專利名稱：一種低分子肝素的離子對(duì)反相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種低分子肝素的離子對(duì)反相色譜與高分辨質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)方法，屬于藥物、原料藥、原料檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
肝素是一種糖胺聚糖類藥物，具有強(qiáng)抗凝作用，是治療血栓栓塞性疾病的首選藥物。低分子肝素是肝素經(jīng)化學(xué)方法或者酶法降解制備而成，常見(jiàn)的有依諾肝素鈉(Enoxaparin)、那屈肝素I丐(Nadroparin)和達(dá) 肝素鈉(Dalteparin)等。與肝素相比,低分子肝素抗血栓活性較高、抗凝活性較低，具有出血副作用小、生物利用度高、體內(nèi)半衰期長(zhǎng)等優(yōu)勢(shì)，受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注和應(yīng)用。由于肝素及低分子肝素具有強(qiáng)極性、不均一性、硫酸基團(tuán)不穩(wěn)定等特點(diǎn)，其結(jié)構(gòu)表征十分困難。通常分析低分子肝素的方法有凝膠電泳(Cowman M K, etal. Biochemical Journal, 1984，221 (3) : 707-716.)及 HPSEC 法(Ahsan A, et al. Journalof Pharmaceutical Sciences, 1995，84 (6) : 724-727.)，但通過(guò)這些方法僅能獲得非常粗略的分子量信息。用肝素酶將低分子肝素降解成肝素二糖，然后用離子對(duì)反相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析二糖組成是近年來(lái)比較常用的表征方法(Zhang F，et al. Analytical andBioanalytical Chemistry, 2011, 401 (9) :2793-2803.)，但由于檢測(cè)樣品為降解后的肝素二糖，導(dǎo)致該方法不能鑒定未經(jīng)破壞的完整低分子肝素糖鏈的結(jié)構(gòu)。除以上提及的方法外，美國(guó)藥典、歐洲藥典和中國(guó)藥典規(guī)定的低分子肝素的檢測(cè)方法也都是分析低分子肝素混合物，只能對(duì)混合物進(jìn)行表征，而不能對(duì)其中的各單一組分進(jìn)行直接的分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種低分子肝素的離子對(duì)反相色譜與高分辨質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)方法，可用于全譜圖鑒定低分子肝素原料藥和注射劑中主要肝素糖鏈的結(jié)構(gòu)。發(fā)明概述本發(fā)明利用離子對(duì)反相色譜與高分辨質(zhì)譜進(jìn)行聯(lián)用檢測(cè)低分子肝素的各個(gè)組分，通過(guò)離子對(duì)反相色譜分離樣品中各主要組分，并通過(guò)高分辨質(zhì)譜獲得精確的分子量，計(jì)算出其糖鏈序列信息，包括兩端結(jié)構(gòu)、糖鏈長(zhǎng)度、乙?；傲蛩峄〈鷶?shù)量，從而對(duì)低分子肝素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較精細(xì)的表征。發(fā)明詳述一種低分子肝素的離子對(duì)反相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)方法，步驟如下(I)將胺類離子對(duì)試劑溶解于去離子水,用pH調(diào)節(jié)試劑調(diào)pH值至5. 5 8. 5,制得濃度為10 30mM的流動(dòng)相A ;本步驟中所述濃度是指胺類離子對(duì)試劑中溶質(zhì)在流動(dòng)相A中的摩爾濃度；(2)將胺類離子對(duì)試劑溶解于體積百分比為75%的乙腈或體積百分比為75%甲醇溶液，用PH調(diào)節(jié)試劑調(diào)pH值至5. 