專利名稱：一種鑒別平滑型脂多糖和粗糙型脂多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物科技應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鑒別平滑型脂多糖和粗糙型脂多糖的方法。
背景技術(shù)：
白細(xì)胞分化抗原 14 (cluster of differentiation antigen, CD 14)是一種存在于單核細(xì)胞、巨曬細(xì)胞等細(xì)胞表面的分化抗原，為體內(nèi)介導(dǎo)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)生物效應(yīng)的重要受體之一。白細(xì)胞分化抗原14(CD14)包括膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14 (membrane bound CD14, mCD14)和可溶性白細(xì)胞分化抗原 14 (soluble CD14, sCD14)兩種形式膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)是分子量為55千道爾頓(KD)的糖蛋白，其C-末端借助糖基磷酯酰肌醇(glucose phosphatidyl inositol, GPI)結(jié)構(gòu)錨附于細(xì)胞膜表面；可溶性白細(xì)胞分化抗原14(sCD14)分子有49KD和55KD兩種形式，缺乏糖基磷酯酰肌醇(GPI)錨。膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)是由含有白細(xì)胞分化抗原14(CD14)基因的 單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，自行轉(zhuǎn)錄、翻譯蛋白質(zhì)多肽鏈，在高爾基復(fù)合體內(nèi)糖化后，其羧基端再與磷酯酰肌醇(phosphatidylinositol, PI)結(jié)合,并由磷酯酰肌醇的磷脂部分與細(xì)胞膜連接。生理?xiàng)l件下，膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14(mCD14)主要表達(dá)于成熟的單核巨噬細(xì)胞，微弱表達(dá)于中性粒細(xì)胞、腎小球膜細(xì)胞、乳房細(xì)胞和B細(xì)胞，mCD14介導(dǎo)脂多糖對這些細(xì)胞的激活作用。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞外膜的組成部分，其主要成分為脂多糖(lipopolysaccharide, LPS),脂多糖一旦進(jìn)入體內(nèi)，將誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)的反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體的嚴(yán)重?fù)p傷。脂多糖是一類特殊類型的磷脂，對哺乳類動物具有廣泛的生物學(xué)作用。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)，可以將脂多糖分為二大類，即光滑型脂多糖(Smooth Form LPS，S_LPS)和粗糙型脂多糖(Rough Form LPS，R_LPS)。這二類脂多糖在化學(xué)結(jié)構(gòu)、實(shí)驗(yàn)室制備及生物學(xué)活性等方面具有顯著差別。建立鑒別光滑型脂多糖(S-LPS)與粗糙型脂多糖(R-LPS)的方法，最終可以應(yīng)用于臨床細(xì)菌感染性疾病的診斷和治療在革蘭氏陰性細(xì)菌引起的炎癥反應(yīng)過程中，脂多糖受體起著關(guān)鍵作用，是脂多糖作用的重要門戶。白細(xì)胞分化抗原14(CD14)被認(rèn)為是脂多糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中最重要的脂多糖受體，白細(xì)胞分化抗原14在介導(dǎo)脂多糖激活靶細(xì)胞及炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用；研究表明，通過抑制白細(xì)胞分化抗原14破壞脂多糖所激活的靶細(xì)胞炎癥反應(yīng)是一個可行的治療方法。核糖核酸干擾(RNA interference, RNAi)是指由特定雙鏈核糖核酸(doublestranded RNA, dsRNA)引發(fā)同源信使核糖核酸(messenger RNA, mRNA)降解的轉(zhuǎn)錄后基因靜默機(jī)制。這類特定雙鏈核糖核酸被裂解成小(干擾)核糖核酸分子(SiRNAs)，并能導(dǎo)致同源信使核糖核酸(mRNA)在核糖核酸誘導(dǎo)的靜默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex,RISC)作用下降解。核糖核酸干擾(RNAi, Ribonucleic acid interference) RNA 是目前簡單而高效地阻斷哺乳動物細(xì)胞內(nèi)特異基因表達(dá)的最有效方法之一，可達(dá)到基因敲除效果，且安全性好。但對于核糖核酸干擾(RNAi)來說，并不是所有針對靶基因信使核糖核酸(mRNA)序列隨機(jī)合成的小核糖核酸分子(siRNAs)都能引起有效的基因沉默，干擾靶序列的選擇對干擾效率的影響是至關(guān)重要的。因此，對能有效抑制特異基因表達(dá)的小核糖核酸分子(siRNAs)的篩選是應(yīng)用核糖核酸干擾(RNAi)技術(shù)進(jìn)行基因功能、基因治療等相關(guān)研究的重要基礎(chǔ)。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標(biāo)本(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度。對于平滑型脂多糖和粗糙型脂多糖的區(qū)別檢測方法，現(xiàn)有技術(shù)的化學(xué)鑒別方法如酚-水法、苯酚-氯仿-石油醚法，均存在著步驟繁瑣，準(zhǔn)確率不夠理想的不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鑒別平滑型脂多糖和粗糙型脂多糖的方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)的化學(xué)鑒別方法步驟繁瑣，準(zhǔn)確率不夠理想的問題。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是，一種鑒別平滑型脂多糖和粗糙型脂多糖的方法，按照以下步驟具體實(shí)施
