專利名稱：一種基于固定化酶的毛細(xì)管電泳柱后檢測接口的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及毛細(xì)管電泳技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于固定化酶的毛細(xì)管電泳柱后檢測接口。
背景技術(shù)：
毛細(xì)管電泳是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種新興分離技術(shù)，其具有高效、快速、消耗量低等優(yōu)點(diǎn)，已成為近年來分析化學(xué)最活躍的研究方向之一。從技術(shù)水平來說，毛細(xì)管電泳已經(jīng)發(fā)展為不同的分離模式，從而滿足不同性質(zhì)樣品在管內(nèi)的最佳分離。常用的毛細(xì)管分離模式有毛細(xì)管區(qū)帶電泳、毛細(xì)管凝膠電泳、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜、毛細(xì)管電色譜。毛 細(xì)管的進(jìn)樣量在納升級(jí)，非常適用于微量生物樣品的分析，但同時(shí)也對(duì)檢測的靈敏度提出了更高的要求。雖然激光誘導(dǎo)熒光，質(zhì)譜等檢測技術(shù)滿足了毛細(xì)管電泳檢測的要求，但是昂貴的儀器價(jià)格和復(fù)雜的檢測程序限制了它們的應(yīng)用范圍。將具有獨(dú)特高催化效率的酶應(yīng)用到毛細(xì)管電泳中放大檢測信號(hào)提高靈敏度，已得到越來越多的關(guān)注。酶催化反應(yīng)在毛細(xì)管電泳中的應(yīng)用可分為三種模式柱前、在柱、柱后酶反應(yīng)。柱前酶反應(yīng)模式中，游離酶和固定化酶放入樣品小管中，酶催化反應(yīng)在樣品進(jìn)入毛細(xì)管前發(fā)生，毛細(xì)管只用作分離通道。這種方法酶消耗量較大，尤其是采用游離酶，酶一次性使用不能回收，造成了試劑的浪費(fèi)。在柱酶反應(yīng)模式中，酶填充到毛細(xì)管中，酶反應(yīng)和分離過程同時(shí)在毛細(xì)管中進(jìn)行。自從 1992 年，Bao 等(Bao J. ；Regnier F. E. J. Chromatogr. 1992，608，217)首次將游離酶應(yīng)用到毛細(xì)管電泳在柱酶反應(yīng)體系中，在過去20年里涌現(xiàn)了大量關(guān)于各種在柱游離酶反應(yīng)在毛細(xì)管電泳中應(yīng)用的報(bào)道。此外，酶也可以固定在毛細(xì)管柱中。例如，Tang 等(Tang Z. M. ；Kang, J. ff. Anal. Chem. 2006,78,2514)米用離子鍵合技術(shù)固定血管緊張素轉(zhuǎn)換酶在毛細(xì)管入口端篩選治療高血壓和糖尿病的藥物。Wojcik等(ffojcik, R. ； Vannatta, M. ；Dovichi, N. J. Anal. Chem. 2010,82,1564)將喊性憐酸酶固定在第一根毛細(xì)管末端設(shè)計(jì)的二維毛細(xì)管電泳，簡化了樣品在兩維間的處理。但是由于毛細(xì)管內(nèi)壁十分狹小，需要使用復(fù)雜的固定技術(shù)，并且這種在柱酶反應(yīng)技術(shù)往往不能同時(shí)滿足酶反應(yīng)和毛細(xì)管電泳分離的最佳條件，電泳時(shí)毛細(xì)管內(nèi)產(chǎn)生的焦耳熱嚴(yán)重影響了酶的活性和穩(wěn)定性。不穩(wěn)定的酶反應(yīng)產(chǎn)物(如化學(xué)發(fā)光檢測中使用的活性氧，電化學(xué)檢測中使用的自由基)，由于其反應(yīng)后易分解喪失檢測活性不能采用以上兩種模式進(jìn)行分析。同時(shí)，這兩種模式中酶反應(yīng)有關(guān)的共反應(yīng)劑和反應(yīng)產(chǎn)物增加了毛細(xì)管電泳分離的負(fù)擔(dān)。柱后酶反應(yīng)模式中，酶載入柱后反應(yīng)池中，在毛細(xì)管出口端與底物反應(yīng)立即產(chǎn)生檢測信號(hào)，避免了因不穩(wěn)定產(chǎn)物和電泳過程產(chǎn)生的弊端。但這種模式多使用游離酶，由于分離和檢測步驟帶入雜質(zhì)，酶溶液不能回收，大量游離酶的使用造成了不可避免的試劑浪費(fèi)。為了進(jìn)一步擴(kuò)展酶催化檢測在毛細(xì)管電泳中的應(yīng)用，設(shè)計(jì)了基于固定化酶的毛細(xì)管電泳柱后檢測接口