5 8. 5，制得濃度為10 30mM的流動(dòng)相B ;本步驟中所述濃度是指胺類離子對(duì)試劑中溶質(zhì)在流動(dòng)相B中的摩爾濃度；(3)將待測(cè)低分子肝素樣品溶于流動(dòng)相A，配制成濃度為6 10mg/mL的待測(cè)溶液，經(jīng)過(guò)濾后，使用C18反相色譜柱；在流速8 12 μ L/min,洗脫梯度為0 5min，80%流動(dòng)相A, 20%流動(dòng)相B ;5 65min，40 80%流動(dòng)相A，20 60%流動(dòng)相B，檢測(cè)器波長(zhǎng)為232nm的條件下進(jìn)行檢測(cè)，得到紫外檢測(cè)色譜圖；(4)然后，通過(guò)在正離子模式或負(fù)離子模式下用高分辨質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，得到高分辨質(zhì)譜圖；(5)通過(guò)紫外檢測(cè)色譜圖確定低分子肝素的種類，然后根據(jù)步驟(4)獲得的高分辨質(zhì)譜圖獲得主要峰的質(zhì)荷比M，經(jīng)如下公式計(jì)算組分的精確分子量m 正離子模式m=zM-nX_zY負(fù)離子模式m=zM_nX+zY其中z表示電荷數(shù)，η表示離子對(duì)試劑分子個(gè)數(shù)，X表示離子對(duì)試劑的分子量，Y表不質(zhì)子氫的分子量；(6)然后使用計(jì)算機(jī)輔助方法進(jìn)行解譜，具體過(guò)程為通過(guò)計(jì)算機(jī)生成各肝素組分的分子量數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)庫(kù)變量為肝素鏈長(zhǎng)度、乙?；傲蛩峄〈鷶?shù)量，用步驟(5)中得到的精確分子量與數(shù)據(jù)庫(kù)中的理論分子量進(jìn)行比對(duì)獲得誤差值I，按誤差值I的大小對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行排列，然后，根據(jù)質(zhì)譜儀檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的誤差值II與誤差值I進(jìn)行比對(duì)，選取誤差值II與誤差值I最為接近的數(shù)據(jù)庫(kù)中的理論樣品，通過(guò)該理論樣品的信息即可獲知待測(cè)低分子肝素樣品的低分子肝素種類、肝素糖鏈長(zhǎng)度、乙?；傲蛩峄〈鷶?shù)量信息。所述步驟(I)中的胺類離子對(duì)試劑選自正丙胺、三正丙胺、正戊胺、正丁胺、正己胺。所述步驟(I)中的pH調(diào)節(jié)試劑為六氟異丙醇、甲酸。所述步驟(4)中的高分辨質(zhì)譜如采用離子阱時(shí)間飛行串聯(lián)質(zhì)譜儀(IT-T0F)，設(shè)定參數(shù)為正離子模式噴霧電壓+3. 6kV ;負(fù)離子模式噴霧電壓-3. OkV ;噴霧氣流速1. 5L/min ;掃描質(zhì)量范圍50 5000 ;如果采用四級(jí)桿時(shí)間飛行串聯(lián)質(zhì)譜儀(Q-T0F)，設(shè)定參數(shù)為正離子模式噴霧電壓+5. 5kV ;負(fù)離子模式噴霧電壓-4. OkV ;簾氣壓25psi ;噴霧氣壓30psi ;掃描質(zhì)量范圍50 4000。有益效果本發(fā)明可以檢測(cè)低分子肝素的種類和各單一組分的兩端結(jié)構(gòu)、糖鏈長(zhǎng)度、乙?；傲蛩峄〈鷶?shù)量，解決了現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)低分子肝素分子量不精確、無(wú)法檢測(cè)各單一組 分的問(wèn)題，對(duì)于提高肝素的檢測(cè)水平、保障藥品安全具有極大的實(shí)用價(jià)值。


