峰高更高、峰面積更大?、?7min左右的Procyanidin三聚體峰，在未摻假制劑中，出峰不是很明顯，但加入葡萄籽原花青素后，該峰出峰強(qiáng)度明顯增加上述兩種改變的趨勢(shì)與葡萄籽原花青素加入量成正比。利用特征峰的變化和趨勢(shì)，可以鑒別真?zhèn)危梢苑浅Ｈ菀椎蔫b別出銀杏葉制劑中是否有摻假。上述摻假原花青素的來源還可包括松樹片、蘋果、山楂、花生、番荔枝、野草莓、越橘、酸果蔓、蓮房等。摻假后均可見最后所得色譜圖的明顯改變。
權(quán)利要求
1.一種鑒別銀杏葉制劑中原花青素的方法，鑒別銀杏葉制劑中是否摻假原花青素，包括以下步驟1)銀杏葉制劑的前處理1、將銀杏葉制劑制成水溶液并上樣于30-60目的聚酰胺樹脂；11、去除20%的丙酮溶液洗脫部位；111、收集80%的丙酮溶液洗膠部位并干燥后用適量甲醇使其完全溶解，獲得甲醇溶解液；2)正相-高效液相色譜法分離上述甲醇溶解液，其中正相-高效液相色譜條件如下固定相為phenomenex 二元醇柱,250X4. 6 mm, 5μ m ;流動(dòng)相為乙腈-甲醇/水/乙酸，其中乙腈為A，甲醇/水/乙酸為B，A+B=100%,甲醇/水/乙酸的體積比V/V/V為95/3/2 ;流動(dòng)相梯度為O 10 min 0 12 %B ；10 10. 01min 12 15%B ； 10. 01 30 min : 15 45 %B ；30 35 min 45 %B ；35 40 min 45 O%B ;流速為I. O ml/min ;檢測(cè)波長(zhǎng)熒光激發(fā)波長(zhǎng)276 nm ;發(fā)射波長(zhǎng)316 nm ;進(jìn)樣量為20μ L ;3)色譜圖對(duì)比將上述方法所得的色譜圖，與純銀杏葉提取物色譜圖進(jìn)行對(duì)比，如有摻假情況，則色譜圖與純銀杏葉提取物色譜圖會(huì)有明顯不同。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征是所述銀杏葉制劑為固體制劑，將銀杏葉固體制劑粉碎后，用20%丙酮溶液超聲輔助溶解，過濾，去除不溶性輔料；將濾液上樣于30 60目的聚酰胺樹脂，上樣完成后用3 4倍體積的20 %丙酮溶液洗脫，棄去該部位；再用3 4倍體積的80%丙酮溶液洗脫，得80%丙酮部位；將80%丙酮部位回收至無丙酮味，用等體積乙酸丁酯萃取2次，棄去有機(jī)相，回收水相至干；殘?jiān)眉状既芙猓吹勉y杏葉制劑甲醇溶解液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征是所述銀杏葉制劑為液體制劑，將銀杏葉制劑直接上樣于30 60目的聚酰胺樹脂，上樣完成后用3 4倍體積的20%丙酮溶液洗脫，棄去該部位的洗脫液；再用3 4倍體積的80%丙酮溶液洗脫，80%丙酮部位的洗脫液；將80%丙酮部位洗脫液回收至無丙酮味，用等體積乙酸丁酯萃取2次，棄去有機(jī)相，回收水相至干；殘?jiān)眠m量甲醇使其完全溶解，即得甲醇溶解液。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3所述的方法，其可用于含銀杏葉提取物的食品、保健品、醫(yī)藥品和化妝品中摻假原花青素的檢測(cè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3所述的方法，其特征是摻假原花青素的來源包括葡萄籽\松樹片、蘋果、山楂、花生、番蒸枝、野草莓、越橘、酸果蔓、蓮房。
全文摘要
本發(fā)明提供一種鑒別銀杏葉制劑、含銀杏葉提取物的食品、保健品、醫(yī)藥品和/或化妝品等樣本中是否含其他來源原花青素的分析鑒別方法，采用聚酰胺樹脂純化、有機(jī)溶劑萃取等方法前處理待檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，以固定相為phenomenex二元醇柱，250×4.6mm，5μm；(A)乙腈-(B)甲醇/水/乙酸(95/3/2，V/V/V)為流動(dòng)相；采用梯度洗脫，分別建立待檢銀杏葉制劑溶液樣品和標(biāo)準(zhǔn)銀杏葉制劑溶液標(biāo)準(zhǔn)品的正相-高效液相色譜圖，對(duì)比分析色譜圖。該鑒別方法，靈敏度高，分離度和重現(xiàn)性好，鑒別特征明顯，能夠準(zhǔn)確鑒別銀杏葉中摻0.5%以上的其它來源原花青素。
文檔編號(hào)G01N30/14GK102818863SQ20121018404
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月1日
發(fā)明者葉劍鋒, 喬洪翔, 方玲, 王如偉, 盛衛(wèi)國(guó), 閔會(huì), 馬麗萍, 姚建標(biāo) 申請(qǐng)人:浙江康恩貝制藥股份有限公司, 浙江現(xiàn)代中藥與天然藥物研究院有限公司