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種毛細(xì)管電泳柱后固定化酶檢測接口，解決了現(xiàn)有技術(shù)中顯著使用游離酶造成酶試劑浪費(fèi)，酶穩(wěn)定性差、活性低的問題。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的
基于固定化酶的毛細(xì)管電泳柱后檢測接口，所述檢測接口包括檢測接口蓋、透明窗片和位于檢測接口蓋和透明窗片之間的密封墊片，所述密封墊片上設(shè)有鏤空的反應(yīng)通道，所述檢測接口蓋與密封墊片之間設(shè)有蓋在所述反應(yīng)通道上的固定化酶的膜，且檢測接口蓋設(shè)有分別與反應(yīng)通道兩端相通的反應(yīng)液入口和廢液出口，所述檢測接口上還設(shè)有與所述反應(yīng)通道相通并用于插入毛細(xì)管的毛細(xì)管接口，所述毛細(xì)管接口位于反應(yīng)通道的反應(yīng)液入口端。 該檢測接口適用于柱后檢測，提高了酶的穩(wěn)定性，同時(shí)降低酶在流動(dòng)檢測體系的消耗。該檢測接口可用于各種毛細(xì)管電泳分離模式，包括毛細(xì)管區(qū)帶電泳、毛細(xì)管凝膠電泳、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜、毛細(xì)管電色譜，同時(shí)也可與各種酶反應(yīng)相關(guān)的檢測器聯(lián)用，如激光誘導(dǎo)熒光檢測器、紫外可見吸收光譜檢測器、電化學(xué)檢測器。優(yōu)選的,所述反應(yīng)通道容納的體積為2. 5 μ L 10 μ L。為了提高檢測的靈敏度，所述反應(yīng)通道為條形，且兩端呈圓弧形，能有效減少液體積存。優(yōu)選的，所述反應(yīng)通道為高為O. 01 O. 05 Cm，長為I. 5 cnT3. O cm，寬為O. 10cm O. 15 cm。優(yōu)選的，所述反應(yīng)液入口與廢液出口之間的距離與反應(yīng)通道長度一致，反應(yīng)液入口與廢液出口的直徑為O. 05 cnTO. 10 Cm。優(yōu)選的，所述檢測接口蓋的材料為聚四氟乙烯。優(yōu)選的，所述密封墊片(2)為彈性材料。更優(yōu)選的，所述彈性材料為硅膠或橡膠。優(yōu)選的，所述透明窗片為透明無色有機(jī)玻璃。本發(fā)明中，固定化酶膜可以使用常規(guī)的酶固定化技術(shù)，如交聯(lián)法和結(jié)合法等，將水溶性酶或不溶于水的酶通過化學(xué)鍵連接到天然的或合成的高分子載體上，經(jīng)化學(xué)方法處理后，固定于反應(yīng)通道上方。優(yōu)選為，固定化酶膜的制作過程如下將酶溶液滴加到醛基活化的UltraBind膜(長寬與檢測通道一致)上，酶上的氨基與UltraBind膜上的醛基形成可逆的Schiff堿，然后再滴加還原試劑使酶與UltraBind膜之間形成牢固的共價(jià)鍵，然后晾干后即可使用。本發(fā)明的有益效果(I)本發(fā)明的基于固定化酶的毛細(xì)管電泳柱后檢測接口最大程度地降低了酶在流動(dòng)檢測系統(tǒng)中的消耗，顯著增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性和活性，從而有效提高檢測靈敏度。(2)本發(fā)明設(shè)計(jì)的柱后固定化酶反應(yīng)通道體積小，最低加入體積為2. 5 yL，無稀釋效應(yīng)及死體積存在。酶反應(yīng)一經(jīng)發(fā)生就立即被檢測到，適用于不穩(wěn)定酶反應(yīng)產(chǎn)物的檢測。同時(shí)，柱后酶反應(yīng)模式避免了柱前、在柱酶反應(yīng)中焦耳熱及分離組分復(fù)雜對(duì)整個(gè)體系的影響。(3)本發(fā)明的毛細(xì)管電泳柱后固定化酶檢測接口裝置可用于毛細(xì)管電泳各種分離模式，包括毛細(xì)管區(qū)帶電泳、毛細(xì)管凝膠電泳、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜、毛細(xì)管電色譜，同時(shí)也可與各種酶反應(yīng)相關(guān)的檢測器聯(lián)用，如激光誘導(dǎo)熒光檢測器、紫外可見吸收光譜檢測器、電化學(xué)檢測器。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中