圖I歐盟依諾肝素鈉對(duì)照品的紫外檢測(cè)色譜圖；圖2歐盟依諾肝素鈉對(duì)照品的總離子流圖；圖3歐盟依諾肝素鈉對(duì)照品的高分辨質(zhì)譜圖示例；圖4依諾肝素鈉注射液樣品的紫外檢測(cè)色譜圖；圖5依諾肝素鈉注射液樣品的總離子流圖6歐盟那屈肝素鈣對(duì)照品的紫外檢測(cè)色譜圖；圖7歐盟那屈肝素鈣對(duì)照品的總離子流圖；圖8歐盟達(dá)肝素鈉對(duì)照品的紫外檢測(cè)色譜圖；圖9歐盟達(dá)肝素鈉對(duì)照品的總離子流圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。液相色譜儀為Agilent 1100 series毛細(xì)管液相色譜儀,檢測(cè)器為二極管陣列檢測(cè)器，工作站為Agilent ChemStation ;質(zhì)譜為島津IT-TOF型高分辨質(zhì)譜，工作站為L(zhǎng)C-Solution0實(shí)施例I :一種低分子肝素的離子對(duì)反相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)方法，步驟如下I. I將正戊胺溶解于去離子水，用甲酸調(diào)pH值至7.0，制得正戊胺濃度為15mM的流動(dòng)相A ；
I. 2將正戊胺溶解于溶解于體積百分比為75%的乙腈溶液，用甲酸調(diào)pH值至7. O,制得正戊胺濃度為15mM的流動(dòng)相B ；1.3稱取一定量歐盟依諾肝素鈉對(duì)照品(批號(hào)出&丨吐/1於n° 4)，用流動(dòng)相A配置成8mg/mL的待測(cè)溶液,用O. 22 μ m的水相膜過(guò)濾后備用；I. 4使用填料粒徑為5 μ m、色譜柱內(nèi)徑為O. 5mm、色譜柱長(zhǎng)度為250mm的C18反相色譜柱；在流速10 μ L/min,洗脫梯度為0 5min,80%流動(dòng)相A, 20%流動(dòng)相B ;5 65min,40 80%流動(dòng)相A，20 60%流動(dòng)相B，檢測(cè)器波長(zhǎng)為232nm的條件下進(jìn)行檢測(cè)，得到紫外檢測(cè)色譜圖；I. 5使用島津IT-TOF高分辨質(zhì)譜在正離子模式下進(jìn)行檢測(cè)，得到高分辨質(zhì)譜圖，設(shè)定參數(shù)為噴霧電壓+3. 6kV ;噴霧氣流速1. 5L/min ;掃描質(zhì)量范圍50 5000。I. 6根據(jù)步驟I. 5中獲得的高分辨質(zhì)譜圖中獲得的主要峰的質(zhì)荷比M，經(jīng)如下公式計(jì)算組分的精確分子量m:m=zM-nX-zY其中z表示電荷數(shù)，η表示離子對(duì)試劑分子個(gè)數(shù)，X表示離子對(duì)試劑的分子量，Y表不質(zhì)子氫的分子量。I. 7通過(guò)計(jì)算機(jī)生成依諾肝素各組分的分子量數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)庫(kù)變量為肝素鏈長(zhǎng)度、乙?；傲蛩峄〈鷶?shù)量，用步驟I. 6中得到的精確分子量與數(shù)據(jù)庫(kù)中的理論分子量進(jìn)行逐一比對(duì)，獲得誤差值I，其計(jì)算公式如下誤差值I=(實(shí)測(cè)分子量-理論分子量)/理論分子量按誤差值I的大小對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行排列，然后，根據(jù)質(zhì)譜儀檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的誤差值II與誤差值I進(jìn)行比對(duì)，選取誤差值II與誤差值I最為接近的數(shù)據(jù)庫(kù)中的理論樣品，通過(guò)該理論樣品的信息即可獲知待測(cè)低分子肝素樣品的低分子肝素種類、肝素糖鏈長(zhǎng)度、乙?；傲蛩峄〈鷶?shù)量信息?？傠x子流圖(TIC)中所標(biāo)依諾肝素鈉樣品各組分的結(jié)構(gòu)信息如表I所示。表I
寡糖大小硫酸取代基數(shù)目
~Idp4*10S, 2NS
~2dp4*30S, 2NS
~dpi30S, 2NS
~dp630S, INS
~5dp6*30S, 2NS
~6dp630S, 2NS