步驟I、根據(jù)膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14基因的序列，按照小干擾核糖核酸分子設(shè)計(jì)的基本原則，合成一對針對膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14的小干擾核糖核酸分子siRNA-224. 3 ；步驟2、將合成好的SiRNA-224. 3包裝慢病毒載體2. I)制備寡核苷酸在Lentivirus-shRNA模板中的loop結(jié)構(gòu)選用TTCAAGAGA ；在正義鏈模板的5’端添加T，與Hpa I酶切后形成的粘端互補(bǔ)；在反義鏈模板的5’端添加AGCT,與Xho I酶切后形成的粘端互補(bǔ)；T4連接酶連接而成重組載體；2. 2)對Lentivirus-shDNA模板退火,參照表1，配置退火體系表I Lentivirus-shDNA模板的退火體系
權(quán)利要求
1.一種鑒別平滑型脂多糖和粗糙型脂多糖的方法，其特征在于，該方法按照以下步驟具體實(shí)施 步驟I、根據(jù)膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14基因的序列，按照小干擾核糖核酸分子設(shè)計(jì)的基本原則，合成一對針對膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14的小干擾核糖核酸分子siRNA-224. 3 ； 步驟2、將合成好的siRNA-224. 3包裝慢病毒載體 ·2.I)制備寡核苷酸在Lentivirus-shRNA模板中的loop結(jié)構(gòu)選用TTCAAGAGA ;在正義鏈模板的5’端添加T，與Hpa I酶切后形成的粘端互補(bǔ)；在反義鏈模板的5’端添加AGCT，與Xho I酶切后形成的粘端互補(bǔ)；T4連接酶連接而成重組載體； · 2.2)對Lentivirus-shDNA模板退火,參照表I配置退火體系 表lLentivirus-shDNA模板的退火體系
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鑒別平滑型脂多糖和粗糙型脂多糖的方法，其特征在于所述的步驟4. I)中的設(shè)計(jì)引物采用膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14 :上游引物為5' -AAC TCGCTC AAT CTG TCT TTC AC-3'， 下游引物為5' -GCT CAT CTG GGC TAG GGT TC-3'； 甘油醛-3-磷酸脫氫酶 上游引物為5/ -TGT GTC CGT CGT GGA TCT GA-3'， 下游引物為5' -CCT GCT TCA CCA CCT TCT TGA-3'。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鑒別平滑型脂多糖和粗糙型脂多糖的方法，其特征在于所述的步驟4.I)中的電泳完畢后進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，其中的 一抗為兔抗膜結(jié)合型白細(xì)胞分化抗原14多克隆抗體，I :300倍稀釋，兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶單抗，I 1000倍稀釋； 二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G，I 3000倍稀釋。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒別平滑型脂多糖和粗糙型脂多糖的方法，首先合成能有效干擾小鼠mCD14基因表達(dá)的小干擾核糖核酸分子(siRNA-224.3)及陰性對照siRNA-NC，并制備成重組慢病毒；其次，將慢病毒感染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，并用嘌呤霉素篩選出陽性克隆，構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系siRNA-224.3、siRNA-NC；最后，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測分別用平滑型脂多糖和粗糙型脂多糖刺激條件下表達(dá)該小干擾核糖核酸分子的小鼠單核巨噬細(xì)胞穩(wěn)定細(xì)胞系細(xì)胞上清中的一氧化氮、腫瘤壞死因子α和白細(xì)胞介素6，通過比較其差異，實(shí)現(xiàn)鑒別平滑型脂多糖和粗糙型脂多糖。本發(fā)明的方法相比現(xiàn)有技術(shù)更加方便，準(zhǔn)確性更高。
文檔編號G01N33/68GK102778570SQ201210185198
公開日2012年11月14日 申請日期2012年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月5日
發(fā)明者杜麗, 焦寒偉, 王鳳陽, 雷明 申請人:海南大學(xué)