圖I為本發(fā)明的毛細(xì)管電泳柱后固定化酶檢測接口的結(jié)構(gòu)示意圖(I :檢測接口蓋，2 密封墊片，3 :透明窗片，4 :固定化酶的膜，5 :毛細(xì)管)。圖2為含本發(fā)明檢測接口的毛細(xì)管電色譜化學(xué) 發(fā)光裝置圖(6 :檢測接口，7 :微流注射泵，8 :鉬電極，9 :緩沖液蓄池，10 :廢液池，11 :光電倍增管，12 :暗盒)。圖3為本發(fā)明的檢測接口毛細(xì)管出口端酶催化的化學(xué)發(fā)光原理圖(HRP :辣根過氧化物酶；BPB :溴酚藍(lán)，I :檢測接口蓋，2 :密封墊片，3 :透明窗片，4 :固定化酶的膜，5 :毛細(xì)管)。圖4為本發(fā)明的檢測接口運(yùn)用到毛細(xì)管電色譜化學(xué)發(fā)光中檢測甘氨酸的工作曲線。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。以下將參照附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行。實(shí)施例I
基于固定化酶的毛細(xì)管電泳柱后檢測接口，如附圖I所示，包括檢測接口蓋I、透明窗片3和位于檢測接口蓋和透明窗片之間的密封墊片2，檢測接口蓋I使用聚四氟乙烯最佳，密封墊片2上設(shè)有鏤空的反應(yīng)通道，檢測接口蓋I與密封墊片2之間設(shè)有蓋在反應(yīng)通道上的固定化酶的膜4，且檢測接口蓋I設(shè)有分別與反應(yīng)通道兩端相通的反應(yīng)液入口和廢液出口，在檢測接口上還設(shè)有與所述反應(yīng)通道相通并用于插入毛細(xì)管5的毛細(xì)管接口，毛細(xì)管接口位于反應(yīng)通道的反應(yīng)液入口端。為了提高檢測的靈敏度，避免稀釋效應(yīng)及死體積存在，反應(yīng)通道設(shè)置為條形，并將條形兩端呈圓弧形，體積優(yōu)選為2. 5 μ L"10 μ L,更優(yōu)選為4. 5 μ L,反應(yīng)通道高為O. 01cnTO.05 cm，長為I. 5 cnT3. O cm，寬為O. 10 cnTO. 15 cm。進(jìn)一步，將檢測接口蓋I上的反應(yīng)液入口與廢液出口之間的距離與反應(yīng)通道的長度一致，反應(yīng)液入口與廢液出口的直徑為
O.05 cnTO. 10 cm，優(yōu)選為O. 08 cm。密封墊片具有將反應(yīng)池封閉的作用，選用彈性材料密封效果更好，硅膠或橡膠制成的密封墊片最佳。透明窗片選用透光性的材料，優(yōu)選為透明無色的有機(jī)玻璃。為了使檢測接口能夠配合現(xiàn)有的儀器使用，可以將檢測接口的大小設(shè)置與現(xiàn)有儀器匹配的尺寸。本實(shí)施例將檢測接口蓋I設(shè)置為長4. O cm，寬為2. 5 cm，厚度為O. 8cm ;透明窗片3的長為4. O cm,寬為2. 5 cm,厚度為O. 3 cm。實(shí)施例2
毛細(xì)管電色譜化學(xué)發(fā)光裝置，如圖2所示，將毛細(xì)管5與檢測接口的毛細(xì)管接口連接，以修飾了納米金的毛細(xì)管的毛細(xì)管電色譜柱為例，將長為60 cm,內(nèi)徑為75 μ m的毛細(xì)管電色譜柱一端用火燒掉O. 5 cm的聚丙酰亞胺涂層，插入檢測接口反應(yīng)通道，毛細(xì)管電色譜柱另一端放入緩沖液蓄池9中。然后將檢測接口 6置于光電倍增管11上方，并使透明窗片3的面與光電倍增管11檢測面接觸，再將檢測接口 6和光電倍增管11都置于密閉的暗盒12中，以避免外界光線的干擾。檢測接口 6的反應(yīng)液入口與微流注射泵7連接；廢液出口與廢液池10連接，將緩沖液蓄池9與廢液池10之間放入鉬電極8，整個(gè)流通系統(tǒng)中用聚四氟乙烯管接通，內(nèi)徑優(yōu)選為O. 08 cm。電泳時(shí)通過鉬電極8在毛細(xì)管電色譜柱的兩端形成電壓，由于不同物質(zhì)的帶電量不同，從而達(dá)到分離物質(zhì)的效果。實(shí)施例3