~dp6*30S, 3NS
~8dp630S, 3NS
~9dp6*40S, 2NS
~10dp640S, 2NS
~Πdp8^OS
~12dp8*30S, 2NS
~13dp830S, 2NS
~14dp840S, INS
~15dplO*30S，INS
~16dplO30S, INS
~17dplO40S, INS
~18dplO*30S, 4NS
~19dplO40S, 2NS
20dplO*40S, 3NS
~ dplO*50S，2NS
22dplO*50S，3NS23^~dplO^~50S, 3NS
24dpl250S, INS
25dpl2*50S，2NS
26dpl250S, 2NS
27dpl260S, 2NS
28dpl4*60S, 3NS
29dpl670S, 2NS30dpl870S, 3NS dpl8 80S, 3NS
32dpl890S, 3NS
33dp2090S, 4NS
34dp22*60S, 5NS
35dp2470S, 6NS
36dp26*30S, 12NS注“*”表示糖鏈末端含內(nèi)醚結(jié)構(gòu)，“OS”表示“-0-S03H”，“NS”表示“-NH_S03H”，如“"60S，5NS”則表示這種組分還原末端含1，6內(nèi)醚結(jié)構(gòu)，有6個(gè)“-0_S03H”結(jié)構(gòu)，5個(gè)“-NH-S03H” 結(jié)構(gòu)。依諾肝素鈉對(duì)照品的紫外檢測(cè)色譜結(jié)果如圖1，由于依諾肝素鈉各組分在非還原端有不飽和雙鍵，故其在232mn處有紫外吸收。依諾肝素鈉對(duì)照品的質(zhì)譜分析示例如圖2，各組分的歸屬如圖3。通過(guò)本方法成功檢測(cè)到依諾肝素鈉對(duì)照品中從四糖到二十六糖的36種主要組分，并對(duì)其糖鏈長(zhǎng)度、末端結(jié)構(gòu)及“-o-so3h”和“-NH-S03H”數(shù)目進(jìn)行確定。實(shí)施例2 與實(shí)施例I的分析方法相同，不同之處在于所分析的樣品為依諾肝素鈉注射液(克賽，購(gòu)自法國(guó)AVENTIS Pharma Specialites公司，分裝批號(hào)7910)經(jīng)48h透析后冷凍干燥獲得的藥物有效成分。TIC中所標(biāo)依諾肝素鈉注射液樣品各組分的結(jié)構(gòu)信息如表2所
/Jn ο表權(quán)利要求
1.一種低分子肝素的離子對(duì)反相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)方法，其特征在于，步驟如下 (1)將胺類離子對(duì)試劑溶解于去離子水，用PH調(diào)節(jié)試劑調(diào)pH值至5.5 8. 5，制得濃度為10 30mM的流動(dòng)相A ； (2)將胺類離子對(duì)試劑溶解于體積百分比為75%的乙腈或體積百分比為75%甲醇溶液，用pH調(diào)節(jié)試劑調(diào)pH值至5. 5 8. 5，制得濃度為10 30mM的流動(dòng)相B ； (3)將待測(cè)低分子肝素樣品溶于流動(dòng)相A，配制成濃度為6 lOmg/mL的待測(cè)溶液，經(jīng)過(guò)濾后，使用C18反相色譜柱；在流速8 12 ii L/min,洗脫梯度為0 5min，80%流動(dòng)相A，20%流動(dòng)相B ;5 65min，40 80%流動(dòng)相A，20 60%流動(dòng)相B，檢測(cè)器波長(zhǎng)為232nm的條件下進(jìn)行檢測(cè)，得到紫外檢測(cè)色譜圖； (4)然后，通過(guò)在正離子模式或負(fù)離子模式下用高分辨質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，得到高分辨質(zhì)譜圖； (5)通過(guò)紫外檢測(cè)色譜圖確定低分子肝素的種類，然后根據(jù)步驟(4)獲得的高分辨質(zhì)譜圖獲得主要峰的質(zhì)荷比M，經(jīng)如下公式計(jì)算組分的精確分子量m : 正離子模式m=zM-nX_zY 負(fù)離子模式m=zM_nX+zY 其中z表示電荷數(shù)，n表示離子對(duì)試劑分子個(gè)數(shù)，X表示離子對(duì)試劑的分子量，Y表示質(zhì)子氫的分子量； (6)然后使用計(jì)算機(jī)輔助方法進(jìn)行解譜，具體過(guò)程為通過(guò)計(jì)算機(jī)生成各肝素組分的分子量數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)庫(kù)變量為肝素鏈長(zhǎng)度、乙?；傲蛩峄〈鷶?shù)量，用步驟(5)中得到的精確分子量與數(shù)據(jù)庫(kù)中的理論分子量進(jìn)行比對(duì)獲得誤差值I，按誤差值I的大小對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行排列，然后，根據(jù)質(zhì)譜儀檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的誤差值II與誤差值I進(jìn)行比對(duì)，選取誤差值II與誤差值I最為接近的數(shù)據(jù)庫(kù)中的理論樣品，通過(guò)該理論樣品的信息即可獲知待測(cè)低分子肝素樣品的低分子肝素種類、肝素糖鏈長(zhǎng)度、乙?；傲蛩峄〈鷶?shù)量信息。
2.如權(quán)利要求I所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(I)中的胺類離子對(duì)試劑選自正丙胺、三正丙胺、正戊胺、正丁胺、正己胺。
3.如權(quán)利要求I所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(I沖的pH調(diào)節(jié)試劑為六氟異丙醇、甲酸。
4.如權(quán)利要求I所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(4)中的高分辨質(zhì)譜采用離子阱時(shí)間飛行串聯(lián)質(zhì)譜儀，設(shè)定參數(shù)為正離子模式噴霧電壓+3. 6kV;負(fù)離子模式噴霧電壓-3. OkV ;噴霧氣流速1. 5L/min ;掃描質(zhì)量范圍50 5000。
5.如權(quán)利要求I所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(4)中的高分辨質(zhì)譜采用四級(jí)桿時(shí)間飛行串聯(lián)質(zhì)譜儀，設(shè)定參數(shù)為正離子模式噴霧電壓+5. 5kV ;負(fù)離子模式噴霧電壓-4. OkV ;簾氣壓25psi ;噴霧氣壓30psi ;掃描質(zhì)量范圍50 4000。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種低分子肝素的離子對(duì)反相色譜與高分辨質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)方法，該方法利用離子對(duì)反相色譜與高分辨質(zhì)譜進(jìn)行聯(lián)用檢測(cè)低分子肝素的各個(gè)組分，通過(guò)離子對(duì)反相色譜分離樣品中各主要組分，并通過(guò)高分辨質(zhì)譜獲得精確的分子量，計(jì)算出其糖鏈序列信息，包括兩端結(jié)構(gòu)、糖鏈長(zhǎng)度、乙?；傲蛩峄〈鷶?shù)量，從而對(duì)低分子肝素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較精細(xì)的表征。本發(fā)明對(duì)于提高肝素的檢測(cè)水平、保障藥品安全具有極大的實(shí)用價(jià)值。
文檔編號(hào)G01N30/89GK102759596SQ20121023539
公開(kāi)日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2012年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月9日
發(fā)明者李道遠(yuǎn), 王章杰, 遲連利 申請(qǐng)人:山東大學(xué)