毛細(xì)管電色譜化學(xué)發(fā)光裝置檢測甘氨酸
固定化酶紙膜制備方法如下將30 μ L濃度為5. O mg/mL辣根過氧化物酶溶液滴加到醛基活化的UltraBind膜(2. 7 cm X O. 20 cm)上，在濕潤的環(huán)境下室溫放置2h，然后滴加1.0 mg/mL NaCNBH3溶液，室溫下反應(yīng)40 min后取出晾干。制作好的酶紙膜用雙面膠緊貼于聚四氟乙烯蓋內(nèi)側(cè)中心。毛細(xì)管電色譜柱固定于酶紙膜下方，毛細(xì)管出口伸入反應(yīng)通道
O.5 cm ;各部分通過螺絲緊緊固定在一起，形成一個(gè)約為4. 5 μ L的反應(yīng)通道。檢測時(shí)，將光電倍增管的工作電壓設(shè)置為-800 V，微流注射泵以20 μ L/min的流速將含6. 2 μ M溴酚藍(lán)的磷酸緩沖液(12 mM,pH 9. O)導(dǎo)入到反應(yīng)通道中，作為固定化酶反應(yīng)的共反應(yīng)劑。含O. 75 mM過氧化氫的磷酸緩沖液(5. O mM,pH 8. 5)作為毛細(xì)管分離緩沖液，盛入緩沖液蓄池9，通過12 KV的電壓差產(chǎn)生的電泳驅(qū)動(dòng)力進(jìn)入毛細(xì)管中。待化學(xué)發(fā)光信號(hào)基線穩(wěn)定后，通過20 cm高度差的重力驅(qū)動(dòng)進(jìn)樣15 s完成毛細(xì)管進(jìn)樣。在反應(yīng)通道入口處，甘氨酸和含過氧化氫的磷酸緩沖液從毛細(xì)管柱中流出與共反應(yīng)劑反應(yīng)，在固定化辣根過氧化物酶的催化下產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)，其檢測原理如附圖3所示。光信號(hào)一經(jīng)發(fā)射就能立即被光電倍增管11捕捉到，并將其轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。樣品預(yù)處理甘氨酸本身不能發(fā)生化學(xué)發(fā)光，檢測中采用乙二胺催化法使用#-(4-氨基丁基)-Λ/-乙基異魯米諾衍生甘氨酸，使甘氨酸分子帶上化學(xué)發(fā)光屬性基團(tuán)。具體步驟為(I)將200 μ L O. 50 mM的N- (4-氨基丁基)-N-乙基異魯米諾加入到同體積的
O.50 mM的％ 二琥珀酰亞胺基碳酸酯溶液中，混合溶液經(jīng)渦流混合后于室溫下反應(yīng)2小時(shí)。(2)將100 μ L甲醇溶解的樣品與20 yL的O. 15Μ乙二胺甲醇溶液一起加入到步驟
(I)反應(yīng)得到的溶液中，同樣經(jīng)渦流混合后于室溫下再反應(yīng)2小時(shí)，得檢測樣品。然后將檢測樣品用水稀釋10倍后按上述的方法重力進(jìn)樣。在上述實(shí)驗(yàn)方法和條件下，測定了濃度為O. 5 μ MU μ MUO μΜ、30 μΜ、50 μ Μ、100 μΜ和200 μ M的甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，甘氨酸濃度在O. 5μ Μ^200 μ M范圍內(nèi)與化學(xué)發(fā)光峰高呈良好的線性關(guān)系，擬合線性回歸方程為J (a. u.)=66.15 C (μ Μ) + 812.84 {if = O. 9921)，J代表化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，C代表甘氨酸的濃度，其檢測限(S/N=3)為O. 12 μ M0連續(xù)五次檢測50 μ M甘氨酸，甘氨酸的遷移時(shí)間和出峰強(qiáng)度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為7. 5%和5. 4%，顯示了該方法良好的重復(fù)性。最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.基于固定化酶的毛細(xì)管電泳柱后檢測接ロ，其特征在于所述檢測接ロ包括檢測接ロ蓋(I)、透明窗片(3)和位于檢測接ロ蓋和透明窗片之間的密封墊片(2)，所述密封墊片上設(shè)有鏤空的反應(yīng)通道，所述檢測接ロ蓋(I)與密封墊片(2)之間設(shè)有蓋在所述反應(yīng)通道上的固定化酶的膜(4)，且檢測接ロ蓋(I)設(shè)有分別與反應(yīng)通道兩端相通的反應(yīng)液入口和廢液出口，所述檢測接ロ上還設(shè)有與所述反應(yīng)通道相通并用于插入毛細(xì)管的毛細(xì)管接ロ，所述毛細(xì)管接ロ位于反應(yīng)通道的反應(yīng)液入口端。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述基于固定化酶的毛細(xì)管電泳柱后檢測接ロ，其特征在于所述反應(yīng)通道容納的體積為2. 5 μ L^lO μし
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述基于固定化酶的毛細(xì)管電泳柱后檢測接ロ，其特征在于所述反應(yīng)通道為條形且兩端呈圓弧形。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述基于固定化酶的毛細(xì)管電泳柱后檢測接ロ，其特征在于所述反應(yīng)通道為高為 O. 01 O. 05 Cm,長為 I. 5 cnT3. 0cm,寬為 O. 10 cnT O. 15 cm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任ー項(xiàng)所述基于固定化酶的毛細(xì)管電泳柱后檢測接ロ，其特征在干所述反應(yīng)液入口與廢液出口之間的距離與反應(yīng)通道的長度相等，所述反應(yīng)液入口與廢液出口的直徑為O. 05 cnTO. 10 cm。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述基于固定化酶的毛細(xì)管電泳柱后檢測接ロ，其特征在于所述檢測接ロ蓋(I)的材料為聚四氟こ烯。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述基于固定化酶的毛細(xì)管電泳柱后檢測接ロ，其特征在于所述密封墊片(2)為彈性材料。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述基于固定化酶的毛細(xì)管電泳柱后檢測接ロ，其特征在于所述彈性材料為硅膠或橡膠。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述基于固定化酶的毛細(xì)管電泳柱后檢測接ロ，其特征在于所述透明窗片(3)為透明無色有機(jī)玻璃。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于固定化酶的毛細(xì)管電泳柱后檢測接口，包括檢測接口蓋、透明窗片和位于檢測接口蓋和透明窗片之間的密封墊片，所述密封墊片上設(shè)有鏤空的反應(yīng)通道，所述檢測接口蓋與密封墊片之間設(shè)有蓋在所述反應(yīng)通道上的固定化酶的膜，且檢測接口蓋設(shè)有分別與反應(yīng)通道兩端相通的反應(yīng)液入口和廢液出口，所述檢測接口上還設(shè)有與所述反應(yīng)通道相通并用于插入毛細(xì)管的毛細(xì)管接口，所述毛細(xì)管接口位于反應(yīng)通道的反應(yīng)液入口，該檢測接口能顯著減少酶的用量，提高酶的穩(wěn)定性和活性，能有效防止反應(yīng)通道中死體積和稀釋效應(yīng)的產(chǎn)生，提高檢測靈敏度，為固定化酶的毛細(xì)管電泳柱后檢測提供了一個(gè)理想的檢測接口，可用于酶催化反應(yīng)的毛細(xì)管電泳柱后檢測。
文檔編號(hào)G01N27/447GK102866195SQ201210348410
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月19日
發(fā)明者付志鋒, 謝皓玥 申請(qǐng)人:西南大學(xué)